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문제 정의
- 본 연구에서 사용한 남항(Vitis romaneti)은 중국에 주로분포하는 야생종으로 현재 개량하여 재배하고 있는 포도 품종이나, 그 기능에 대해서는 아직까지 알려지지 않았다. 그러므로 본 연구는 남항 포도 잎 추출물(VGLE)과 본 품종유래 지표물질인 resveratrol(VGLR)을 활용하여 AAPH로유도된 적혈구 및 혈장의 산화적 손상에 대한 항산화 효과와 FeCl3로 유도된 경동맥 혈전 모델에서 혈행개선과 혈청학적변화에 대한 효과를 조사하였다. 그 결과 VGLE 및 VGLR은적혈구 및 혈장의 산화적 손상과 혈전을 억제함으로써 혈행을 개선할 수 있는 효과가 있었다.
- 그러므로 본 연구는 남항 포도잎 추출물(VGLE)과 남항포도잎 유래 resveratrol(VGLR)을 대상으로 랫트 적혈구및 혈장의 산화적 손상에 대한 항산화 및 랫트 경동맥 혈전모델에서 혈행개선에 대한 효과를 비교하여 조사한 결과 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구는 FeCl3를 이용한 경동맥 혈관 손상 후 20일 동안 VGLE 및 VGLR을 투여한 후 경동맥의 조직학적 변화를알아보기 위하여 H&E 염색을 실시하였다.
제안 방법
- 20일 간의 VGLE 또는 VGLR 투여기간 종료 후 doppler flow probe(MyLabTM 25, Esaote)를 이용하여 혈류 속도, 혈관 지름, 혈관 면적, 혈류량을 측정하여 각 그룹별 개선정도를 비교하였다. 혈전유발 부위 혈관의 조직학적 관찰을 위해 혈관 양쪽을 단단히 고정하고 경동맥을 3~4 mm 적출하여 4% paraformaldehyde(pH 7.
- RBC 부유액은 VGLE(12.5~400 μg/mL) 또는 VGLR(0.781~25.0 μg/mL)을 가하여 37°C에서 30분간 전 처리한 후 RBC의 자유유리기 사슬 산화를 유도하기 위해서 AAPH(최종농도 50 mM)를 주입하고 0~6시간 동안 37°C 에서 반응시켰다.
- 간단히 요약하면, 1 mL 반응액에 250 μL 의 TBA(0.67%)와 100 μL의 H3PO4(0.44 M)를 첨가하여1시간 동안 95°C에 방치한 다음 150 μL의 TCA(20%)를주입하였다.
- 어깨선이 이어지는 목 부근의피부와 근육을 절개하고 미주신경이 손상되지 않도록 주의하여 왼쪽 경동맥을 노출시킨 후 유발 전 Doppler flow probe(MyLabTM 25, Esaote, Genova, Italy)를 이용하여초음파를 측정하여 혈류 속도(blood flow rate), 혈관 지름(blood vessel diameter), 혈관 면적(blood vessel area), 혈류량(blood flow amount)을 측정한 후, 70% FeCl3를 적신 filter paper(3×5 mm)를 10분간 접촉시켜 유지하였다. 그 후 filter paper를 제거하고 초음파를 측정하여 혈전유발을 확인하고 수술부위를 봉합하였다. 혈전이 유발된 랫트에서 항혈전 효과를 관찰하기 위해서 Normal(정상군), Control(혈전유발군), VGLE(혈전유발+VGLE 투여군)와 VGLR(혈전유발+VGLR 투여군) 그룹으로 나누어 실험하였고, VGLE는 체중 kg당 200 mg, VGLR은 체중 kg당 5 mg씩1일 1회 20일 동안 경구투여 하였다.
- 적혈구는 세포막에 포함되어 있는 다량의 불포화 지방산과 세포질에 고 농도로 함유된 산소와 철이 부착된 헤모글로불린이 있어 매우 민감하게 산화적 손상을 받게 되어 자체의 항산화 체계가 교란되어 혈색소증을 비롯한 각종 빈혈을 유발한다(6). 그러므로 본 연구는 수용성 자유유리기 유도생성물질로 잘 알려진 AAPH를 사용하여 적혈구의 용혈을 유도하였다(20). 즉 대조군의 경우 AAPH로 4시간 동안 처리하였을 때 적혈구가 100% 용혈되었다.
- 로 알려졌다(22,23). 그러므로 본 연구에서는 VGLE와 VGLR의 투여가 혈행 개선에 어떠한 영향을 미치는가를 알아보기 위하여 경동맥에 FeCl3를처리하고 20일간 VGLE(200 mg/kg/day)와 VGLR(5 mg/ kg/day)을 투여하고 초음파 장비를 활용하여 먼저 doppler 양상을 비교하였다. 그 결과 Fig.
- 다음은 FeCl3 처리에 의한 혈전을 유발하고 VGLE 및 VGLR을 투여한 후 최종일에 초음파 장비를 이용하여 혈류속도, 혈관 지름, 혈관 면적, 혈류량을 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 다음은 혈장의 APPH 유도 지질과산화(MDA: 지질과산화의 최종산물)에 대한 VGLR 및 VGLR의 농도별 억제 효과를 알아보았다. 그 결과 Fig.
- 0 μg/mL)을 가하여 37°C에서 30분간 전 처리한 후 RBC의 자유유리기 사슬 산화를 유도하기 위해서 AAPH(최종농도 50 mM)를 주입하고 0~6시간 동안 37°C 에서 반응시켰다. 대조군은 인산완충액으로 적정된 적혈구부유액만 같은 온도 및 시간 조건으로 방치하고 실험하였다. 대조군과 각 실험군의 반응액은 2분간 3,000×g로 원심분리 하여 상층액을 얻은 후 Hseu 등(20)의 방법에 따라 ELISA reader(Molecular Devies, Sunnyvale, CA, USA) 로 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 본 연구는 FeCl3를 이용하여 경동맥 혈관 손상을 유발한 후 20일 동안 VGLE 및 VGLR을 투여한 후 식이섭취량과 체중의 변화 및 혈액학적 특성을 조사하였다. 그 결과 Table 1과 같이 Normal군, Control군, VGLE군 및 VGLR군에 있어서 식이섭취량은 유의한 변화가 없었지만, 20일간 체중증가량(body weight gain)은 Normal군(29.
- 3 mg) 분리를 하였다. 분리된 화합물은 1H-, 13C-NMR 등의 이화학 장비들을 이용하여 구조 분석하고 함량을 조사하였다.
- 어깨선이 이어지는 목 부근의피부와 근육을 절개하고 미주신경이 손상되지 않도록 주의하여 왼쪽 경동맥을 노출시킨 후 유발 전 Doppler flow probe(MyLabTM 25, Esaote, Genova, Italy)를 이용하여초음파를 측정하여 혈류 속도(blood flow rate), 혈관 지름(blood vessel diameter), 혈관 면적(blood vessel area), 혈류량(blood flow amount)을 측정한 후, 70% FeCl3를 적신 filter paper(3×5 mm)를 10분간 접촉시켜 유지하였다.
- 이중에 EtOAc 분획물(1.2 g)을 Sephadex LH-20와 메탄올로 column chromatography(35×3.0 cm)를 실시하여 TLC(silica gel 60F254, 전개용매 toluene : EtOAc : formic acid=5:4:1, v/v) 패턴에 따라 6개의 분획(E1~E6)으로 나누었다.
- 대조군과 각 실험군의 반응액은 2분간 3,000×g로 원심분리 하여 상층액을 얻은 후 Hseu 등(20)의 방법에 따라 ELISA reader(Molecular Devies, Sunnyvale, CA, USA) 로 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 적혈구 용혈에대한 참고 값(100% 용혈)은 AAPH(50 mM)의 흡광도를 기준으로 하여 정하였다.
- ) 품종으로 2012년 5월 말~6월 초에 채취하였다. 채취된 포도 잎은 즉시 신선한 물로 세척한 후 건조하여 분말화 하였고 1,000 g을 정량하여 80% 에탄올 7 L와혼합하여 실온에서 7일간 방치하여 추출하였다. 7일간 방치한 후 용액을 취하여 3,000 rpm으로 원심 침전시키고 상층액만 취하여 0.
- 추출물을 증류수에 현탁시키고 동량의 n-hexane, CH2Cl2, EtOAc 및 n-BuOH의 순으로 용매 분획하여 13.2 g, 1.48 g, 1.32 g 및 6.31 g의 분획물을 각각 얻었다. 이중에 EtOAc 분획물(1.
- 표준물질로 tetraethoxypropane을 사용하였고, 원심분리(12,000×g, 10분) 후 상층액의 과산화물의 량은 MDA의 몰 흡광계수(OD535)를 이용하여 결정하였다.
- 4)에 고정하고 파라핀에 포매한 후 절편(두께 5 μm)을 제작하였다. 혈관 조직의 조직학적 변화를 관찰하기 위해 hematoxylin-eosin 염색을 실시하여 binocular microscopy(Leica DMRB, Wetzlar, Germany)를 이용하여 관찰하였다.
- 혈전유발 부위 혈관의 조직학적 관찰을위해 혈관 양쪽을 단단히 고정하고 경동맥을 3~4 mm 적출하여 4% paraformaldehyde(pH 7.4)에 고정하고 파라핀에포매한 후 절편(두께 5 μm)을 제작하였다.
- 혈전을 유발하기 전, 랫트의 체중을 측정하고 Zoletil(100μL/체중 100 g, 복강투여)로 마취한 후 체온조절장치에 고정하여 수술을 진행하였다.
- 그 후 filter paper를 제거하고 초음파를 측정하여 혈전유발을 확인하고 수술부위를 봉합하였다. 혈전이 유발된 랫트에서 항혈전 효과를 관찰하기 위해서 Normal(정상군), Control(혈전유발군), VGLE(혈전유발+VGLE 투여군)와 VGLR(혈전유발+VGLR 투여군) 그룹으로 나누어 실험하였고, VGLE는 체중 kg당 200 mg, VGLR은 체중 kg당 5 mg씩1일 1회 20일 동안 경구투여 하였다.
대상 데이터
- Heparin sodium salt, 2,2'-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride(AAPH), Drabkin's reagent, BrijⓇ L23 solution, iron(II) chloride hexahydrate(FeCl3), potassium ferricyanide, potassium persulfate, trichloroacetic acid(TCA), 2-thiobarbituric acid(TBA), phosphoric acid, tetraethoxypropane, 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB), sodium citrate, meta-phosphoric acid, ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), sodium chloride(NaCl), sodium phosphate dibasic(Na2HPO4), zoletil 및 기타 시약은 reagent grade로 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
- Rodent Chow(#38057), carbohydrates: 63.07%, fat: 12.41%, protein: 24.52%)와 물을자유롭게 섭취하도록 하였으며, 사육환경 온도 23±3°C, 밤낮주기(12시간)가 조절되는 환경에서 사육하였으며 전주대학교 실험동물위원회의 실험 규정에 준하여 실행하였다(#2011-005).
- 실험에 사용한 포도 잎은 전라북도 정읍시 신태인읍 백산리 희망농원에서 재배된 남항(Vitis romaneti Roman. du Caill. ex Planch.) 품종으로 2012년 5월 말~6월 초에 채취하였다. 채취된 포도 잎은 즉시 신선한 물로 세척한 후 건조하여 분말화 하였고 1,000 g을 정량하여 80% 에탄올 7 L와혼합하여 실온에서 7일간 방치하여 추출하였다.
- 용혈 및 지질과산화 실험에 사용할 혈액채취와 혈전 유발동물모델 제작에 필요한 실험동물은 무균환경에서 사육된 8주령 수컷 Sprague Dawley rat(SD rat, 240~290 g)로중앙실험동물(서울)로부터 구입하였다. 1주일의 순화기간을 거친 후 무작위로 군을 배정한 다음 실험에 사용하였다.
- 회전진공농축기(Eyela A-1000S, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 감압농축 한 후, 동결건조기(Eyela, FDU-2100, Tokyo Rikakikai Co.)로 -70°C에서 동결 건조하였으며 약95.7 g 얻은 후 -20°C에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험값은 3반복 실험한 값을 평균±표준오차로 표시하였으며, 통계분석은 ANOVA와 Student's t-test로 처리하였으며, 유의성 한계는 P<0.05로 정하였다.
이론/모형
- 대조군과 각 실험군의 반응액은 2분간 3,000×g로 원심분리 하여 상층액을 얻은 후 Hseu 등(20)의 방법에 따라 ELISA reader(Molecular Devies, Sunnyvale, CA, USA) 로 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 헤파린이 처리된 랫트 혈액을 1,500×g에서 10분간 원심분리 하여 혈장(plasma)을 얻었고, 혈장의 지질과산화의 지표물질로 알려진 TBARS(MDA)는 Hseu 등(20)의 방법에따라 측정하였다.
- 혈액은 혈관 초음파 측정 후에 복대정맥에서 채취하여 실온에서 30분간 방치한 후 1,500×g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 얻었고 분석 시까지 -80°C에서 보관하였다. 혈청 내 중성지방, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 농도는 표준 효소비색법에 의한 kit(Asan Co., Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였고 LDL-콜레스테롤은 Friedewald 식(21) {총 콜레스테롤－(HDL-콜레스테롤+중성지방/5)}에 의하여 계산하였다.
성능/효과
- VGLE 50.0 μg/mL와 100 μg/mL 처리하였을 때 각각 26.7%(P<0.05), 33.3%(P<0.05)가 억제되었고 200 μg/mL와 400 μg/mL 처리하였을 때 각각48.3%(P<0.01), 53.3%(P<0.01)가 억제된 것으로 나타났다.
- VGLE를 각각 100 μg/ mL, 200 μg/mL, 400 μg/mL 처리하였을 때 MDA 생성이각각 16.9%(P<0.05), 26.0%(P<0.01), 46.8%(P<0.01) 억제되었고, VGLR을 3.125 μg/mL, 6.25 μg/mL, 12.5 μg/ mL 처리하였을 때 MDA 생성이 각각 11.7%(P<0.05), 23.4%(P<0.05), 35.1%(P<0.01) 억제되었으며 특히 25.0 μg/ mL 처리하였을 때에는 52.0%(P<0.001)로 현저하게 억제되어 지질과산화에 대한 억제 효과가 매우 우수한 것을 확인하였다.
- 그 결과 Fig. 3과 같이 AAPH를 2시간 처리하였을 때 1 L당 혈장의 MDA가 38.9±1.5 μM로 높게 형성된 반면, VGLE 및 VGLR을 처리한 결과 농도 의존적으로 MDA 생성이 현저히 억제되었다.
- 그러므로 본 연구에서는 VGLE와 VGLR의 투여가 혈행 개선에 어떠한 영향을 미치는가를 알아보기 위하여 경동맥에 FeCl3를처리하고 20일간 VGLE(200 mg/kg/day)와 VGLR(5 mg/ kg/day)을 투여하고 초음파 장비를 활용하여 먼저 doppler 양상을 비교하였다. 그 결과 Fig. 4와 같이 경동맥 혈관 손상 및 혈전을 유발하기 전의 Normal군의 혈관상태와 혈류는정상 상태의 doppler를 보였지만, FeCl3를 처리하여 혈관손상 및 혈전을 유발한 후 doppler는 정상에 비해 현저히 억제되는 것을 확인하였다. 그러나 VGLE 및 VGLR을 20일 동안 1일 1회 투여한 후 doppler를 관찰한 결과 Control군에 비해 혈관 및 혈류가 개선된 것을 확인하였다.
- 처리에 의한 혈전을 유발하고 VGLE 및 VGLR을 투여한 후 최종일에 초음파 장비를 이용하여 혈류속도, 혈관 지름, 혈관 면적, 혈류량을 측정하였다. 그 결과 Fig. 5와 같이 Normal군에 비해 Control군에서 모든 수치가 유의하게 감소하였고, VGLE군 및 VGLR군에서 유의적으로 혈행이 개선된 것을 확인하였다. 특히 VGLR을 투여한 군에서는 4가지 지표 모두 Normal군과 비슷한 수준으로 혈행이 개선되었음을 확인하였다.
- 를 이용한 경동맥 혈관 손상 후 20일 동안 VGLE 및 VGLR을 투여한 후 경동맥의 조직학적 변화를 알아보기 위하여 H&E 염색을 실시하였다. 그 결과 Fig. 6과 같이 Control군은 Normal군에 비해 혈관내의 교원 섬유 부분이 상당히 손상되고 두터워졌으며 혈관 내에 상당량의 혈전이 침착되었으나, VGLE를 투여함으로써 혈전 생성이 감소되고 혈관내의 교원 섬유의 손상도 억제되는 것을 확인하였다. 특히 VGLR을 투여한 군은 혈관 손상 및 혈전이 현저하게 억제된 것을 확인할 수 있었다.
- 그 결과 Table 1과 같이 Normal군, Control군, VGLE군 및 VGLR군에 있어서 식이섭취량은 유의한 변화가 없었지만, 20일간 체중증가량(body weight gain)은 Normal군(29.37±3.29 g)에비해서 Control군은 35.82±1.70 g으로 증가하였다(P<0.05).
- 그러므로 본 연구는 남항 포도 잎 추출물(VGLE)과 본 품종유래 지표물질인 resveratrol(VGLR)을 활용하여 AAPH로유도된 적혈구 및 혈장의 산화적 손상에 대한 항산화 효과와 FeCl3로 유도된 경동맥 혈전 모델에서 혈행개선과 혈청학적변화에 대한 효과를 조사하였다. 그 결과 VGLE 및 VGLR은적혈구 및 혈장의 산화적 손상과 혈전을 억제함으로써 혈행을 개선할 수 있는 효과가 있었다. 특히 VGLR은 혈청학적으로 혈전모델에서 Normal군과 유사한 혈청학적 개선 효과를 보였다.
- 즉 대조군의 경우 AAPH로 4시간 동안 처리하였을 때 적혈구가 100% 용혈되었다. 그러나 VGLE 또는 VGLR을 농도별로 30분 동안 처리하고 AAPH를 처리한 후적혈구의 용혈률을 조사한 결과 Fig. 2와 같이 농도 의존적으로 현저히 억제되었다. VGLE 50.
- 이러한 이유를 알아보기 위해서 본 연구는 혈청학적인 변화를 조사한 결과 Normal군에 비해서 Control군은 고밀도지단백 (high density lipoprotein, HDL) 콜레스테롤은 큰 차이가없었지만, 중성지방(triglyceride), 총 콜레스테롤(total cholesterol) 및 저밀도지단백(low density lipoprotein, LDL) 콜레스테롤은 유의하게 증가하였다. 그러나 VGLE 또는 VGLR을 투여한 실험군에서는 중성지방, 총 콜레스테롤및 LDL-콜레스테롤은 유의하게 감소되었다. 특히 VGLR을투여한 실험군의 혈청 중 중성지방, 총 콜레스테롤 및 LDL콜레스테롤은 Normal군과 유사하였다.
- 4와 같이 경동맥 혈관 손상 및 혈전을 유발하기 전의 Normal군의 혈관상태와 혈류는정상 상태의 doppler를 보였지만, FeCl3를 처리하여 혈관손상 및 혈전을 유발한 후 doppler는 정상에 비해 현저히 억제되는 것을 확인하였다. 그러나 VGLE 및 VGLR을 20일 동안 1일 1회 투여한 후 doppler를 관찰한 결과 Control군에 비해 혈관 및 혈류가 개선된 것을 확인하였다.
- 포도 유래 resveratrol은 만성적 허혈증(chronic ischemia) 모델동물에서 경구투여 할 경우 혈관 내피세포 성장인자를 자극하여 혈관 손상을 개선시키는 것으로 알려져 있으며(24), 인체에 resveratrol을 투여할 경우 대외 피질 혈관의 혈행을 개선시키는 것으로 알려져 있다(25). 그러므로 본 연구에서 사용된 남항 유래 resveratrol인 VGLR은 FeCl3 처리에 의한 혈관 손상 및 혈전에 대해서 효과적으로 개선시킬 수 있다는 것을 제시해 주었다. 더불어 VGLE는 FeCl3 처리에 의한 혈관 손상 및 혈전에 대해서 그 효과가 VGLR에 비해서 약간 낮았을 지라도 Control군에 비해 모든 지표가 개선되는 효과가 있었다.
- 그러므로 본 연구에서 사용된 남항 유래 resveratrol인 VGLR은 FeCl3 처리에 의한 혈관 손상 및 혈전에 대해서 효과적으로 개선시킬 수 있다는 것을 제시해 주었다. 더불어 VGLE는 FeCl3 처리에 의한 혈관 손상 및 혈전에 대해서 그 효과가 VGLR에 비해서 약간 낮았을 지라도 Control군에 비해 모든 지표가 개선되는 효과가 있었다. 이와 같은 VGLE의 혈행개선 효과는 포도 잎에 함유된 미량의 resveratrol뿐만 아니라 quercetin과 kaempferol과 같은 flavonoid 계열의 화합물을 함유하고 있기 때문일 것으로 사료된다.
- 특히 VGLR을 투여한 군은 혈관 손상 및 혈전이 현저하게 억제된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 실험을 통해 VGLE 및 VGLR 투여에 따라 항혈전 효과가 우수하였음을 확인할 수 있었다.
- 특히 VGLR은 혈청학적으로 혈전모델에서 Normal군과 유사한 혈청학적 개선 효과를 보였다. 이러한 결과는 VGLE 및 VGLR은 항산화제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 혈행장애로 유발될 수 있는 심혈관계 및 뇌혈관계질환을 예방하거나 개선할 수 있는 물질이라는 것을 제시해주었다. 이와 관련된 VGLE 및 VGLR의 기능성에 대해서는 앞으로 분자생화학적 수준에서 더 연구해야할 필요성이 있을 것으로 사료된다.
- 05). 이러한 이유를 알아보기 위해서 본 연구는 혈청학적인 변화를 조사한 결과 Normal군에 비해서 Control군은 고밀도지단백 (high density lipoprotein, HDL) 콜레스테롤은 큰 차이가없었지만, 중성지방(triglyceride), 총 콜레스테롤(total cholesterol) 및 저밀도지단백(low density lipoprotein, LDL) 콜레스테롤은 유의하게 증가하였다. 그러나 VGLE 또는 VGLR을 투여한 실험군에서는 중성지방, 총 콜레스테롤및 LDL-콜레스테롤은 유의하게 감소되었다.
- 6과 같이 Control군은 Normal군에 비해 혈관내의 교원 섬유 부분이 상당히 손상되고 두터워졌으며 혈관 내에 상당량의 혈전이 침착되었으나, VGLE를 투여함으로써 혈전 생성이 감소되고 혈관내의 교원 섬유의 손상도 억제되는 것을 확인하였다. 특히 VGLR을 투여한 군은 혈관 손상 및 혈전이 현저하게 억제된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 실험을 통해 VGLE 및 VGLR 투여에 따라 항혈전 효과가 우수하였음을 확인할 수 있었다.
- 5와 같이 Normal군에 비해 Control군에서 모든 수치가 유의하게 감소하였고, VGLE군 및 VGLR군에서 유의적으로 혈행이 개선된 것을 확인하였다. 특히 VGLR을 투여한 군에서는 4가지 지표 모두 Normal군과 비슷한 수준으로 혈행이 개선되었음을 확인하였다. 포도 유래 resveratrol은 만성적 허혈증(chronic ischemia) 모델동물에서 경구투여 할 경우 혈관 내피세포 성장인자를 자극하여 혈관 손상을 개선시키는 것으로 알려져 있으며(24), 인체에 resveratrol을 투여할 경우 대외 피질 혈관의 혈행을 개선시키는 것으로 알려져 있다(25).
후속연구
- 이러한 결과는 VGLE 및 VGLR은 항산화제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 혈행장애로 유발될 수 있는 심혈관계 및 뇌혈관계질환을 예방하거나 개선할 수 있는 물질이라는 것을 제시해주었다. 이와 관련된 VGLE 및 VGLR의 기능성에 대해서는 앞으로 분자생화학적 수준에서 더 연구해야할 필요성이 있을 것으로 사료된다.
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