HPLC-PDA를 이용한 국내 유통 농산물 중 ametoctradin 잔류량 분석법 개발 및 검증 Development and Validation of an Analytical Method for Ametoctradin Residue Determination in Domestic Agricultural Commodities by HPLC-PDA원문보기
Ametoctradin은 triazolopyrimidine계에 속하는 살균제로 역병탄저병을 예방하는 약제이다. 증기압은 $2.1{\times}10^{-10}$ Pa ($20^{\circ}C$)으로 매우 낮아 분석을 위한 기기로 LC를 선택하였으며, HPLC-PDA기기를 사용하여 210 nm에서 400 nm까지 스캔한 결과, 최대흡광파장을 292 nm으로 확인하고 이를 분석파장으로 선택하였다. 추출용매는 물질의 용해도를 고려하여 methanol로 선정하였으며, 액-액 분배 및 정제과정에서는 약제의 n-octanol/water 분배계수($logP_{ow}$, $25^{\circ}C$)가 4.40 (pH 7, $20^{\circ}C$)의 비극성의 물리화학적 특징을 가짐을 고려하여 액-액 분배 단계에서는 dichloromethane, 정제 단계에서는 acetone/hexane (30/70, v/v)을 분석을 위한 용매로 사용하였다. 특히, 컬럼 충진제로 유지, 색소의 비용출성이 우수하고 극성의 물질을 넓은 범위에서 흡착하는 특성을 가지는 florisil을 선택하여 약제에 대한 선택성을 높일 수 있었다. 본 분석법은 회수율 측정(71.9-112.6%)을 통해 코덱스 가이드라인(CAC/GL 40)인 회수율 70-120%, 분석오차 10 미만에 적합함을 보여주어 분석법의 정확성을 확인하였으며, LC-MS를 통한 재확인 과정을 수행함으로써 시험법의 신뢰성과 선택성을 확보할 수 있었다. 또한 재현성을 위해 실험실간 검증을 실시하였으며 그 결과, RSDR(%)는 >0.01 mg/kg, ${\leq}0.1\;mg/kg$범위에서 3.02-14.63%, >0.1 mg/kg범위에서 1.27-7.67%로 코덱스 가이드라인 기준에 적합한 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서 개발한 시험법은 농산물에 잔류하는 ametoctradin을 분석하기 위한 공정 시험법으로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
Ametoctradin은 triazolopyrimidine계에 속하는 살균제로 역병탄저병을 예방하는 약제이다. 증기압은 $2.1{\times}10^{-10}$ Pa ($20^{\circ}C$)으로 매우 낮아 분석을 위한 기기로 LC를 선택하였으며, HPLC-PDA기기를 사용하여 210 nm에서 400 nm까지 스캔한 결과, 최대흡광파장을 292 nm으로 확인하고 이를 분석파장으로 선택하였다. 추출용매는 물질의 용해도를 고려하여 methanol로 선정하였으며, 액-액 분배 및 정제과정에서는 약제의 n-octanol/water 분배계수($logP_{ow}$, $25^{\circ}C$)가 4.40 (pH 7, $20^{\circ}C$)의 비극성의 물리화학적 특징을 가짐을 고려하여 액-액 분배 단계에서는 dichloromethane, 정제 단계에서는 acetone/hexane (30/70, v/v)을 분석을 위한 용매로 사용하였다. 특히, 컬럼 충진제로 유지, 색소의 비용출성이 우수하고 극성의 물질을 넓은 범위에서 흡착하는 특성을 가지는 florisil을 선택하여 약제에 대한 선택성을 높일 수 있었다. 본 분석법은 회수율 측정(71.9-112.6%)을 통해 코덱스 가이드라인(CAC/GL 40)인 회수율 70-120%, 분석오차 10 미만에 적합함을 보여주어 분석법의 정확성을 확인하였으며, LC-MS를 통한 재확인 과정을 수행함으로써 시험법의 신뢰성과 선택성을 확보할 수 있었다. 또한 재현성을 위해 실험실간 검증을 실시하였으며 그 결과, RSDR(%)는 >0.01 mg/kg, ${\leq}0.1\;mg/kg$범위에서 3.02-14.63%, >0.1 mg/kg범위에서 1.27-7.67%로 코덱스 가이드라인 기준에 적합한 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서 개발한 시험법은 농산물에 잔류하는 ametoctradin을 분석하기 위한 공정 시험법으로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
This study was carried out to validate the safety of ametoctradin residues in agricultural commodities by developing an official analysis method. An analytical method was developed and validated using HPLC-PDA detectors. The samples were extracted with methanol, subsequently partitioned with dichlor...
This study was carried out to validate the safety of ametoctradin residues in agricultural commodities by developing an official analysis method. An analytical method was developed and validated using HPLC-PDA detectors. The samples were extracted with methanol, subsequently partitioned with dichloromethane and purified with florisil column chromatograph using acetone/hexane (30/70, v/v) as solvent. The method was validated by using grape, hulled rice, mandarin, and potato spiked with ametoctradin at 0.05 and 5.0 mg/kg, and pepper at 0.05 and 2.0 mg/kg. Average recoveries were 76-114.8% with relative standard deviation less than 10%, and the limit of detection and limit of quantification were 0.0125 and 0.05 mg/kg, respectively. The result of recoveries and overall coefficient of variation of the laboratory results from Gwangju regional Food and Drug Administration (FDA) and Daejeon regional FDA was accorded with Codex Alimentarius Commission Guideline (CAC/GL 40). Based on these results, this method was found to be appropriate for ametoctradin residue determination and can be used as the official method of analysis.
This study was carried out to validate the safety of ametoctradin residues in agricultural commodities by developing an official analysis method. An analytical method was developed and validated using HPLC-PDA detectors. The samples were extracted with methanol, subsequently partitioned with dichloromethane and purified with florisil column chromatograph using acetone/hexane (30/70, v/v) as solvent. The method was validated by using grape, hulled rice, mandarin, and potato spiked with ametoctradin at 0.05 and 5.0 mg/kg, and pepper at 0.05 and 2.0 mg/kg. Average recoveries were 76-114.8% with relative standard deviation less than 10%, and the limit of detection and limit of quantification were 0.0125 and 0.05 mg/kg, respectively. The result of recoveries and overall coefficient of variation of the laboratory results from Gwangju regional Food and Drug Administration (FDA) and Daejeon regional FDA was accorded with Codex Alimentarius Commission Guideline (CAC/GL 40). Based on these results, this method was found to be appropriate for ametoctradin residue determination and can be used as the official method of analysis.
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문제 정의
또한 분석시료에 처리된 ametoctradin의 최적 추출효율을 확인하기 위해서는 matrix가 추출효율에 미치는 영향도 염두해 두어야 한다(8). 따라서 본 연구에서는 ametoctradin의 용매에 대한 용해 도와 극성 정도(LogPow ; 4.4, pH 7, 20℃)를 확인하고 추출효율을 비교한 결과 methanol을 분석을 위한 최적 추출용매로 선정하였다. 액-액 분배과정에서는 ametoctradin이 비극성인 특성을 가지기 때문에 dichloromethane을 첨가하여 분석 성분을 비극성용매인 dichloromethane 층으로 이동시켜 극성의 간섭물질을 효과적으로 제거하였다.
단일 실험실에서 선택성, 정확성 및 효율성을 확보한 후 시험 법에 대한 재현성을 확인하기 위해서는 분석법을 개발한 실험실 이외의 기관에서의 분석법 검증이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 광주지방식품의약품안전청과 대전지방식품의약품안전청에 동일한 SOP(Standard Operation procedure)를 제공하고 동일한 조건에서 분석을 진행하여 실험실간 검증을 실시하였다. 코덱스 가이드라인(CAC/GL 40)에서 제공하는 실험실간 편차(RSDR; Relative Standard Deviation on Reproducibility)는 >0.
5 mg/kg의 잔류허용기준이 설정되어 있다. 따라서 본 연구에서는 국내 생산 및 향후 수입되는 농산물 중 잔류할 수 있는 ametoctradin에 대한 안전을 확보하기 위해 잔류량을 신속, 정확하게 측정할 수 있는 공정 분석법을 개발하게 되었다. Ametoctradin의 분자식은 C15H25N5, 분자구조는 Fig.
제안 방법
정제는 액-액 단계에 이어 간섭물질을 제거하기 위한 과정이며, 이 과정에서의 용매의 선택에서는 분석 성분에 대한 더 높은 선택성을 요구한다. 본 분석법에서는 컬럼 충진제로 유지, 색소의 비용출성이 우수하고 극성의 물질을 넓은 범위에서 흡착하는 특성을 가지는 florisil을 선택하였으며, 이러한 특성을 통해 matrix에서 문제가 되는 간섭물질과 극성물질을 효과적으로 제거할 수 있었다. 이와 같이 각 단계별로 분석 성분에 대한 특성을 파악함으로써 추출 및 정제조건을 확립할 수 있었다(Fig.
분석결과를 수치화할 수 있는 최저한계를 의미하는 정량한계는 각국 및 기관에 따라 보통 S/N가 6-10 범위의 화합물의 양을 나타내며 국내 정량한계 범위는 국제기준을 수용하고 있어(9) 일반적으로 10을 적용하는 것을 보편적으로 사용하고 있다. 본 연구에서 개발한 ametoctradin의 신규 시험법이 기준에 적합한지 확인하기 위해 검출한계(LOD, limit of detection)와 정량한계(LOQ, limit of quantitation)를 구하였다. 본 연구에서 확립한 분석조건에서 검출한계는 0.
본 연구에서 개발한 시험법에 대한 실험실간 검증을 하기위해 시험법 확립 후 작성한 SOP (standard operation procedure)를 광주지방식품의약품안전청과 대전지방식품의약품안전청에 각각 제공하고 동일한 조건과 과정으로 분석을 실시하였다.
회수율 측정은 분석법의 정확성, 재현성 및 효율성 등을 판단하기 위한 과정이다. 본 연구에서는 개발한 ametoctradin 분석법의 적합성을 평가하기 위해 국내 잔류허용기준이 각각 5.0, 2.0mg/kg으로 신설 고시된 포도, 고추를 포함하여 농산물 대표 시료인 곡류 중 현미, 과일류 중 감귤, 서류 중 감자에 대해 각각 무처리군과 ametoctradin 표준용액 0.05, 0.5, 5.0 mg/kg(포도, 현미, 감귤, 감자), 0.05, 0.2, 2.0 m/kg(고추)로 처리하여 이에 대한 회수율 실험을 수행하였으며, 분석법의 정확성을 확인하기 위해 각시료 및 농도에 대해 3반복하여 실시하였다. 무처리군에서 ametoctradin과 동일한 머무름 시간을 갖는 간섭물질이 존재하지 않고 안정적인 peak를 보임으로써(Fig.
본 연구의 기기분석조건은 Table 1에 나타내었다. 분석법의 신뢰성을 확보를 위해 LC-MS (liquid chromatograph-mass spectrometer)를 이용하여 재확인 과정을 수행하였으며, 이를 위한 기기분석조건은 Table 2에 나타내었다.
4, pH 7, 20℃)를 확인하고 추출효율을 비교한 결과 methanol을 분석을 위한 최적 추출용매로 선정하였다. 액-액 분배과정에서는 ametoctradin이 비극성인 특성을 가지기 때문에 dichloromethane을 첨가하여 분석 성분을 비극성용매인 dichloromethane 층으로 이동시켜 극성의 간섭물질을 효과적으로 제거하였다. 정제는 액-액 단계에 이어 간섭물질을 제거하기 위한 과정이며, 이 과정에서의 용매의 선택에서는 분석 성분에 대한 더 높은 선택성을 요구한다.
이에 HPLCPDA를 이용하여 ametoctrdin 표준용액 1 µg/mL를 210nm에서 400nm 범위에서 스캔한 결과, 292nm을 최적흡수파장으로 확인하였으며(Fig. 2) 이를 분석을 위한 파장으로 선택하였다.
감압농축 플라스크에 받은 용매를 40℃ 이하 수욕 상에서 완전히 농축한 후 잔류물을 acetone/hexane (30/70, v/v) 용액 10mL로 용해하였다. 정제과정은 지름 11 mm, 길이 400 mm의 유리컬럼관에 florisil 5 g을 채운 후 그 위에 2cm 높이로 sodium sulfate anhydrous를 건식 충진하고 hexane 50mL를 가하여 유출시켜 버렸다. 고정상 상단이 노출되기 직전에 추출과정에서 얻은 acetone/hexane 용액(30/70, v/v) 10mL을 컬럼관에 통과하여 유출시키고, acetone/hexane 혼합액(10/90, v/v) 50mL를 가하여 유출시켰다.
증기압은 2.1×10−10 Pa (20℃)으로 매우 낮아 분석을 위한 기기로 LC를 선택하였으며, HPLC-PDA기기를 사용하여 210nm에서 400nm까지 스캔한 결과, 최대흡광파장을 292nm으로 확인하고 이를 분석파장으로 선택하였다.
표준원액은 ametoctradin 10.03 mg을 methanol 20mL에 용해하여, 500 µg/mL (500 ppm)으로 제조하여 갈색병에 담아 4℃에 보관하 였고, 이를 methanol로 희석하여 0.1 0.5, 1.0, 5.0, 10.0 µg/mL의 표준용액을 제조하여 실험에 사용하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Florisil은 Fluka (St. Louis, MO, USA)로부터, sodium sulfate anhydrous, sodium chloride는 Wako (Osaka, Japan)로부터 구입하여 사용하였다. 검체는 국내 유통 중인 고추, 포도, 감귤, 감자, 현미를 구입하여 균질화한 후 −50℃에 보관하여 사용하였다.
검체는 국내 유통 중인 고추, 포도, 감귤, 감자, 현미를 구입하여 균질화한 후 −50℃에 보관하여 사용하였다.
1×10−10 Pa (20℃)으로 매우 낮아 분석을 위한 기기로 LC를 선택하였으며, HPLC-PDA기기를 사용하여 210nm에서 400nm까지 스캔한 결과, 최대흡광파장을 292nm으로 확인하고 이를 분석파장으로 선택하였다. 추출 용매는 물질의 용해도를 고려하여 methanol로 선정하였으며, 액-액 분배 및 정제과정에서는 약제의 n-octanol/water 분배계수(logPow, 25℃)가 4.40 (pH 7, 20℃)의 비극성의 물리화학적 특징을 가짐을 고려하여 액-액 분배 단계에서는 dichloromethane, 정제 단계에서는 acetone/hexane (30/70, v/v)을 분석을 위한 용매로 사용하였다. 특히, 컬럼 충진제로 유지, 색소의 비용출성이 우수하고 극성의 물질을 넓은 범위에서 흡착하는 특성을 가지는 florisil을 선택하여 약제에 대한 선택성을 높일 수 있었다.
성능/효과
Methanol로 희석하여 제조한 0.1, 0.5, 1.0, 5.0 및 10.0 µg/mL의표준용액을 위에서 제시한 HPLC 분석조건으로 측정한 결과, 표준곡선의 상관계수(R2)는 0.9999로 우수한 직선성을 보였다(Fig. 4, 5).
ametoctradin 분석을 위한 기기를 선정하기 위해 증기압, 분자량 등의 물리화학적 특성을 고려하였으며, 특히 증기압이 2.1×10−10Pa로 낮아 HPLC가 적합할 것으로 판단하였다.
검증 결과(Fig.8,9), 74.3-92.6%(광주청), 70.3-92.6%(대전청)의 회수율과 10% 미만의 분석오차를 보였으며(Table 5), 본 연구에서의 회수율 결과와 광주청 및 대전청에서의 결과에 대한 RSDR(%)는 >0.01 mg/kg, ≤0.1 mg/kg범위에서 3.02-14.63%, >0.1 mg/kg범위에서 1.27-7.67%로 코덱스 가이드라인 기준에 적합한 것으로 나타나 ametoctradin 분석을 위해 개발한 시험법을 재현성을 확인하는 동시에 공정 분석법으로의 활용가능성도 보여주었다.
또한 재현성을 위해 실험실간 검증을 실시하였으며 그 결과, RSDR(%)는 >0.01 mg/kg, ≤0.1 mg/kg 범위에서 3.02-14.63%, >0.1 mg/kg 범위에서 1.27-7.67%로 코덱스 가이드라인 기준에 적합한 것으로 나타났다.
0 m/kg(고추)로 처리하여 이에 대한 회수율 실험을 수행하였으며, 분석법의 정확성을 확인하기 위해 각시료 및 농도에 대해 3반복하여 실시하였다. 무처리군에서 ametoctradin과 동일한 머무름 시간을 갖는 간섭물질이 존재하지 않고 안정적인 peak를 보임으로써(Fig. 6) 개발한 시험법이 우수한 분리능과 선택성을 가지는 것으로 판단되며, 따라서 확립한 추출 및 정제조건의 높은 효율성과 적합성을 확인할 수 있었다. 측정 결과, 71.
특히, 컬럼 충진제로 유지, 색소의 비용출성이 우수하고 극성의 물질을 넓은 범위에서 흡착하는 특성을 가지는 florisil을 선택하여 약제에 대한 선택성을 높일 수 있었다. 본 분석법은 회수율 측정(71.9-112.6%)을 통해 코덱스 가이드라인(CAC/GL 40)인회수율 70-120%, 분석오차 10 미만에 적합함을 보여주어 분석법의 정확성을 확인하였으며, LC-MS를 통한 재확인 과정을 수행함으로써 시험법의 신뢰성과 선택성을 확보할 수 있었다. 또한 재현성을 위해 실험실간 검증을 실시하였으며 그 결과, RSDR(%)는 >0.
본 연구에서 개발한 ametoctradin의 신규 시험법이 기준에 적합한지 확인하기 위해 검출한계(LOD, limit of detection)와 정량한계(LOQ, limit of quantitation)를 구하였다. 본 연구에서 확립한 분석조건에서 검출한계는 0.0125 mg/kg으로 나타났으며, 정량한계는 최소검출량이 0.05 mg/kg으로 나타났다. 현재 식품공전 중의 잔류농약 시험법은 해당 농약 MRL의 1/2 이하의 농도이거나 0.
6분대었고 positive조건에서 측정되었으며, 특성이온의 m/z값은 Table 4에서 나타내었다. 분석법 검증 대상 품목인 포도, 고추, 현미, 감귤 및 감자의 모든 시료에 대해 LC-MS로 분석한 결과, 물질에 대한 우수한 선택성을 확인함으로써 본 연구에서 개발한 분석법에 대한 높은 신뢰성과 정확성을 확보할 수 있었다.
2) 이를 분석을 위한 파장으로 선택하였다. 이동상으로는 증류수와 acetonitrile을 사용하였으며 isocratic 조건에서 이동상 비율을 조절하여 측정한 결과, 30/70(v/v) 비율에서 가장 우수한 효율을 보였다.
측정 결과, 71.9-112.6% 범위의 회수율과 10% 미만의 분석오차를 나타냄으로써(Table 3) 코덱스 가이드라인(CAC/GL 40)인 회수율 70-120%, 분석오차 10 미만에 적합함을 보여주었으며(10-12), 이를 통해 amectoctradin에 대한 본 분석법의 적합성을 확인할 수 있었다.
40 (pH 7, 20℃)의 비극성의 물리화학적 특징을 가짐을 고려하여 액-액 분배 단계에서는 dichloromethane, 정제 단계에서는 acetone/hexane (30/70, v/v)을 분석을 위한 용매로 사용하였다. 특히, 컬럼 충진제로 유지, 색소의 비용출성이 우수하고 극성의 물질을 넓은 범위에서 흡착하는 특성을 가지는 florisil을 선택하여 약제에 대한 선택성을 높일 수 있었다. 본 분석법은 회수율 측정(71.
후속연구
40 (pH 7, 20℃)의 물리ㆍ화학적 특징을 가진다. Ametoctradin 분석법 개발은 이러한 물리ㆍ화학적 특성을 고려하여 개발되었으므로, 빠르고 정확한 잔류량 검사법을 제공하여 국내 유통 농산물의 안전성을 확보하는데 기여할 것이다.
67%로 코덱스 가이드라인 기준에 적합한 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서 개발한 시험법은 농산물에 잔류하는 ametoctradin을 분석하기 위한 공정 시험법으로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Ametoctradin 살균제는 국내에서 언제 등록되었는가?
Ametoctradin은 국내에서는 2012년에 신규 등록되어, 식품의약품 안전청에서 포도, 고추 작물에 대해 각각 5.0, 2.
Ametoctradin은 어떤 약제인가?
Ametoctradin은 triazolopyrimidine계에 속하는 살균제로 역병탄저병을 예방하는 약제이다. 증기압은 $2.
Ametoctradin 살균제의 EU 기준은?
0 mg/kg로 국내 잔류허용기준을 신설고시하였으며(제2012-1호), 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission, Codex) 기준은 아직 설정되지 않았다. 국외의 경우 EU(유럽연합)는 고추에 대해 2.0 mg/kg, 미국은 1.5 mg/kg의 잔류허용기준이 설정되어 있다. 따라서 본 연구에서는 국내 생산 및 향후 수입되는 농산물 중 잔류할 수 있는 ametoctradin에 대한 안전을 확보하기 위해 잔류량을 신속, 정확하게 측정할 수 있는 공정 분석법을 개발하게 되었다.
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