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문제 정의
- 24,25) 본 연구는 엉겅퀴 잎을 대상으로 열수 추출하여 혈관손상에 따른 염증억제 및 혈류 개선효과를 알아보고자 ferric chloride(FeCl3)에 의해 경동맥 손상을 유도한 후 엉겅퀴 잎 추출물(Cirsium japonicum var. ussuriense leaf extract, CLE)을 경구투여하고 그 효과를 조사한 바 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- FeCl3 유도 경동맥 혈전 혈관에 대한 CLE의 Doppler 효과 − 본 연구는 FeCl3로 유도된 렛트 경동맥의 혈관상태와 혈류에 미치는 CLE의 효과를 알아보았다.
- 27-29) 따라서 최근에는 합성약물 및 생물약품에 비해서 부작용이 없는 천연물 유래 약물 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 본 연구는 전통적으로 토혈, 혈뇨, 대하, 간염 및 고혈압 등 치료에 활용15-17)해 온 엉겅퀴를 대상으로 렛트 혈전 모델에서 그 효과를 조사하였다.
제안 방법
- FeCl3 유도 경동맥 혈전 혈관에 대한 CLE의 조직학적 개선효과 − 본 연구는 FeCl3를 이용한 경동맥 혈관 손상 후 20일 동안 CLE를 투여한 후 경동맥을 적출한 후 파라핀 절편(5 µm)을 제작하여 H&E로 염색하고 조직학적 변화를 관찰하였다.
- TNF-α 및 ICAM 생성에 대한 CLE의 억제 효과 − FeCl3로 유도된 혈전모델에서 20일간 CLE를 투여한 후 염증유발 인자인 TNF-α와 부착분자인 ICAM을 측정하였다.
- 어깨선이 이어지는 목 부근의 피부와 근육을 절개하고 미주신경이 손상되지 않도록 주의하여 왼쪽 경동맥을 노출시킨 후 유발 전 Doppler flowprobe(MyLab 25, Esapte, Italy)로 초음파를 측정하여 혈류 속도(blood flow rate), 혈관 지름(blood vessel diameter), 혈관 면적(blood vessel area), 혈류량(blood flow amount)을 측정한 후 70% FeCl3를 적신 filter paper(3×5 mm)를 10분간 접촉시켜 유지하였다. 그 후 filter paper를 제거하고 초음파를 측정하여 혈전유발을 확인하고 수술부위를 봉합한 후 정상군과 대조군은 생리식염수(2 mL/마리)을 투여하였고, 실험군은 생리식염수 2 mL에 CLE(100 mg/kg) 또는 aspirin(5 mg/kg)을 20일간 경구투여하였다(Fig. 1).
- 마지막으로 FeCl3로 유도된 혈전모델에서 CLE의 염증개선을 통한 혈전 개선효과를 확인한 후 혈관의 조직학적 개선 효과를 알아보았다. 그 결과 혈전유발 대조군에서는 혈전이 유발됨으로써 정상군에 비해 혈관내의 교원 섬유 부분이 상당히 손상되고 두터워졌으나, CLE를 투여한 실험군에서는 혈전 생성이 감소되었고, 혈관내의 교원 섬유의 손상도 억제되는 것을 확인하였다(Fig.
- 사이토카인 및 ICAM-1 − 실험동물로의 간문맥으로부터 정맥혈액을 채취하고 4℃ 냉장상태에서 약 12시간 보관 후 3,000 rpm으로 원심분리하여 혈청을 얻고 TNF-α와 ICAM1를 측정하였다.
- 어깨선이 이어지는 목 부근의 피부와 근육을 절개하고 미주신경이 손상되지 않도록 주의하여 왼쪽 경동맥을 노출시킨 후 유발 전 Doppler flowprobe(MyLab 25, Esapte, Italy)로 초음파를 측정하여 혈류 속도(blood flow rate), 혈관 지름(blood vessel diameter), 혈관 면적(blood vessel area), 혈류량(blood flow amount)을 측정한 후 70% FeCl3를 적신 filter paper(3×5 mm)를 10분간 접촉시켜 유지하였다.
- 요약하면, 5배 희석 혈청 100 µL을 각각의 항체가 코팅된 plate에 주입하고 반응시킨 후 잘 세척한 다음 horseradish peroxidase가 부착된 2차 항체를 주입하고 반응시킨 후 발색 기질을 주입하고 반응시켜 ELISA reader로 측정하였으며, 각 물질에 대한 정량은 각각의 물질을 농도별로 처리하여 반응시켜 표준곡선을 정하고 혈청에 함유된 물질의 량을 계산하였다.
- ussuriense) 잎은 2011년 5월 30일에 채취하여 우석대학교 한의과대학 방제학교실의 김홍준 교수에게 의뢰하여 동정하였고, 표본(#2012-053)은 전주대학교 대체의학대학 건강관리 연구실에 보관하고 있다. 잘 건조된 시료는 200 g을 분말로 제조하여 증류수(3 L)로 3시간 동안 추출기로 열수 추출하였다. 추출물은 0.
- 항혈전 효능 및 혈관조직 H&E 염색 − CLE를 20일 간 경구투여한 후 Fig. 1과 같이 Doppler flow probe를 이용하여 혈류속도, 혈류량, 혈관지름, 혈관면적을 측정하여 혈전 유발 전의 결과와 개선정도를 비교하였다.
- 혈관 조직의 조직학적 변화를 관찰하기 위해 H&E 염색을 실시하여 광학현미경(Leica DMRB, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
- 혈류속도, 혈관지름, 혈관면적, 혈류량에 대한 CLE의 효과 − 본 연구는 FeCl3로 유도된 혈전모델에서 20일간 CLE를 투여한 후 초음파 장비를 이용하여 혈류 속도, 혈관 지름, 혈관 면적, 혈류량을 측정하였다.
- 혈전유발 부위 혈관의 조직학적 관찰을 위해 혈관 양쪽을 단단히 고정하고 경동맥을 3~4 mm 적출하여 4% 파라포름알데하이드에 고정하고 파라핀에 포매한 후 절편(두께 5 µm)을 제작하였다.
대상 데이터
- 실험동물 − 무균환경에서 사육된 8주령 수컷 Sprague Dawley rat(SD rat; 240-290 g)는 중앙실험동물(서울)로부터 구입하였다. 1주일의 순화기간을 거친 후 무작위로 6마리씩 배정한 다음 실험에 사용하였다. 실험동물은 전 실험기간 동안 고형사료와 물을 자유스럽게 섭취하도록 하였으며, 사육환경 온도 23±3℃, 밤낮주기(12시간)가 조절되는 환경에서 사육하였으며 전주대학교 실험동물위원회의 실험 규정에 준하여 실행하였다.
- 시약 − Tumor necrosis factor-α(TNF-α)와 intracellular adhesion molecule(ICAM-1) 등 ELISA kit은 R&D Systems 사(Minneapolis, USA)로부터 구입하였으며, FeCl3, hematoxylin & eosin(H&E)와 기타 시약은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
- 실험동물 − 무균환경에서 사육된 8주령 수컷 Sprague Dawley rat(SD rat; 240-290 g)는 중앙실험동물(서울)로부터 구입하였다.
- 엉겅퀴 잎 추출 − 실험에 사용한 전라북도 임실군 오수면 소재 임실생약영농조합법인에서 재배한 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense) 잎은 2011년 5월 30일에 채취하여 우석대학교 한의과대학 방제학교실의 김홍준 교수에게 의뢰하여 동정하였고, 표본(#2012-053)은 전주대학교 대체의학대학 건강관리 연구실에 보관하고 있다.
데이터처리
- 통계처리 − 모든 실험값은 평균±표준편차로 표시했으며, 통계분석은 ANOVA와 Student’s t-test로 처리하였으며, 유의성 한계는 p<0.05로 정하였다.
이론/모형
- FeCl3를 이용한 경동맥 혈전 유발 동물모델 제작 − 실험전 체중을 측정하고 Kurz 등26)의 방법에 준하여 zoletil(0.1 ml/체중 100 g, 복강투여)로 마취한 후 체온조절장치에 고정하여 수술을 진행하였다.
- 혈청내 TNF-α와 ICAM-1량은 anti-mouse TNF-α 또는, anti-mouse ICAM-1 항체를 사용하여 각각에 특이적으로 작용하는 ELISA kit을 사용하여 R&D Systems 사가 제공하는 방법에 준하여 측정하고 정량하였다.
성능/효과
- p>혈전(thrombus)은 혈관 속에서 피가 굳어진 덩어리를 말하는데, 혈전으로 인해 생기는 질환을 혈전증(thrombosis)이라 한다.1) 우리 몸은 여러 가지 혈전형성인자와 조절인자가 균형을 이루고 있어서, 정상인에서는 과도한 혈전이 만들어지지 않지만, 혈전형성억제에 관여하는 인자들의 균형이 깨지게 되면 혈전이 형성될 수 있다.1,2) 뇌졸중, 심근경색과 같은 죽상동맥혈전 또는 혈전 뇌경색은 혈관의 평활근 세포 증식, 혈관 내피세포 염증, 혈소판 응집에 영향을 미친다.
- 1) 우리 몸은 여러 가지 혈전형성인자와 조절인자가 균형을 이루고 있어서, 정상인에서는 과도한 혈전이 만들어지지 않지만, 혈전형성억제에 관여하는 인자들의 균형이 깨지게 되면 혈전이 형성될 수 있다.1,2) 뇌졸중, 심근경색과 같은 죽상동맥혈전 또는 혈전 뇌경색은 혈관의 평활근 세포 증식, 혈관 내피세포 염증, 혈소판 응집에 영향을 미친다.1-3) 혈관질환은 크고 작은 크기의 근육성 동맥의 병리학적 상태이고 혈관내피세포의 기능장애에 의해 유발된다.
- 1-6) 혈전으로 인한 인체질환은 뇌출혈, 뇌졸증, 심부전, 심장마비 등 뇌혈관질환과 심장질환을 들 수 있다.6) 노인성 혈전은 혈관의 죽상 동맥경화는 혈소판 응집력의 항진에 의한 혈전 형성의 직접 원인이 되며, 혈관 손상에 따른 염증반응이 진행되면 혈전이 가속화되어 혈관계 질환을 악화시킨다.7-9) 특히, 혈전으로 인한 뇌혈관 질환과 심장 질환은 연령이 높아질수록 그 발병률이 높아 사망의 주요 요인이 되고 있기 때문에 이를 예방하고 치료하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다.
- 4,7,31) FeCl3가 처리된 경동맥은 심한 손상으로 혈관내 급성 염증이 진행되어 혈전을 유발하는 것으로 알려져 있는데, 활성산소뿐만 아니라 TNF-α와 같은 염증유발인자와 백혈구의 화학주성 (chemotaxis)을 촉진하는 ICAM 분자발현을 촉진시켜 염증 반응을 악화시킨다.6,32) FeCl3로 유도된 혈전모델에서 CLE 의 투여는 참고약물로 사용된 aspirin 과 유사하게 ICAM의 생성을 억제시키는 우수한 효과가 있었다. 이러한 결과는 CLE가 FeCl3로 유발된 혈관손상으로부터 염증반응을 효과적으로 억제하여 혈전을 개선하는 효과를 발휘할 수 있음을 제시해주었다.
- 를 이용한 경동맥 혈관 손상 후 20일 동안 CLE를 투여한 후 경동맥을 적출한 후 파라핀 절편(5 µm)을 제작하여 H&E로 염색하고 조직학적 변화를 관찰하였다. FeCl3로 유발된 혈전 혈관 대조군의 혈관은 정상군에 비해 혈관내의 교원 섬유 부분이 상당히 손상되고 두터워졌으나, 엉겅퀴 잎 추출물을 투여함으로써 혈전 생성이 감소되고 혈관내의 교원 섬유의 손상도 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 5).
- 로 유도된 혈전모델에서 CLE의 염증개선을 통한 혈전 개선효과를 확인한 후 혈관의 조직학적 개선 효과를 알아보았다. 그 결과 혈전유발 대조군에서는 혈전이 유발됨으로써 정상군에 비해 혈관내의 교원 섬유 부분이 상당히 손상되고 두터워졌으나, CLE를 투여한 실험군에서는 혈전 생성이 감소되었고, 혈관내의 교원 섬유의 손상도 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 5).
- 정상군의 혈관상태와 혈류는 일정한 상태의 doppler를 보였지만, FeCl3로 처리하여 혈관 손상 및 혈전을 유발한 대조군는 정상군에 비해 doppler 관찰결과 현저히 억제되는 것을 확인하였다. 그러나 CLE(100 mg/kg)를 하루에 1회씩 20일 동안 경구 투여한 후 doppler를 관찰한 결과 혈전유발 대조군에 비해 혈관 및 혈류가 개선된 것을 확인하였다(Fig. 2). 이러한 CLE의 혈관 및 혈류 개선 효과는 참고약물로 사용한 aspirin의 doppler 관찰결과와 유사하였다.
- 따라서 본 연구는 FeCl3로 유도된 혈전모델에서 20일간 CLE를 투여한 후 염증유발 인자인 TNF-α와 부착분자인 ICAM을 측정한 결과 혈전유발 대조군에 비해서 TNF-α와 ICAM을 효과적으로 억제하는 결과를 얻었다(Fig. 4).
- 로 유도된 혈전 모델에서 혈류 속도, 혈관 지름, 혈관 면적, 혈류량을 측정한 결과 혈전유발 대조군에 비해서 모든 수치가 현저하게 개선시키는 효과가 있었으며, 혈관 지름과 혈관 면적은 정상군의 수준으로 개선되어 대조약물로 사용한 아스피린과 비슷한 수준으로 효과가 있음을 확인하였다. 또한 FeCl3로유도된 혈전모델에서 CLE는 염증유발 인자인 TNF-α와 부착분자인 ICAM을 효과적으로 억제하였다. 이러한 결과는 CLE가 FeCl3로 유발된 혈관손상으로부터 염증반응을 효과적으로 억제하여 혈전을 개선하는 효과를 발휘할 수 있음을 제시해주었다.
- 본 연구는 FeCl3로 유도된 렛트 혈전모델에서 20일간 엉겅퀴 잎 추출물인 CLE를 투여한 후 초음파 장비를 이용하여 혈류 속도, 혈관 지름, 혈관 면적, 혈류량을 측정한 결과 혈전유발 대조군에 비해서 모든 수치가 현저하게 개선되었다. 특히, 혈관 지름과 혈관 면적은 정상군의 수준으로 개선되었으며, 대조약물로 사용한 아스피린과 비슷한 수준으로 효과가 있음을 확인하였다(Fig.
- 엉겅퀴는 apigenin, luteolin, myricetin, kaemferol, pectolinarin, 5,7-dihtdroxy-6,4'-dimethoxyflavone, hispidulin7-neo-hesperioside flavonoid, luteolin, myricetin, kaemferol, pectolinarin, 5,7-dihydroxy-6,4'-dimetethoxy flavone, hispidulin7-neo-hesperioside등 플라보노이드 계열의 화합물이 풍부하게 함유되어 항염증, 항암, 항돌연변이, 항진균, 신경보호 및 면역 증진에 대한 생리활성이 우수한 것으로 알려졌다.
- 6,32) FeCl3로 유도된 혈전모델에서 CLE 의 투여는 참고약물로 사용된 aspirin 과 유사하게 ICAM의 생성을 억제시키는 우수한 효과가 있었다. 이러한 결과는 CLE가 FeCl3로 유발된 혈관손상으로부터 염증반응을 효과적으로 억제하여 혈전을 개선하는 효과를 발휘할 수 있음을 제시해주었다.
- 이상의 결과를 종합해볼 때 CLE는 FeCl3로 유도된 혈전 모델에서 혈류 속도, 혈관 지름, 혈관 면적, 혈류량을 측정한 결과 혈전유발 대조군에 비해서 모든 수치가 현저하게 개선시키는 효과가 있었으며, 혈관 지름과 혈관 면적은 정상군의 수준으로 개선되어 대조약물로 사용한 아스피린과 비슷한 수준으로 효과가 있음을 확인하였다. 또한 FeCl3로유도된 혈전모델에서 CLE는 염증유발 인자인 TNF-α와 부착분자인 ICAM을 효과적으로 억제하였다.
- 정상군(혈류: 13.31±1.81 cm/sec; 혈관직경: 0.164±0.007 cm; 혈관면적: 2.23±0.21 mm2;혈류량: 17.82±2.51 ml/min)에 비해 혈전유발 대조군에서 모든 수치(혈류: 7.32±0.74 cm/sec; 혈관직경: 0.121±0.008 cm; 혈관면적: 1.28±0.11 mm2; 혈류량: 7.12±1.90 ml/min)가 유의하게 감소하였고(p<0.001), CLE 투여군은 혈전유발 대조군에 비해 모든 수치(혈류: 9.37±2.64 cm/sec; 혈관직경:0.156±0.019 cm; 혈관면적: 2.051±0.056 mm2; 혈류량: 12.8±5.04 ml/min)가 유의적으로 혈행이 개선된 것을 확인하였다(p<0.05).
- 정상군은 TNF-α와 ICAM의 혈청내 함량이 베이스 수준인데 비해 혈전유발 대조군은 혈청내 TNF-α와 ICAM이 각각 595.6±55.4 pg/mL과 319.8±12.7 pg/mL으로 현저히 증가한 반면(p<0.001), CLE 투여군은 TNF-α와 ICAM이 각각 320.5.6±80.3 pg/mL과 175.2±20.7 pg/mL으로 유의하게 억제되는 효과가 있었다(p<0.05).
- 로 유도된 렛트 경동맥의 혈관상태와 혈류에 미치는 CLE의 효과를 알아보았다. 정상군의 혈관상태와 혈류는 일정한 상태의 doppler를 보였지만, FeCl3로 처리하여 혈관 손상 및 혈전을 유발한 대조군는 정상군에 비해 doppler 관찰결과 현저히 억제되는 것을 확인하였다. 그러나 CLE(100 mg/kg)를 하루에 1회씩 20일 동안 경구 투여한 후 doppler를 관찰한 결과 혈전유발 대조군에 비해 혈관 및 혈류가 개선된 것을 확인하였다(Fig.
- 05). 특히, 혈관 지름과 혈관 면적은 정상군의 수준으로 개선되었으며 대조약물로 사용한 aspirin과 비슷한 수준으로 효과가 있음을 확인하였다(Fig. 3).
- 로 유도된 렛트 혈전모델에서 20일간 엉겅퀴 잎 추출물인 CLE를 투여한 후 초음파 장비를 이용하여 혈류 속도, 혈관 지름, 혈관 면적, 혈류량을 측정한 결과 혈전유발 대조군에 비해서 모든 수치가 현저하게 개선되었다. 특히, 혈관 지름과 혈관 면적은 정상군의 수준으로 개선되었으며, 대조약물로 사용한 아스피린과 비슷한 수준으로 효과가 있음을 확인하였다(Fig. 3). 이러한 결과는 본 연구에서 처음으로 밝혔다.
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