[논문]천식동물모델을 이용한 지골피(地骨皮), 상백피(桑白皮) 및 두 배합약물의 실험적 연구

서창우; 이영철; 이장천

doi:10.14374/hfs.2013.21.1.036

천식동물모델을 이용한 지골피(地骨皮), 상백피(桑白皮) 및 두 배합약물의 실험적 연구
The Effects of Lycium chinese Mill., Morus alba L. and Their Combination on the Asthmatic Murine Model 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.21 no.1, 2013년, pp.36 - 50

서창우 (상지대학교 한의과대학) , 이영철 (상지대학교 한의과대학) , 이장천 (부산대학교 한의학전문대학원)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : To clarify the possible effect of Lycium chinese Mill (LC)., Morus alba L (MA)., and Lycium chinese Mill. +Morus alba L. (LC+MA), we have examined their influence on the development of pulmonary eosinophilic inflammation in the asthmatic murine model. Methods : Female Balb/c mice (5weeks) were immunized on two different days (21 days and 7 days before inhalational exposure) by intraperitonial injections of 0.2ml alum-precipitated Ag containing $100{\mu}g$ of OVA bound to 4 mg of aluminum hydroxide in PBS. Seven days after the second sensitization, mice were exposed to aerosolized ovalbumin for 30 minutes/day on 3 days/week for 8 weeks (at a flow rate of 250 L/min, 2.5% ovalbumin in normal saline) and, LC, MA, and LC+MA (500 mg/kg) were orally administered 3 times per a week for 8 weeks. Results : The suppressive effect of LC, MA, and LC+MA were demonstrated by the accumulation of eosinophills into airways, with the reduction of eosinophil, total lung leukocytes numbers. These were correlated with the marked reduction of IL-5, IL-13 and IL-4 levels in the BALF and serum. OVA-specific IgE levels were also decreased in serum and BAL from these mice. LC, MA, and LC+MA decreased eosinophil CCR3 expression and CD11b expression in lung cells. Conclusions : These results indicate that LC, MA, and LC+MA have high inhibitory effects on airway inflammation and hyper-responsiveness in the asthmatic murine model. The suppression of IL-5, IgE, eosinophil CCR3 expression and CD11b expression, and the increase of IFN-${\gamma}$ production in BALF seem to contribute to this effect. Hence, the results indicated that LC, MA, and LC+MA could act as a immuno-modulator which possesses anti-inflammatory and anti-asthmatic property by modulating the imbalance between Th1 and Th2 cytokines.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 천식환자에 사용되는 많은 처방과 약물 중에 주로 實證性喘息에 효과가 좋은 地骨皮(root cortex of Lycium chinese Mill. : LC)와 桑白皮(cortex of Morus alba L. : MA)가 천식억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여 동물모델인 생쥐로 면역학적 실험을 통하여 그 결과를 관찰한것이다.
이에 저자는 地骨皮, 桑白皮 및 두 배합약물의 천식 억제효과를 알아보기 위하여, Balb/c 생쥐에 ovalbumin으로 천식을 유발한 후 폐 및 기관지폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid)에 존재하는 총 폐세포수, 총 백혈구수, 총 호산구수, 비장과 DLN(draining lymph node)내의 총 세포수와 그리고 유세포 형광염색한 폐조직내 CD3, CD19, CD3/CD69, CD4, CD8, CD3-/CCR3+, CD3+/NK1.1+와BALF내의CD3,CD19, CD3+/CD69+, CD3-/CCR3+, B220/IgE+와 ELISA분석에서 BALF내의 IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, Eotaxin, IgE 그리고 혈청 내의 IgE와 histamine 유출량의 변화와 마지막으로 H&E, M-T 두가지 염색법으로 폐세포조직을 분석하면서 모든 실험결과를 관찰한 후 유의성 있는 효능을 확인할 수 있었기에 보고하는 바이다.

제안 방법

8주 후 기도저항을 측정한 뒤, 생쥐의 눈에서 혈액을 분리하고 BALF로부터 세포를 분리하기 위해 목부분을 해부하여 10% FBS/DMEM 배양액 1ml을 넣은 주사기를 기관(trachea)에 주입시키고 끈으로 묶어 고정한 후 3회 순환시켜 분리하였다. ACK 용액을 37℃에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고 배지로 세척한 뒤 0.
8주 후 기도저항을 측정한 뒤, 생쥐의 눈에서 혈액을 분리하고 BALF로부터 세포를 분리하기 위해 목부분을 해부하여 10% FBS/DMEM 배양액 1ml을 넣은 주사기를 기관(trachea)에 주입시키고 끈으로 묶어 고정한 후 3회 순환시켜 분리하였다. ACK 용액을 37℃에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고 배지로 세척한 뒤 0.04% trypan blue로 염색하여 세포수를 측정하였다.
Effect of LC, MA and LC+MA on histology of lung tissue (H&E and M-T staininig) in murine model of OVA- indued asthma lung cells. Balb/c mice were injected, inhaled and sprayed with OVA 3days/week for 8 weeks for asthma induction. One experimental group was treated with extract of LC, MA and LC+MA for the later 8 weeks.
Effect of LC, MA and LC+MA on lung weight (A), total lung cells (B), Leucocytes(C), and Eosinophiles (D) in BALF in OVA-induced asthma mice. Balb/c mice were injected, inhaled and sprayed with OVA three times a week for 8 weeks for asthma induction. One experimental group was treated with extract of LC, MA and LC+MA for the later 8 weeks.
OVA로 전신감작 시킨 후 21일째부터 地骨皮(500 mg/kg), 상백피(500 mg/kg) 및 두 배합약물의 추출물 (500 mg/kg)을 일주일에 5회 경구 투여하였다. 대조군에는 생리식염수를 동량 경구 투여하였다.
地骨皮, 桑白皮 및 두 배합약물을 각각 200g에 각각 증류수 2,000 ㎖를 가한 뒤 열탕 추출기(대웅, Korea)로 3시간 추출하여 얻은 액을 흡입여과하여 이를 감압증류장치 (rotary vaccum evaporator, BUCHI B-480, Switzerland)로 농축하고, 다시 동결 건조기 (freeze dryer, EYELAFDU-540, Japan)를 이용하여 완전건조한 시료 26, 24, 25g을 냉동 (-84℃) 보관하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.
이 슬라이드로부터 세포의 모양과 염색특징 등으로 면역세포의 type을 결정한 뒤 광학현미경(400×, Nikon, japan)으로 관찰하여 infiltration된 호산구 수를 측정하였다. 다시 폐를 적출하여 무게를 측정한 후 폐조직을 잘게 절편하고 2% 우태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)이 포함된 RPMI 1640 배지에 1 mg/ml의 collagenase IV를 가한 용액 3 ml로 37℃, shaking 배양기에서 30분 동안 5회 이상 조직을 분해 (digestion) 하여 폐세포를 분리한 뒤 cell strainer (FALCON)로 조직이나 불순물을 제거한 뒤 세포수를 측정하였다.
실험동물은 정상군, 대조군, 실험군으로 나누고, 각군은 5마리씩을 배정하였다. 대조군과 실험군은 난알부민으로 천식을 유도하였고, 정상군은 PBS 만을 처리하였다.
OVA로 전신감작 시킨 후 21일째부터 地骨皮(500 mg/kg), 상백피(500 mg/kg) 및 두 배합약물의 추출물 (500 mg/kg)을 일주일에 5회 경구 투여하였다. 대조군에는 생리식염수를 동량 경구 투여하였다. 또한 양성대조군으로 1주일에 3회 cyclosporin A (CsA, 20 mg/kg)를 8주간 복강주사 하였다.
대조군에는 생리식염수를 동량 경구 투여하였다. 또한 양성대조군으로 1주일에 3회 cyclosporin A (CsA, 20 mg/kg)를 8주간 복강주사 하였다.
본 실험연구는 地骨皮, 桑白皮 및 두 배합약물을 OVA로 감작된 천식동물모델에서의 항 천식 효과를 알아보기 위해, Balb/c 생쥐에 ovalbumin으로 천식을 유발한 후 폐및 기관지폐포세척액에 존재하는 총 폐세포수, 총 백혈구수, 총 호산구수와 유세포 형광염색한 폐조직내 CD3+, CD19+, CD3+/CD69+, CD4+, CD8+, CD3-/CCR3+, CD3+/NK1.1+와BALF내의CD3+, CD19+, CD3+/CD69+, CD3-/CCR3+, B220/IgE+ 분석과 그리고 ELISA 분석에서 BALF내의 IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, Eotaxin, IgE 그리고 혈청내의 IgE와 histamine 유출량의 변화와 H&E, M-T 두가지 염색방법으로 폐세포조직을 분석하면서 모든 결과를 관찰한 후 다음과 같은 결론을 얻었다.
생쥐에서 분리한 폐포세척액에서 IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, Eotaxin과 혈청에서 IgE, Histamine의 양을 축정하기위해 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, Endogen, USA) 와 IL-13는 ELISA kit (R&D system)로 생산량을 측정한다.
실험동물은 雌性인 5주령의 Balb/c 생쥐 30수를 (주)대한바이오링크(대한민국충북 음성)에서 공급받아 실험 당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료)와 물을 충분히 공급하고, 실온 22±2℃를 유지하여 2주간 실험실환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험동물은 정상군, 대조군, 실험군으로 나누고, 각군은 5마리씩을 배정하였다. 대조군과 실험군은 난알부민으로 천식을 유도하였고, 정상군은 PBS 만을 처리하였다.
이 슬라이드로부터 세포의 모양과 염색특징 등으로 면역세포의 type을 결정한 뒤 광학현미경(400×, Nikon, japan)으로 관찰하여 infiltration된 호산구 수를 측정하였다.
4)으로 1회 세척하였다. 이를 FITC (fluoresceinated isothiocyanate) 또는 PE (phycoerythrin) 형광물질이 결합된 CD3, CD4, CD8, CD69, CD11b, Gr-1등의 항체를 시료에 가하여 4℃에서 40분간 반응시키고 염색 완충용액으로 2회 세척한 후 세포표면 분자들의 발현을 유세포분석기 (FACScan, BD Biosciences, U.S.A) 로 분석한다.
2 ml로 조정하여 복강 내로 주사하여 전신감작을 시킨다. 이후 14일째에 생쥐를 마취한후 OVA(500ug/ml) 100 ㎕를 기도투여(i.t)하였다. 21일째부터 분무기를 이용하여 2.
조직을 파라핀으로 포매하여 5 μm 부분의 두께로 조직절편을 만들었으며, hematoxyline/eosin (H&E)르로 염색하였고, 조직의 손상 정도를 관찰하기 위하여 Masson/trichrome (M-T) 염색을 동시에 시행하여 관찰하였다.
폐와 폐포세척액으로부터 분리한 세포로부터 여러가지 세포표면 분자들에 대한 항체를 이용하여 면역염색하기 위하여 2～5×105 세포로 조정하여 염색 완충용액 (1% 우태아 혈청, 0.01% NaN3가 포함된 인산염 완충용액, pH 7.4)으로 1회 세척하였다.
한의학에서는 이러한 哮喘證을 實證과 虛證으로 구분하여 治療하게 되는데 이에 저자는 實證性喘息治療에 주로 應用된 地骨皮, 桑白皮 및 두 배합약물이 喘息治療에 어느정도의 효능이 있는지를免疫學的인 실험을 통해 연구해 보고자 Balb/c 생쥐에 ovalbumin으로 천식을 유발한 후 BALF에 존재하는 총폐세포수, 총백혈구수, 총호산구수와 유세포 형광염색한 폐조직내 CD3, CD19, CD3/CD69, CD4, CD8, CD3-/CCR3+, CD3+/NK1.1+와 BALF내의CD3,CD19, CD3+/CD69+, CD3-/CCR3+, B220/IgE+와 ELISA분석에서 BALF 내의 IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, Eotaxin 그리고 혈청내의 IgE와 histamine 유출량의 변화와 마지막으로 H&E, M-T 두가지 염색법으로 폐세포조직을 분석 관찰하게 되었다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 시약은 thiazol-2,5-carboxymethoxyphenyl-2,4-sulfophenyl-2H-tetrazolim (MTS), 2,7,-dichlorodihydrofluorescin diacettate (DCFH-DA), complete adjuvent, chloroform, collagenase, isopropanol, 적혈구용혈액 (RBC lysis solution), dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), formaldehyde, magnesium chloride (MgCl2)는 Sigma 사 (U.S.A) 제품을 사용하였으며, 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)은 Hyclone 사 (Logan, U.S.A) 제품을 사용하였으며, 유세포 분석을 위한 항체인 anti-CD3- PE(phycoerythrin), anti-CD4-FITC(fluorescein isothiocyanate), anti-Gr1-PE, anti-CD8-FITC, anti-CD11b-FITC, anti-IgE-FITC, anti-CD69-FITC, propidium iodide (PI)와 RNase는 Pharmingen 사 (Torreyana, U.S.A) 제품을, IL-5는 R & D system 社 (Minneapolis, U.S.A) 제품을 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
실험동물은 雌性인 5주령의 Balb/c 생쥐 30수를 (주)대한바이오링크(대한민국충북 음성)에서 공급받아 실험 당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료)와 물을 충분히 공급하고, 실온 22±2℃를 유지하여 2주간 실험실환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
실험에 사용된 약재는 地骨皮, 桑白皮이며, 대한민국 서울 경동시장에서 구입하여 상지대학교 한의과대학 본초·방제학교실에서 감정한 후 정선하여 사용하였다.

데이터처리

Comparisons between control and test groups were analyzed using Student's T-test (*p < 0.05, **p < 0.01, *** <0.001).
Comparisons between control and test groups were analyzed using Student's T-test.
대조군과 실험군 간의 차이에 대한 통계학적 유의성 검증은 Student's T-test 방법으로 분석하였으며, p값이 0.05 이하인 경우 유의한 것으로 인정하였다.

이론/모형

한약재 투여군의 폐기능 검사를 위하여 전신체적변동기록법(Whole body plethysmograph, model Biosystem XA; Buxco Electronics Inc, Troy, New York, USA)을 이용하여 메타콜린에 의한 기도 협착을 유발하여 기도의 과민 반응을 측정하였다.

성능/효과

1. 대조군에 비해 地骨皮, 桑白皮 및 두 배합약물 투여군에서의 폐무게, 폐세포수, BALF내 백혈구 수, 호산구 수가 현저하게 감소되었다.
그리고 CD19는 B세포에서 발현하는 주요 marker이다.¹⁹⁾ 폐조직과 BALF 내 CD19⁺의 세포수를 살펴보면, 투여군에서 대조군에 비해 CD19⁺의 세포수가 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다. (Fig.
2. 地骨皮, 桑白皮 및 두배합약물 투여군의 CD3⁺/CD69⁺, Gr-1⁺/CD11b⁺의 비율은 폐조직과 BALF내에서 대조군에 비해 현저하게 감소되었다.
3. 地骨皮, 桑白皮 및 두 배합약물투여군에서 대조군에 비해 폐조직내 CD4⁺의 세포수가 현저하게 감소된 것을 확인 할 수 있었다.
4. CD8⁺의 세포수는 모든 농도의 地骨皮, 桑白皮 투여군과 병용투여군에서, 폐조직 내에서는 병용투여군에서 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.
5.ELISA분석에서 地骨皮, 桑白皮 및 두 배합약물 투여군에서의 BALF내 IL-4, IL-5, IL-13와 serum내 IgE, histamine이 대조군에 비해 감소되었다.
6. 地骨皮, 桑白皮 및 두 배합약물 투여군에서 염증세포의 침윤과 collagen 부착이 대조군에 비해 현저하게 감소 되어있다.
BALF 내 T세포인 CD3+ 세포수는 정상군에서 4.8±1.9(×103)인 반면, 대조군에서의 세포수는 25.3±2.7로 현저히 증가되었다.
BALF내 B220+/IgE+의 세포수는 천식을 유발시키지 않은 정상군에서의 B220+/IgE+ 세포수는 0.3±0.1(×103)인 반면, 대조군에서의 세포수는 2.5±0.1(×103)로 현저히 증가되었다.
BALF내 B세포인 CD19+는 세포수는 정상군에서 0.2±0.0(×103)인 반면, 대조군에서의 세포수는 1.0±0.1로 현저히 증가되었다.
BALF내 CD3-/CCR3+(eosinophil)의 세포수는 천식을 유발시키지 않은 정상군에서의 CD3-/CCR3+ 세포수는 0.5±0.1(×105)인 반면, 대조군에서의세포수는 8.1±1.3(×105)로 현저히 증가되었다.
BALF내 IFN-γ는 천식을 유발시키지 않은 정상 군에 비해 OVA를 감작하여 천식을 유발시킨 대조군에 비해 감소되었고, LC, MA 및 병용투여군에서의 IFN-γ가 대조군에 비해 유의성 있게 증가되었다(Fig. 5D).
2B). BALF내의 총백혈구는 OVA를 감작시키지 않은 정상군에 비해 BALF 내 백혈구의 수가 OVA를 감작시킨 대조군에서 현저하게 증가되었다. 대조군에 비하여 LC, MA 및 병용투여군에서 모두 감소되었으며, 특히 모든 농도의 MA 단독투여군과 병용투여군에서 현저한 감소를 보였다(Fig.
2C). BALF내의 총호산구 수는 OVA를 감작시키지 않은 정상군에 비해 BALF 내 호산구의 수가 OVA를 감작시킨 대조군에서 현저하게 증가되었다. 대조군에 비하여 LC, MA 및 병용투여군에서 모두 감소되었으며, 특히 병용투여군에서 현저한 감소를 보였다(Fig.
H&E의 염색에서 정상군에 비해 OVA로 유발된 천식대조군에서 폐포 주위에 호산구 같은 천식유발 염증세포의 침윤이 다량으로 존재하는 것이 관찰되었다.
LC, MA 그리고 병용투여군의 CD19+ 세포수는 각각 72.3±27.7(×104)(LC500mg/kg), 69.4±18.3(×104)(MA 500mg/kg), 70.3±2.0(×104)(LC+MA 500mg/kg)로 대조군에 비해 감소되었다.
LC, MA 그리고 병용투여군의 CD3+ 세포수는 각각 88.1±23.7(×104)(LC 500mg/kg), 106.2±9.4(×104) (MA 500mg/kg), 90.2±8.8(×104)(LC+MA 500mg/ kg)로 대조군에 비해 감소되었다.
LC, MA 및 병용투여군의 CD19+ 세포수는 각각 0.4±0.2(×103)(LC 500mg/kg), 0.4±0.1(×103)(MA 500mg/kg), 0.2±0.1(×103)(LC+MA 500mg/kg)로 대조군에 비해 감소하였다.
LC, MA 및 병용투여군의 CD3+/NK1.1+ 세포수는 각각 15.5± 6.6(×104)(LC500mg/kg), 11.9±1.1(×104)(MA 500mg/kg), 12.3±3.9(×104)(LC+MA 500mg/kg)로 대조군에 비해 감소하였다.
LC, MA 및 병용투여군의 CD3-/ CCR3+ 세포수는 각각 18.9±2.4(×104)(LC 500mg/ kg), 29.3±3.5(×104)(MA 500mg/kg), 18.7±0.2(×104)(LC+MA500mg/kg)로 대조군에 비해 감소하였다.
LC, MA 및 병용투여군의 CD3-/CCR3+ 세포수는 각각 1.5±0.2(×105)(LC 500mg/kg), 2.8±1.0(×105)(MA 500mg/kg), 1.4±0.5(×105)(LC+MA500mg/kg)로 대조군에 비해 감소하였다.
LC, MA 및 병용투여군의 CD4+ 세포수는 각각 69.1±21.2(×104)(LC 500mg/kg), 68.3±0.6(×104)(MA 500mg/kg), 64.4±4.1(×104)(LC+MA 500mg/kg)로 대조군에 비해 감소하였다.
LC, MA 및 병용투여군의 CD8+ 세포수는 각각 9.7±3.8(×104)(LC 500mg /kg), 13.6±0.9(×104)(MA 500mg/kg), 14.0±4.2(×104)(LC+MA 500mg/kg)로 대조군에 비해 감소하였다.
LC, MA 및 병용투여군의 Gr-1+/CD11b+ 세포수는 각각 13.3±1.7(×104)(LC 500mg/kg), 25.7±0.5(×104)(MA 500mg/kg), 20.2±1.1(×104)(LC+MA 500mg/kg)로 대조군에 비해 감소하였다.
in vivo 실험을 고찰해보면 첫째, LC, MA 및 병용투여군이 총 폐무게에 미치는 영향을 살펴보면, LC, MA 및 병용투여군에서는 각각 폐무게가 감소하였다. 이는 OVA로 유발된 기관지염증으로 인한 각종 면역세포의 증가와 관련이 있는 것으로 생각되며, 즉 이들 약재에 의하여 염증작용이 억제된 것으로 생각된다(Fig 2A).
H&E의 염색에서 정상군에 비해 OVA로 유발된 천식대조군에서 폐포 주위에 호산구 같은 천식유발 염증세포의 침윤이 다량으로 존재하는 것이 관찰되었다. 그러나 LC, MA 및 병용투여군에서는 폐포 주위에 침윤된 염증세포들이 감소된 것을 확인할수 있었으며, M-T(masson trichrome)염색은 폐포 조직의 주위에 collagen이 침착된 것을 자주색으로 염색하여 조직의 손상정도를 관찰하는 것으로 대조군에 비하여 LC, MA 및 병용투여군에서 조직손상이 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다.(Fig.
기도 과민반응의 억제 효과를 확인하기 위하여 메타콜린에 대한 PenH값을 측정한 결과 정상군 (Normal : WT)에 비해 OVA를 투여한 대조군 (CON)의 PenH값이 메타콜린 농도에 비례하여 증가되었으며, 대조군에 비하여 地骨皮(LC), 桑白皮(MA)및 병용투여군(LC+MA)에서 모두 PenH값이 메타콜린 농도에 비례하여 현저히 감소되었다. 특히 병용 투여군에서 현저하게 기도과민 반응이 감소된 것을 볼 수 있었다(Fig.
네 번째, ELISA 분석을 살펴보면, BALF내 IL-4, IL-5, IL-13, IgE, eotaxin이 투여군에서는 유의성있게 모두 감소되었으며, 특히 병용투여군에서 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 한편, IFN-γ는 대조군에서는 감소되는 것이 관찰되었고, 투여군에서는 모두 증가되었다(Fig.
다섯 번째, 폐세포조직을 살펴보면, 투여군에서는 폐포 주위에 침윤된 염증 세포들이 감소된 것을 확인할 수 있었으며 M-T 염색결과 조직손상이 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 6).
OVA를 투여하지 않은 정상군에 비해 OVA를 투여한 대조군의 폐세포수가 증가되었다. 대조군에 비하여 LC, MA 및 병용투여군에서 모두 감소되었으며, 특히 MA(500 mg/kg) 단독투여군과 병용투여군에서 현저한 감소를 보였다(Fig. 2B). BALF내의 총백혈구는 OVA를 감작시키지 않은 정상군에 비해 BALF 내 백혈구의 수가 OVA를 감작시킨 대조군에서 현저하게 증가되었다.
BALF내의 총백혈구는 OVA를 감작시키지 않은 정상군에 비해 BALF 내 백혈구의 수가 OVA를 감작시킨 대조군에서 현저하게 증가되었다. 대조군에 비하여 LC, MA 및 병용투여군에서 모두 감소되었으며, 특히 모든 농도의 MA 단독투여군과 병용투여군에서 현저한 감소를 보였다(Fig. 2C). BALF내의 총호산구 수는 OVA를 감작시키지 않은 정상군에 비해 BALF 내 호산구의 수가 OVA를 감작시킨 대조군에서 현저하게 증가되었다.
BALF내의 총호산구 수는 OVA를 감작시키지 않은 정상군에 비해 BALF 내 호산구의 수가 OVA를 감작시킨 대조군에서 현저하게 증가되었다. 대조군에 비하여 LC, MA 및 병용투여군에서 모두 감소되었으며, 특히 병용투여군에서 현저한 감소를 보였다(Fig. 2D).
두 번째, LC, MA 및 병용투여군이 총 폐세포수에 미치는 영향을 살펴보면, 투여군에서는 유의성 있게 세포수가 감소되었다. 이는 폐내 호산구, 림프구, 대식세포, 비만세포 등의 염증 유발 세포들이 기도에 많이 침착되어 있거나, 기도 및 기관지의 부종 및 점액 분비과다를 의미한다.
이는 降濁작용을 하는 胃에 문제가 발생하여 痰濁이 上逆하여 肺를 핍박하기 때문에 발생하는 것이다. 둘째로 肺에 의해 발생하는 喘證은 평소 생활에는 아무런 변화가 없고, 다만 숨을 쉴 때 소리가 나거나 혹은 숨 쉴 때에는 문제가 없다가 움직이게 되면 그때서야 숨을 헐떡이는 것으로 설명하고 있다. 이는 肺의 絡脈이 逆亂하여 발생하는 것으로, 비교적 가벼운 병증에 속하는 것이다.
마지막으로 BALF내 호산구 수에 미치는 영향을 살펴보면, 투여군에서 대조군에 비해 현저하게 호산구 수가 감소된 것을 확인할 수 있었다. 이는 투여군이 호산구 증가에 의한 천식 기전을 억제하는 작용이 있음을 시사한다(Fig.
모든 실험은 5회 반복하였으며, 총 30 마리의 생쥐로부터 얻은 결과를 종합하여 mean±standard error 값으로 나타내었다.
본 실험에서 투여군에서 대조군에 비해 폐조직에서 CD4⁺, CD8⁺의 세포수가 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다. (Fig.
, T 세포의 초기 활성화를 나타내며, 활성화된 호산구에서 발현되므로 천식모델에서 호산구 침윤의 표지로 사용될 수 있다. 본 실험에서 폐조직과 BALF에서 CD3⁺/CD69⁺의 세포수를 살펴보면, 투여군에서 대조군에 비해 CD3⁺/CD69⁺의 세포수가 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다. (Fig.
세 번째, 유세포 형광분석에서 CD3⁺는 T 세포 모두에 존재하는 표면분자이며, CCR3⁺ receptor는 주로 호중구, 호산구, 비만세포 및 Th2 세포에서 발현된다¹⁸⁾. 폐조직과 BALF 내 CD3⁺의 세포수를 살펴보면 LC, MA 및 병용투여군에서 대조군에 비해 CD3⁺의 세포수가 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(Fig.
5G). 이 결과는 투여군이 천식반응에 주된 인자로 알려진 히스타민의 생성 억제에 유의한 작용이 있음을 보여준다.
이상의 결과로 地骨皮, 桑白皮 배합약물은 천식동물모델에 있어서 호산구의 세포증식 억제, BALF, serum내의 Th2 cytokine인 IL-4, IL-5, IL-13 등의 생성 억제, IFN-γ의 생성증가 등에 의한 작용을 통하여 기도의 염증반응 및 과민반응을 억제시켜 천식 증상을 완화시키는 것으로 확인 할 수 있었으며, 특히 地骨皮, 桑白皮의 단독투여시보다 총 폐무게, BALF에서의 호산구수, 폐세포에서의 Gr-1+/CD11b+ 등의 세포수, IL-4생성량, serum에서의 IgE생성량 억제효과와 BALF에서의 IFN-γ생성량의 증가가 유의성 있게 나타난것으로 확인 할 수가 있었다.
이는 폐내 호산구, 림프구, 대식세포, 비만세포 등의 염증 유발 세포들이 기도에 많이 침착되어 있거나, 기도 및 기관지의 부종 및 점액 분비과다를 의미한다. 천식대조군에서 각종 면역 관련 세포를 포함하는 총 폐세포수가 증가되었고, 투여군에서 총 폐세포수가 유의성있게 감소됨으로써 기도내 염증세포의 증가를 억제하고, 이들 세포에 의한 염증반응을 억제하는 작용이 있는 것으로 생각된다(Fig. 2B).
천식을 유발시키지 않은 정상군에 비해 OVA를 감작하여 천식을 유발시 킨 BALF 내 IL-4, IL-5, IL-13, Eotaxin과 혈청내 IgE는 현저히 증가되었다. IL-4는 LC, MA 및 병용투여군에서의 대조군에 비해 감소되었으며, 특히 LC와 병용투여군에서 유의성 있게 감소되었다(Fig.
투여군에서 대조군에 비해 Gr-1⁺/CD11b⁺의 세포수가 감소하였고 LC, MA, 병용 투여군에서 현저한 감소를 보였다(Fig. 3F).
폐조직 내 T세포인 CD3+ 세포수는 정상군에서 70.2±13.3(×104)인 반면, 대조군에서의 세포수는 205.6±9.1(×104)로 현저히 증가되었다.
. 폐조직과 BALF 내 CD3⁺의 세포수를 살펴보면 LC, MA 및 병용투여군에서 대조군에 비해 CD3⁺의 세포수가 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3A, 4A). 그리고 CD19는 B세포에서 발현하는 주요 marker이다.
폐조직내 B세포인 CD19+ 세포수는 정상군에서 44.2±3.9(×104)인반면, 대조군에서의 세포수는 102.6±3.3(×104)로 현저히 증가되었다.
폐조직내 CD3+/CD69+의세포수는 천식을 유발시키지 않은 정상군의 CD3+/CD69+ 세포수는 9.8±1.0(×104)인 반면, OVA 를 감작하여 천식을 유발시킨 대조군에서의 세포수는 49.5±1.5(×104)로 현저히 증가되었다.
폐조직내 CD3+/NK1.1+(NKT)의 세포수는 천식을 유발시키지 않은 정상군에서의 CD3+/NK1.1+ 세포수는 5.4±0.2(×104)이며, OVA를 감작하여 천식을 유발시킨 대조군에서 29.1± 1.7(×104)으로 현저하게 증가되었다.
폐조직내 CD3-/ CCR3+(eosinophil)의 세포수는 천식을 유발시키지 않은 정상군에서의 CD3-/CCR3+ 세포수는 10.2±3.4(×104)이며, OVA를 감작하여 천식을 유발시킨 대조군에서 63.5±9.0(×104)으로 현저하게 증가되었다.
폐조직내 CD4+의세포수는 천식을 유발시키지 않은 정상군에서의 CD4+ 세포수는 50.9±9.0(×104)이며, OVA를 감 작하여 천식을 유발시킨 대조군에서 146.8±3.7(×104)으로 현저하게 증가되었다.
폐조직내 CD8+의 세포수는 천식을 유발시키지 않은 정상군에서의 CD8+ 세포수는 7.1±0.2(×104)이며, OVA를 감작하여 천식을 유발시킨 대조군에서 28.8±2.8(×104)으로 현저하게 증가되었다.
폐조직내 Gr-1+/CD11b+의 세포수는 천식을 유발시키지 않은 정상군에서의 Gr-1+/ CD11b+ 세포수는 14.0±1.1(×104)이며, OVA를 감작하여 천식을 유발시킨 대조군에서 61.7±4.2(×104)으로 현저하게 증가되었다.
한편, IFN-γ는 대조군에서는 감소되는 것이 관찰되었고, 투여군에서는 모두 증가되었다(Fig. 5D).
혈청내 IgE 천식을 유발시키지 않은 정상군에 비해 OVA를 감작하여 천식을 유발시킨 대조군의 BALF 내 IgE가 현저히 증가되었고, LC, MA 및 병용투여군에서의 BALF 내 IgE가 대조군에 비해 유의성 있게 감소되었다(Fig. 5F). 혈청내 histamine 천식을 유발시키지 않은 정상군에 비해 OVA를 감작하여 천식을 유발시킨 대조군의 serum 내 histamine이 현저히 증가되었고, LC, MA 및 병용투여군에서의 serum 내 histamine이 대조군에 비해 감소되었다.
5F). 혈청내 histamine 천식을 유발시키지 않은 정상군에 비해 OVA를 감작하여 천식을 유발시킨 대조군의 serum 내 histamine이 현저히 증가되었고, LC, MA 및 병용투여군에서의 serum 내 histamine이 대조군에 비해 감소되었다. 특히 병용투여군에서 유의성있게 감소되었다(Fig.
히스타민 생성에 미치는 영향을 살펴보면 본 실험에서 투여군의 경우 히스타민 생성량이 감소하였다 (Fig. 5G). 이 결과는 투여군이 천식반응에 주된 인자로 알려진 히스타민의 생성 억제에 유의한 작용이 있음을 보여준다.

후속연구

특히, 단독투여시보다 병용투여군에 의하여 총폐무게, BALF에서의 호산구 수, 폐세포에서의 CD3-/CCR3+, Gr-1+/CD11b+ 등의 세포수, IL-4 생성량, serum에서의 IL-5, IgE 생성량 억제 효과와 BALF에서의 IFN-γ 생성량의 증가가 높은것으로 나타났으며, 이는 병용투여군이 천식의 주요발생 기전 및 유병 원인인 Th1/Th2 밸러스 조절작용에 관계가 있는 것으로 사료되며, 차후 본 실험연구를 참조하여 LC, MA 및 두 배합약물의 천식 치료효과에 대해 더 깊은 연구가 필요할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	地骨皮는 어떤 효능을 가졌는가?	한편 地骨皮, 桑白皮에 대한 연구보고를 보면, 地骨皮는 염증질환의 주된 원인으로 밝혀진 NO 생성을 촉진하는 COX-2, iNOS 등을 억제하며6), 조혈줄기세포의 증식을 촉진하고7), 桑白皮는 compound48/80으로 유도된 아나필락스 반응 및 IgE 매개에 의한 비만세포의 활성을 억제하며8), COX-2, iNOS 생성 억제하고6), 호산구의 탈과립 억제작용을 통한 기도과민반응을 억제하는 것으로 보고되었으며9), 이외에 상백피의 항염작용10), 마우스의 복강비만세포의 탈과립 및 히스타민 유리 억제효과11), 항알러지 작용12), 喘息모델 흰쥐의 BALF 內 면역세포 및 血淸 IgE 생성 억제효과13) 등이 보고되었다.
	본 연구에서 LC, MA 및 병용투여군이 총 폐세포수에 미치는 영향을 볼 때, 투여군에서는 유의성 있게 세포수가 감소했는데 이는 무엇을 의미하는가?	두 번째, LC, MA 및 병용투여군이 총 폐세포수에 미치는 영향을 살펴보면, 투여군에서는 유의성 있게 세포수가 감소되었다. 이는 폐내 호산구, 림프구, 대식세포, 비만세포 등의 염증 유발 세포들이 기도에 많이 침착되어 있거나, 기도 및 기관지의 부종 및 점액 분비과다를 의미한다. 천식대조군에서 각종 면역 관련 세포를 포함하는 총 폐세포수가 증가되었고, 투여군에서 총 폐세포수가 유의성있게 감소됨으로써 기도내 염증세포의 증가를 억제하고, 이들 세포에 의한 염증반응을 억제하는 작용이 있는 것으로 생각된다(Fig.
	천식의 병리적 특성은 무엇인가?	현대 의학에서 천식은 환경적 요인과 유전적 요인의 복합적 원인으로 발생되는 것으로 알려져 있으며1,2), 병리적인 특성은 기도 평활근의 수축, 부종과 세포침윤으로 인한 점막 비후와 기도 내강의 비정상적으로 농도가 짙고, 끈적끈적한 농축된 점액이 특징으로서 이로 인한 기도저항이 증가되어 반복적이고 간헐적인 기침, 호흡곤란, 흉부 압박감과 천명이 유발되는 것으로 알려져 있다3) . 면역학적 모델에서 천식은 기도점막에서 비만세포에 부착하는 IgE 항체에 의해 유발되며, 이후 Th2 세포에서 생산되는 IL-4, IL-5, IL-13 등이 호산구를 유인하고 활성화시키며 B 세포의 IgE의 생성을 자극한다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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