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문제 정의
- 이상의 결과에서 알 수 있듯 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸은 모두 뇌혈류 개선 및 뇌손상 회복에 유의한 효과를 보였다. 그러나 그 중에서도 十全大補湯加鹿茸이 뇌손상시 뇌조직에 대해 면역 양성 반응을 나타내면서 허혈시 불안정하게 나타난 국소 뇌혈류량을 개선시켜 본 저자는 十全大補湯加鹿茸이 뇌혈류역학에 미치는 작용기전을 알아보고자 하였다.
- 그리하여 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸을 각각 정상 흰쥐에 투여한 후 국소 뇌혈류량과 평균 혈압에 미치는 효과를 관찰하고, 중대뇌동맥을 폐색시킨 뇌허혈 흰쥐의 국소 뇌혈류량 변동 개선 효과와 뇌허혈로 인해 손상된 뇌조직의 회복 효과를 비교한 후 국소 뇌혈류량과 평균 혈압에 미친 작용기전을 관찰한 결과 유의성을 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- BDNF의 발현 정도는 면역조직화학법으로 처리한 조직절편을 광학현미경 (×200) 하에서 해마 CA1부위를 관찰하였으며, 다음과 같이 반정량적 방법 (semiquantitative manner)으로 구분하여 mild (+), moderate (++), severe (+++)로 평가하였다.
- 이후 Streptavidin/peroxidase를 실온에서 10분간 처리하고 털어낸 다음 tap water로 씻어내었다. DAB (3,3-Diaminobenzidine, 60382248, ZYMED Lab, Germany)로 발색시키고, 증류수로 10분씩 3회 수세한 다음 대조염색을 위해 Hematoxylin으로 3분간 염색한 후 흐르는 물에 수세하고 80%, 90%, 100% 에탄올에 각각 2분, xylene에 2회씩 10분을 거쳐 탈수시켰다. 이후 모든 슬라이드에 perment mounting media를 이용하여 봉입을 실시하였다.
- 이때 두개골의 두께를 최대한 얇게 남겨 경막외 출혈을 방지토록 하였다. Laser doppler flowmeter (Transonic Instrument, U.S.A.)용 직경 0.8 ㎜의 needle probe를 대뇌 두정엽 피질 표면에 수직이 되도록 stereotaxic micromanipulator를 사용하여 뇌연막 동맥에 조심스럽게 근접시켰다. 일정 시간 동안 안정시킨 후 실험 절차에 따라 각각의 시료를 용량별 (0.
- 그 후 적출한 뇌는 rodent brain matrix (RBM-4000C, ASI Instruments, Warrin, MI, USA)를 이용하여 정면 극단으로부터 1 ㎜되는 곳부터 2 ㎜ 간격으로 두정면을 따라 절편하였다. TTC (Sigma, Inc., St. Louis, MO, USA)를 2% PBS에 완전히 용해시킨 용액에 절편들을 침수시켜 37℃ 배양기에서 약 30분간 염색한 다음 다시 10% PBS로 옮겨 고정하였다.
- 十全大補湯 (SDT) 2첩 분량 88.0 g과 十全大補湯加鹿茸 (GST) 2첩 분량 96.0 g을 각각 증류수 1,200 ㎖과 함께 전기약탕기 (대웅, 한국)로 180분간 전탕하여 얻어진 추출액을 거즈로 거른 다음, 원심분리기 (Eppendrof, Germany)를 이용하여 5,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 찌꺼기를 버리고 상층액을 얻었다. 얻어진 상층액은 감압농축기 (EYELA, Japan)를 이용하여 감압 농축한 다음, 동결건조하여 최종적으로 SDT 15.
- 十全大補湯 (SDT)과 十全大補湯加鹿茸 (GST)이 뇌허혈로 손상된 흰쥐의 뇌조직에 미치는 회복 효과를 확인하기 위해 TTC 염색하였다.
- 十全大補湯 (SDT)과 十全大補湯加鹿茸 (GST)이 정상 흰쥐의 국소 뇌혈류량에 미치는 효과를 알아보기 위하여 SDT와 GST를 용량별(0.01, 0.1, 1.0, 10.0 ㎎/㎏, i.p.)로 투여한 다음 변화되는 국소 뇌혈류량을 관찰한 결과 다음과 같았다.
- 十全大補湯 (SDT)과 十全大補湯加鹿茸 (GST)이 정상 흰쥐의 평균 혈압에 미치는 효과를 알아보기 위하여 SDT와 GST를 용량별(0.01, 0.1, 1.0, 10.0 ㎎/㎏, i.p.)로 투여한 다음 변화되는 평균 혈압을 관찰한 결과 다음과 같았다.
- 十全大補湯 (SDT)와 十全大補湯加鹿茸 (STC)이 뇌허혈로 손상된 흰쥐의 뇌조직에 미치는 회복 효과를 확인하기 위하여 면역 반응을 검사하였다.
- 十全大補湯加鹿茸 (GST) 투여로 변화된 국소 뇌혈류량의 작용기전을 알아보기 위하여 GST 투여로 유의성 있게 증가된 정상 흰쥐의 국소 뇌혈류량을 대조군 (GST)으로, cyclooxygenase의 억제제인 인도메타신을 전처치한 다음 GST (0.01, 0.1, 1.0, 10.0 ㎎/㎏, i.p.) 투여로 변화된 정상 흰쥐의 국소 뇌혈류량을 인도메타신 처치군 (GST+IDN)으로, guanylate cyclase의 억제제인 메틸렌블루를 전처치한 다음 GST (0.01, 0.1, 1.0, 10.0 ㎎/㎏, i.p.) 투여로 변화된 정상 흰쥐의 국소 뇌혈류량을 메틸렌블루 처치군 (GST+MTB)으로 하였다.
- 十全大補湯加鹿茸 (GST) 투여로 변화된 평균 혈압의 작용기전을 알아보기 위하여 GST 투여로 감소된 정상 흰쥐의 평균 혈압을 대조군 (GST)으로, cyclooxygenase의 억제제인 인도메타신을 전처치한 다음 GST (0.01, 0.1, 1.0, 10.0 ㎎/㎏, i.p.) 투여로 변화된 정상 흰쥐의 평균 혈압을 인도메타신 처치군 (GST+IDN)으로, guanylate cyclase의 억제제인 메틸렌블루를 전처치한 다음 GST (0.01, 0.1, 1.0, 10.0 ㎎/㎏, i.p.) 투여로 변화된 정상 흰쥐의 평균 혈압을 메틸렌블루 처치군 (GST+MTB)으로 하였다.
- 十全大補湯加鹿茸 (GST)이 정상 흰쥐의 뇌혈류역학 변화에 미치는 작용 기전을 알아보기 위하여 두 가지 혈관 확장 인자 억제제23,24)를 전처치하였다. 혈관 확장 인자 억제제 중 cyclic 3',5'-guanosine monophosphate (cGMP)의 생합성효소 guanylate cyclase의 억제제인 메틸렌블루 (methylene blue, MTB, 0.
- 각 실험군은 실험 종료 후 전신 마취제인 럼푼 (Rompun, 바이엘코리아) 복강주사 (0.6 ㎎/㎏)하여 마취시킨 후, 심장관류를 통해 0.9% 생리식염수와 4% 중성 paraformaldehyde로 前 고정하였다. 그 후 단두하여 골 절단기를 이용해 두개골을 제거하고 시신경, 후각신경 및 그 외 뇌신경들을 절단한 후에 전체 뇌를 적출하였다.
- 각 실험군의 BDNF 발현을 관찰하기 위해 슬라이드에 놓여진 뇌 절편을 각 5분간 3회의 xylene을 적용하여 파라핀을 제거하고, 100%, 90%, 80% 알코올을 단계적으로 적용시켜 재수화 (rehydration)하였다. Tap water로 짧게 rinse한 후 PBS로 수세하고, 0.
- 5℃로 유지될 수 있도록 따뜻한 전기 열 패드 위에 복와위로 고정시켰다. 각각의 시료 투여 용량 (0.01 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏, 10.0 ㎎/㎏, i.p.)에 따른 평균 혈압 변화는 흰쥐의 대퇴동맥에 삽입된 polyethylene tube에 연결된 pressure transducer (Grass, U.S.A.)를 통하여 MacLab과 macintosh computer로 구성된 data acquisition system으로 측정하였다19).
- 국소 허혈성 뇌손상 유발 확인을 위해 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 염색을 하였다. 상기 방법에 따라 뇌 적출을 실시하고 5분간 냉각된 phosphate-buffered saline (PBS)에 담가두었다.
- 9% 생리식염수와 4% 중성 paraformaldehyde로 前 고정하였다. 그 후 단두하여 골 절단기를 이용해 두개골을 제거하고 시신경, 후각신경 및 그 외 뇌신경들을 절단한 후에 전체 뇌를 적출하였다. 뇌를 적출하여 육안으로 손상 및 크기의 변화 등을 관찰하고, 조직 절편 제작 전까지 10% 중성 파라포름 알데하이드에 24시간 이상 後 고정한 다음 파라핀으로 포매시켜 전두엽 최첨단에서부터 180 ㎛ 간격을 두고 두께 5 ㎛로 박절하였다.
- 상기 방법에 따라 뇌 적출을 실시하고 5분간 냉각된 phosphate-buffered saline (PBS)에 담가두었다. 그 후 적출한 뇌는 rodent brain matrix (RBM-4000C, ASI Instruments, Warrin, MI, USA)를 이용하여 정면 극단으로부터 1 ㎜되는 곳부터 2 ㎜ 간격으로 두정면을 따라 절편하였다. TTC (Sigma, Inc.
- 그 후 단두하여 골 절단기를 이용해 두개골을 제거하고 시신경, 후각신경 및 그 외 뇌신경들을 절단한 후에 전체 뇌를 적출하였다. 뇌를 적출하여 육안으로 손상 및 크기의 변화 등을 관찰하고, 조직 절편 제작 전까지 10% 중성 파라포름 알데하이드에 24시간 이상 後 고정한 다음 파라핀으로 포매시켜 전두엽 최첨단에서부터 180 ㎛ 간격을 두고 두께 5 ㎛로 박절하였다. 박절한 뇌 절편은 손상 부위의 면적 및 세포들의 조직형태학적 구조를 관찰하기 위해 젤라틴으로 코팅 처리된 슬라이드에 부착시켜 BDNF (brain-derived neurotrophic factor) 발현을 알아보고자 면역조직화학염색을 실시하고, 통상의 탈수와 투명화 과정을 거쳐 광학현미경적 관찰을 위해 봉입을 실시하였다.
- 뇌허혈 유발 흰쥐의 국소 뇌혈류량 변동에 미치는 十全大補湯 (SDT)의 개선 효과를 관찰하기 위하여 중대뇌동맥 폐색법으로 뇌허혈을 유발시킨 흰쥐에게 SDT 10.0 ㎎/㎏ (i.p.)을 투여한 다음 재관류 후에 변동되는 국소 뇌혈류량을 관찰하였다.
- 뇌허혈 유발 흰쥐의 국소 뇌혈류량 변동에 미치는 十全大補湯加鹿茸 (GST)의 개선 효과를 관찰하기 위하여 중대뇌동맥 폐색법으로 뇌허혈을 유발시킨 흰쥐에게 GST 10.0 ㎎/㎏ (i.p.)을 투여한 다음 재관류 후에 변동되는 국소 뇌혈류량을 관찰하였다.
- 실험군은 뇌허혈을 유발시키지 않고 생리 식염수를 투여한 정상군, 뇌허혈을 유발시킨 후 생리 식염수를 투여한 대조군, 뇌허혈을 유발시킨 후 SDT 10.0 ㎎/㎏ (i.o.)을 투여한 실험군 A, 뇌허혈을 유발시킨 후 GST 10.0 ㎎/㎏ (i.o.)을 투여한 실험군 B로 분류하였다. 뇌허혈 유발 후 신경학적 검사는 Bederson 등의 방법21)에 따라 공중에서 흰쥐의 꼬리를 완전히 들었을 때 일측에서 마비증상이 일어나는지와 꼬리를 위로 들었을 때 또는 자발적으로 환측으로의 몸통휘기 (circling)가 일어나는지 검사를 하였다(Table 2).
- 실험군은 뇌허혈을 유발시키지 않고 생리 식염수를 투여한 정상군, 뇌허혈을 유발시킨 후 생리 식염수를 투여한 대조군, 뇌허혈을 유발시킨 후 SDT 10.0 ㎎/㎏ (i.o.)을 투여한 실험군 A, 뇌허혈을 유발시킨 후 GST 10.0 ㎎/㎏ (i.o.)을 투여한 실험군 B로 분류하였다. 뇌허혈 유발 후 신경학적 검사는 Bederson 등의 방법21)에 따라 공중에서 흰쥐의 꼬리를 완전히 들었을 때 일측에서 마비증상이 일어나는지와 꼬리를 위로 들었을 때 또는 자발적으로 환측으로의 몸통휘기 (circling)가 일어나는지 검사를 하였다(Table 2).
- 뇌허혈을 유발시킨 후 생리 식염수를 투여한 다음 측정한 국소 뇌혈류량의 변동을 대조군으로, 뇌허혈을 유발시킨 후 GST를 투여한 다음 측정한 국소 뇌혈류량의 변동을 실험군 B로 하였다.
- 뇌허혈을 유발시킨 후 생리 식염수를 투여한 다음 측정한 국소 뇌혈류량의 변동을 대조군으로, 뇌허혈을 유발시킨 후 SDT를 투여한 다음 측정한 국소 뇌혈류량의 변동을 실험군 A로 하였다.
- 뇌허혈을 유발시킨 후 생리 식염수를 투여한 대조군과 실험 절차에 따라 SDT 10 ㎎/㎏ (i.p.)을 투여한 실험군 A, GST 10 ㎎/㎏ (i.p.)을 투여한 실험군 B로 분류하였다. 흰쥐를 만능 고정대 (DKI, U.
- 에 따라 중대뇌동맥 (MCA, middle cerebral artery) 폐색법을 이용하였다. 동물 사육장에서 적응된 흰쥐를 마취 챔버 (Royal medical, Korea)에 넣고, 70% N2O와 28.5% O2 가스에 1.5% 엔프루란을 혼합시킨 마취가스로 흡입전신마취 후 수술대에 고정시키고, 다시 마스크로 1.5～2.0% 엔프루란을 흡입시켜 수술 중 마취가 지속되도록 하였다. 체온저하를 막기 위해 수술시 직장온도계와 전기 열 패드를 이용하여 체온을 37±0.
- 마취 후 흰쥐 경부의 중앙선을 따라 절개시킨 후 좌측 총경동맥을 조심스럽게 미주신경과 분리시켜 노출시켰다. 총경동맥으로부터 외경동맥과 내경동맥을 주변 신경으로부터 분리해내고, 박리한 총경동맥, 외경동맥 및 내경동맥에 미리 실로 느슨하게 걸어 놓았다.
- 실험에 사용한 흰쥐는 신경학적 증상이 나타나는 개체만을 선별하여 사용하였으며, 실험군별로 28일간 각각의 시료를 투여하였다. 면역조직화학적 검사는 실험 종료 후 희생시켜 표본을 제작ㆍ검사하였다.
- 뇌를 적출하여 육안으로 손상 및 크기의 변화 등을 관찰하고, 조직 절편 제작 전까지 10% 중성 파라포름 알데하이드에 24시간 이상 後 고정한 다음 파라핀으로 포매시켜 전두엽 최첨단에서부터 180 ㎛ 간격을 두고 두께 5 ㎛로 박절하였다. 박절한 뇌 절편은 손상 부위의 면적 및 세포들의 조직형태학적 구조를 관찰하기 위해 젤라틴으로 코팅 처리된 슬라이드에 부착시켜 BDNF (brain-derived neurotrophic factor) 발현을 알아보고자 면역조직화학염색을 실시하고, 통상의 탈수와 투명화 과정을 거쳐 광학현미경적 관찰을 위해 봉입을 실시하였다.
- 본 실험에서 사용한 十全大補湯 (Sibjeondaebo-tang, SDT)의 구성은 『東醫寶鑑』 에 준11)하였고, 十全大補湯에 鹿茸 4 g을 첨가하여 加味十全大補湯 (Sibjeondaebo-tang adding Cervi Pantotrichum Cornu, Gamy-Sibjeondaebo-tang, GST)을 구성하였다. 실험에 사용된 약재는 동신대학교 부속광주한방병원에서 구입하였으며, 처방 내용 및 생약명13)은 다음과 같다(Table 1)
- 실험군은 뇌허혈을 유발시키지 않고 생리 식염수를 투여한 정상군, 뇌허혈을 유발시킨 후 생리 식염수를 투여한 대조군, 뇌허혈을 유발시킨 후 SDT 10.0 ㎎/㎏ (i.o.)을 투여한 실험군 A, 뇌허혈을 유발시킨 후 GST 10.0 ㎎/㎏ (i.o.)을 투여한 실험군 B로 분류하였다. 뇌허혈 유발 후 신경학적 검사는 Bederson 등의 방법21)에 따라 공중에서 흰쥐의 꼬리를 완전히 들었을 때 일측에서 마비증상이 일어나는지와 꼬리를 위로 들었을 때 또는 자발적으로 환측으로의 몸통휘기 (circling)가 일어나는지 검사를 하였다(Table 2).
- 총경동맥과 외경동맥을 미리 걸어 놓은 실로 결찰하고, 내경동맥 분지는 미세혈관클립을 사용하여 결찰하였다. 외경동맥을 통하여 내경동맥내로 1.5 ㎝ 길이의 3-0 단선조 나일론 봉합사에 실리콘 (Xantopren, Bayer Dental, Germany)으로 16 ㎜ 길이로 코팅하여 만든 probe를 내경동맥 쪽으로 밀어 넣고 내경동맥에 걸어 둔 실을 묶어 probe를 고정한 후 미세클립을 제거하였다. 재관류는 중대뇌동맥 폐쇄 120분 후 봉합사를 제거하였다.
- )에 고정시키고 정중선을 따라 두피를 절개하여 두정골을 노출시킨 후 정수리 점의 4～6 ㎜ 측방, -2～1 ㎜ 전방에 직경 5～6 ㎜의 두개창 수술을 시행하였다. 이때 두개골의 두께를 최대한 얇게 남겨 경막외 출혈을 방지토록 하였다. Laser doppler flowmeter (Transonic Instrument, U.
- )에 고정시키고 정중선을 따라 두피를 절개하여 두정골을 노출시킨 후 정수리 점의 4～6 ㎜ 측방, -2～1 ㎜ 전방에 직경 5～6 ㎜의 두개창 수술을 시행하였다. 이때 두개골의 두께를 최대한 얇게 남겨 경막외 출혈을 방지하도록 하였다. Laser doppler flowmeter (Transonic Instrument, U.
- 이에 저자는 十全大補湯이 氣血을 雙補하는 대표적인 方劑이고, 鹿茸이 陽氣를 돋구어 血을 能히 生成할 수 있음은 물론 腎精을 補益함으로써 造血 및 抗老化에 작용하고 있어 十全大補湯에 鹿茸을 加味하게 되면 혈류장애로 인해 나타나는 뇌허혈 질환에 더욱 더 효과가 있을 것으로 생각하여 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸을 각각 정상 흰쥐에 투여한 후 국소 뇌혈류량과 평균 혈압에 미치는 효과를 관찰하고, 중대뇌동맥을 폐색시킨 뇌허혈 흰쥐의 국소 뇌혈류량 변동 개선 효과와 뇌허혈로 인해 손상된 뇌조직의 회복 효과를 비교한 후 국소 뇌혈류량과 평균 혈압에 미친 작용기전을 관찰하였다.
- DAB (3,3-Diaminobenzidine, 60382248, ZYMED Lab, Germany)로 발색시키고, 증류수로 10분씩 3회 수세한 다음 대조염색을 위해 Hematoxylin으로 3분간 염색한 후 흐르는 물에 수세하고 80%, 90%, 100% 에탄올에 각각 2분, xylene에 2회씩 10분을 거쳐 탈수시켰다. 이후 모든 슬라이드에 perment mounting media를 이용하여 봉입을 실시하였다. BDNF의 발현 정도는 면역조직화학법으로 처리한 조직절편을 광학현미경 (×200) 하에서 해마 CA1부위를 관찰하였으며, 다음과 같이 반정량적 방법 (semiquantitative manner)으로 구분하여 mild (+), moderate (++), severe (+++)로 평가하였다.
- 일정 시간 동안 안정시킨 후 뇌허혈을 유발시킨 다음 120분 후에 혈류를 재관류시켰다. 이후 실험 절차에 따라 각각의 시료 (10.0 ㎎/㎏, i.p.)를 투여한 후 변동되는 국소 뇌혈류량 (regional cerebral blood flow, rCBF)을 240분간 측정하였다19).
- 8 ㎜의 needle probe를 대뇌 두정엽 피질 표면에 수직이 되도록 stereotaxic micromanipulator를 사용하여 뇌연막 동맥에 조심스럽게 근접시켰다. 일정 시간 동안 안정시킨 후 실험 절차에 따라 각각의 시료를 용량별 (0.01 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏, 10.0 ㎎/㎏, i.p.)로 투여한 다음 변화되는 국소 뇌혈류량 (regional cerebral blood flow, rCBF)을 측정하였다19).
- 5 ㎝ 길이의 3-0 단선조 나일론 봉합사에 실리콘 (Xantopren, Bayer Dental, Germany)으로 16 ㎜ 길이로 코팅하여 만든 probe를 내경동맥 쪽으로 밀어 넣고 내경동맥에 걸어 둔 실을 묶어 probe를 고정한 후 미세클립을 제거하였다. 재관류는 중대뇌동맥 폐쇄 120분 후 봉합사를 제거하였다.
- 0 for windows program을 사용하여 실시하였다. 정상 및 뇌허혈이 유발된 흰쥐에서 국소 뇌혈류량 및 평균 혈압의 변화는 각각 30분 단위로 합산하여 통계 처리하였다. 모든 결과에 대한 통계처리 방법은 Student-Newman-Keuls multiple range test를 이용하여 p-value가 0.
- 총경동맥으로부터 외경동맥과 내경동맥을 주변 신경으로부터 분리해내고, 박리한 총경동맥, 외경동맥 및 내경동맥에 미리 실로 느슨하게 걸어 놓았다. 총경동맥과 외경동맥을 미리 걸어 놓은 실로 결찰하고, 내경동맥 분지는 미세혈관클립을 사용하여 결찰하였다. 외경동맥을 통하여 내경동맥내로 1.
- 혈관 확장 인자 억제제 중 cyclic 3',5'-guanosine monophosphate (cGMP)의 생합성효소 guanylate cyclase의 억제제인 메틸렌블루 (methylene blue, MTB, 0.01 ㎎/㎏, i.p., Sigma M9140)와 prostaglandin의 생합성효소 cyclooxygenase의 억제제인 인도메타신 (indomethacin, IDN, 1 ㎎/㎏, i.p., Sigma I7378)을 전처치한 후 실험 절차에 따라 GST를 용량별 (0.01 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏, 10.0 ㎎/㎏, i.p.)로 투여한 다음 변화되는 국소 뇌혈류량 및 평균 혈압을 측정하였다19).
- 흰쥐를 750 ㎎/㎏의 우레탄 (Sigma, U.S.A)으로 마취시킨 후 체온이 37±0.5℃로 유지될 수 있도록 따뜻한 전기 열 패드 위에 복와위로 고정시켰다.
- 흰쥐를 만능 고정대 (DKI, U.S.A.)에 고정시키고 정중선을 따라 두피를 절개하여 두정골을 노출시킨 후 정수리 점의 4～6 ㎜ 측방, -2～1 ㎜ 전방에 직경 5～6 ㎜의 두개창 수술을 시행하였다. 이때 두개골의 두께를 최대한 얇게 남겨 경막외 출혈을 방지토록 하였다.
대상 데이터
- 각 실험군의 절편들은 Gharbawie 등22)의 도보를 참고하여 정수리 점 후방 2 ㎜부위 인접조직을 선별하였다(Fig. 1).
- 동물은 체중 300 g 내외의 웅성 Sprague-Dawley계 흰쥐를 (주) 다물사이언스에서 구입하여 사용하였다. 동물은 항온항습 장치가 부착된 사육장에서 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경 (실내온도 24±2℃, 습도 55±5%, 12시간 명암주기)에 1주일 이상 적응시킨 후 사용하였다.
- 동물은 항온항습 장치가 부착된 사육장에서 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경 (실내온도 24±2℃, 습도 55±5%, 12시간 명암주기)에 1주일 이상 적응시킨 후 사용하였다.
- 하였고, 十全大補湯에 鹿茸 4 g을 첨가하여 加味十全大補湯 (Sibjeondaebo-tang adding Cervi Pantotrichum Cornu, Gamy-Sibjeondaebo-tang, GST)을 구성하였다. 실험에 사용된 약재는 동신대학교 부속광주한방병원에서 구입하였으며, 처방 내용 및 생약명13)은 다음과 같다(Table 1)
- 뇌허혈 유발 후 신경학적 검사는 Bederson 등의 방법21)에 따라 공중에서 흰쥐의 꼬리를 완전히 들었을 때 일측에서 마비증상이 일어나는지와 꼬리를 위로 들었을 때 또는 자발적으로 환측으로의 몸통휘기 (circling)가 일어나는지 검사를 하였다(Table 2). 실험에 사용한 흰쥐는 신경학적 증상이 나타나는 개체만을 선별하여 사용하였으며, 실험군별로 28일간 각각의 시료를 투여하였다. 면역조직화학적 검사는 실험 종료 후 희생시켜 표본을 제작ㆍ검사하였다.
- 0 g을 각각 증류수 1,200 ㎖과 함께 전기약탕기 (대웅, 한국)로 180분간 전탕하여 얻어진 추출액을 거즈로 거른 다음, 원심분리기 (Eppendrof, Germany)를 이용하여 5,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 찌꺼기를 버리고 상층액을 얻었다. 얻어진 상층액은 감압농축기 (EYELA, Japan)를 이용하여 감압 농축한 다음, 동결건조하여 최종적으로 SDT 15.8 g(수득율 18%), GST 20.1 g(수득율 20.9%)의 건조분말을 얻어 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 정상 및 뇌허혈이 유발된 흰쥐에서 국소 뇌혈류량 및 평균 혈압의 변화는 각각 30분 단위로 합산하여 통계 처리하였다. 모든 결과에 대한 통계처리 방법은 Student-Newman-Keuls multiple range test를 이용하여 p-value가 0.05 미만일 경우에만 유의한 것으로 인정하였다.
- 제시된 모든 결과에 대한 통계처리는 SPSS 10.0 for windows program을 사용하여 실시하였다. 정상 및 뇌허혈이 유발된 흰쥐에서 국소 뇌혈류량 및 평균 혈압의 변화는 각각 30분 단위로 합산하여 통계 처리하였다.
이론/모형
- )을 투여한 실험군 B로 분류하였다. 뇌허혈 유발 후 신경학적 검사는 Bederson 등의 방법21)에 따라 공중에서 흰쥐의 꼬리를 완전히 들었을 때 일측에서 마비증상이 일어나는지와 꼬리를 위로 들었을 때 또는 자발적으로 환측으로의 몸통휘기 (circling)가 일어나는지 검사를 하였다(Table 2). 실험에 사용한 흰쥐는 신경학적 증상이 나타나는 개체만을 선별하여 사용하였으며, 실험군별로 28일간 각각의 시료를 투여하였다.
- 뇌허혈 유발은 Longa 등의 방법20)에 따라 중대뇌동맥 (MCA, middle cerebral artery) 폐색법을 이용하였다. 동물 사육장에서 적응된 흰쥐를 마취 챔버 (Royal medical, Korea)에 넣고, 70% N2O와 28.
성능/효과
- GST 0.1 ㎎/㎏을 투여하였을 때의 국소 뇌혈류량은 112.85±5.08%로 기저치보다 유의성 (p<0.05) 있게 증가하였고, 이후 투여 용량을 증가시켜 GST 1.0 ㎎/㎏과 GST 10.0 ㎎/㎏을 투여하였을 때의 국소 뇌혈류량은 각각 120.73±8.81%와 133.29±10.99로 기저치보다 유의성 (p<0.01) 있게 증가하였다(Fig. 2).
- GST를 투여하지 않은 정상 흰쥐의 평균 혈압 기저치를 100.00±7.10%로 환산하였을 때, GST를 용량별(0.01, 0.1, 1.0, 10.0 ㎎/㎏, i.p.)로 투여한 다음 변화되는 평균 혈압은 각각 95.58±8.57%, 95.61±7.5 %, 95.52±6.52%, 95.12±6.20%로 기저치보다 감소하였다(Fig. 3).
- SDT를 투여하지 않은 정상 흰쥐의 국소 뇌혈류량 기저치를 100.00±3.73%로 환산하였을 때, SDT 0.01 ㎎/㎏을 투여하였을 때의 국소 뇌혈류량은 97.35±4.59%로 기저치보다 감소하는 경향이 나타났으나 SDT 0.1 ㎎/㎏을 투여하였을 때의 국소 뇌혈류량은 108.37±4.56%로 기저치보다 증가하였다.
- SDT를 투여하지 않은 정상 흰쥐의 평균 혈압 기저치를 100.00±6.9 %로 환산하였을 때, SDT를 용량별(0.01, 0.1, 1.0, 10.0 ㎎/㎏, i.p.)로 투여한 다음 변화되는 평균 혈압은 각각 96.75±7.76%, 96.61±7.89%, 97.12±9.34%, 98.07±7.24%로 기저치보다 감소하였다.
- TTC 염색 결과, 정상군은 뇌손상이 관찰되지 않았으나 대조군은 총경동맥 중 내경동맥에서 분지되어 중대뇌동맥에 혈액을 공급하는 곳을 중심으로 대뇌 신피질 (neocortex)의 많은 부분과 대뇌 두정엽 (parietal lobe)에서 심한 손상이 나타났다. 그러나 실험군 A와 실험군 B의 뇌조직은 대조군의 신피질과 대뇌 두정엽 부위에서 염색되지 않은 부분이 줄어들어 손상 정도가 호전된 것으로 나타났다(Fig.
- 十全大補湯加鹿茸으로 변화된 뇌혈류역학 작용기전을 관찰한 결과, 국소 뇌혈류량과 평균 혈압은 guanylate cyclase 억제제인 메틸렌블루를 전처치하였을 때 대조군에 비해 유의성 있게 변화되었다.
- 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸이 뇌허혈로 손상된 흰쥐의 뇌조직에 미치는 회복 효과를 확인하기 위해 TTC 염색을 실시한 결과, 대조군은 중대뇌동맥에 혈액을 공급하는 곳을 중심으로 대뇌 신피질의 많은 부분과 대뇌 두정엽에서 심한 손상 정도가 나타났으나 실험군 A와 실험군 B에서는 대조군에 비해 염색되지 않은 부위가 줄어들어 손상의 정도가 호전된 것으로 나타나(Fig. 6) 항허혈 효과가 있음을 육안적으로 관찰할 수 있었다. 또한 CA1 부위의 조직을 골라 BDNF에 대한 면역 반응을 검사한 결과, Hematoxylin 대조염색 시 대조군은 거의 낮은 면역반응을 보였다.
- 그러나 대조군의 국소 뇌혈류량은 재관류 후 120분간 기저치보다 각각 105.37±4.25%, 125.82±6.49%, 131.67±6.39%, 132.58±5.21%로 불안정한 증가상태를 나타내었고, 이후 재관류 시간이 경과될수록 각각 128.72±6.1 %, 123.46±4.8 %, 117.39±5.78%, 113.10±6.03%로 감소되는 경향을 보였으나 기저치보다는 불안정한 증가상태를 나타내었다.
- 그러나 대조군의 국소 뇌혈류량은 재관류 후 120분간 기저치보다 각각 105.37±4.25%, 125.82±6.49%, 131.67±6.39%, 132.58±5.21%로 불안정한 증가상태를 나타내었고, 이후 재관류 시간이 경과될수록 각각 128.72±6.11%, 123.46±4.88%, 117.39±5.78%, 113.10±6.03%로 감소되는 경향을 보였으나 기저치보다는 불안정한 증가상태를 나타내었다.
- TTC 염색 결과, 정상군은 뇌손상이 관찰되지 않았으나 대조군은 총경동맥 중 내경동맥에서 분지되어 중대뇌동맥에 혈액을 공급하는 곳을 중심으로 대뇌 신피질 (neocortex)의 많은 부분과 대뇌 두정엽 (parietal lobe)에서 심한 손상이 나타났다. 그러나 실험군 A와 실험군 B의 뇌조직은 대조군의 신피질과 대뇌 두정엽 부위에서 염색되지 않은 부분이 줄어들어 손상 정도가 호전된 것으로 나타났다(Fig. 6).
- 뇌허혈 흰쥐의 국소 뇌혈류량 변동을 관찰한 결과, 十全大補湯을 투여한 실험군 A와 十全大補湯加鹿茸을 투여한 실험군 B 모두에서 국소 뇌혈류량 변동은 대조군에 비해 개선되었고, 특히 실험군 B의 국소 뇌혈류량은 대조군에 비해 안정적으로 유의성 있게 개선되었다.
- 뇌허혈로 손상된 흰쥐의 뇌조직을 TTC 염색한 결과, 실험군 A와 실험군 B 모두에서 손상된 뇌조직이 대조군에 비해 호전되었다.
- 뇌허혈로 손상된 흰쥐의 해마 CA1 부위에서 BDNF에 대한 면역 반응을 검사한 결과, 실험군 A와 실험군 B 모두에서 면역 반응이 대조군에 비해 양성적으로 나타났으나 실험군 B는 대조군이나 실험군 A보다 높은 면역 양성 반응을 나타내었다.
- 뇌허혈이 유발된 상태에서 뇌혈류를 재관류시켰을 때 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸이 불안정한 뇌혈류를 안정적으로 개선시킬 수 있는지에 대하여 알아본 결과, 十全大補湯 건조분말 (10.0 ㎎/㎏, i.p.)을 투여한 실험군 A의 국소 뇌혈류량은 불안정하게 변화된 대조군의 국소 뇌혈류량에 비해 안정적으로 개선되었고 (Fig. 4), 十全大補湯加鹿茸 건조분말 (10.0 ㎎/㎏, i.p.)을 투여한 실험군 B의 국소 뇌혈류량도 불안정하게 변화된 대조군의 국소 뇌혈류량에 비해 유의성 있게 안정적으로 개선되었다(Fig. 5). 이는 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸이 모두 뇌허혈시 불안정하게 변동되는 국소 뇌혈류량을 안정적으로 개선시켜 혈류개선에 사용될 수 있을 것으로 생각되고, 특히 十全大補湯加鹿茸이 十全大補湯보다 유의성이 있는 효과가 있어 한의학적 측면에서 고찰해보면, 血虛에 氣能生血하는 補陽氣之劑를 배합하면 혈류 개선에 더 좋은 효과가 있을 것으로 판단된다.
- 6) 항허혈 효과가 있음을 육안적으로 관찰할 수 있었다. 또한 CA1 부위의 조직을 골라 BDNF에 대한 면역 반응을 검사한 결과, Hematoxylin 대조염색 시 대조군은 거의 낮은 면역반응을 보였다. 일반적으로 BDNF에 강한 면역 양성 반응을 보이는 세포의 경우에 있어 세포체와 긴 세포 돌기 모양의 세포가 진한 갈색으로 관찰되는데, 실험군 A와 실험군 B에서 면역반응이 증가된 상태를 보였고, 특히 실험군 B는 상당히 증가된 진한 갈색을 나타내어 실험군 A에 비해 높은 면역 양성 반응을 보여주고 있음(Fig.
- 8). 또한 十全大補湯加鹿茸 건조분말을 투여하였을 때 감소되었던 평균 혈압은 인도메타신을 전처치하였을 때 변화가 나타나지 않았으나 메틸렌블루를 전처치하였을 때에 대조군의 평균 혈압보다 유의성 있게 증가하였다(Fig. 9). 이는 혈관에 미치는 十全大補湯加鹿茸의 기전이 메틸렌블루와 관련이 있으며, 그 작용에는 guanylate cyclase와 밀접함을 알 수 있었다.
- 메틸렌블루를 전처치하였을 때의 국소 뇌혈류량 기저치를 100.00±7.16%라 하였을 때, 메틸렌블루 처치군의 국소 뇌혈류량은 각각 100.64±2.96%, 102.53±4.89%, 105.69±7.4 %, 111.94±9.10%로 투여 용량에 비례하여 증가되었으나 대조군의 국소 뇌혈류량 변화보다는 유의성 (p<0.05) 있게 감소하였다(Fig. 8).
- 메틸렌블루를 전처치하였을 때의 평균 혈압 기저치를 100.00±7.9 %라 하였을 때, 메틸렌블루 처치군의 평균 혈압은 각각 98.04±7.89%, 99.26±6.61%, 99.86±6.35%, 102.63±6.25%로 대조군의 평균 혈압에 비해 유의성 (p<0.05) 있게 증가하였다(Fig. 9).
- 본 실험 결과, 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸 건조분말을 투여하였을 때 국소 뇌혈류량은 정상 흰쥐의 기저치에 비해 유의성 있게 증가하였으나(Fig. 2) 평균 혈압은 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸 건조분말을 투여하였을 때 기저치보다 모두 감소하였다(Fig. 3). 이는 뇌혈류량이 혈압과 뇌혈관의 직경에 비례한다는 것에 비추어 볼 때, 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸이 모두 평균 혈압을 감소시켰지만 뇌혈관의 직경을 확장시킴으로써 뇌혈류량을 유의성 있게 증가시킨 것으로 생각된다.
- 실험 종료시 각 실험군의 절편 중에서 해마 CA1 부위의 조직을 골라 BDNF에 대한 Hematoxylin 대조 염색을 실시한 결과, 대조군은 거의 낮은 면역반응을 보였으나 실험군 A는 다소 증가된 면역 반응을 보였고, 실험군 B는 상당히 증가된 진한 갈색을 나타내어 대조군에 비해 높은 면역 양성 반응을 나타내었다(Table 3)(Fig. 7).
- 이상의 결과에서 알 수 있듯 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸은 모두 뇌혈류 개선 및 뇌손상 회복에 유의한 효과를 보였다. 그러나 그 중에서도 十全大補湯加鹿茸이 뇌손상시 뇌조직에 대해 면역 양성 반응을 나타내면서 허혈시 불안정하게 나타난 국소 뇌혈류량을 개선시켜 본 저자는 十全大補湯加鹿茸이 뇌혈류역학에 미치는 작용기전을 알아보고자 하였다.
- 이후 SDT 1.0 ㎎/㎏을 투여하였을 때의 국소 뇌혈류량은 116.03±6.81%로 기저치보다 유의성 (p<0.05) 있게 증가하였고, SDT 10.0 ㎎/㎏을 투여하였을 때의 국소 뇌혈류량도 122.04±5.98%로 기저치보다 유의성 (p<0.01) 있게 증가하였다.
- 이후 재관류 시간이 경과될수록 각각 114.77±5.37%, 115.13±6.51%, 113.11±7.57%, 108.27±9.86%로 기저치보다 증가한 상태를 나타내었으나 대조군의 불안정한 국소 뇌혈류량의 변동에 비해서는 개선되었다(Fig. 4).
- 이후 재관류 시간이 경과될수록 각각 116.68±3.85%, 117.17±6.63%, 113.64±6.43%, 107.22±6.32%, 107.01±5.33%로 기저치보다 증가한 상태를 나타내었으나 대조군의 불안정한 국소 뇌혈류량의 변동에 비해서는 유의성 (p<0.05) 있게 안정적으로 개선되었다(Fig. 5).
- 인도메타신을 전처치하였을 때의 국소 뇌혈류량 기저치를 100.00±8.16%라 하였을 때, 인도메타신 처치군의 국소 뇌혈류량은 각각 102.39±5.09%, 110.26±5.08%, 117.81±7.48%, 123.66±10.26%로 투여 용량에 비례하여 증가되었으나 대조군의 국소 뇌혈류량 변화보다는 감소하였다.
- 또한 CA1 부위의 조직을 골라 BDNF에 대한 면역 반응을 검사한 결과, Hematoxylin 대조염색 시 대조군은 거의 낮은 면역반응을 보였다. 일반적으로 BDNF에 강한 면역 양성 반응을 보이는 세포의 경우에 있어 세포체와 긴 세포 돌기 모양의 세포가 진한 갈색으로 관찰되는데, 실험군 A와 실험군 B에서 면역반응이 증가된 상태를 보였고, 특히 실험군 B는 상당히 증가된 진한 갈색을 나타내어 실험군 A에 비해 높은 면역 양성 반응을 보여주고 있음(Fig. 7)을 알 수 있었다. 이는 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸 모두 뇌허혈로 인한 신경학적 변화에 유의성이 있는 것으로 인정되지만 그 중에서도 十全大補湯加鹿茸이 十全大補湯보다 허혈로 인한 신경학적 이상반응에 더욱 효과가 있을 것으로 판단된다.
- 정상 흰쥐의 국소 뇌혈류량 기저치를 100.00±4.2 %라 하였을 때, 대조군의 국소 뇌혈류량은 뇌허혈 120분간 30분 간격으로 각각 52.93±1.94%, 53.78±1.92%, 52.12±0.96%, 52.93±1.60%로 차단되었다.
- 정상 흰쥐의 국소 뇌혈류량 기저치를 100.00±4.22%라 하였을 때, 대조군의 국소 뇌혈류량은 뇌허혈 120분간 30분 간격으로 각각 52.93±1.94%, 53.78±1.92%, 52.12±0.96%, 52.93±1.60%로 차단되었다.
- 정상 흰쥐의 국소 뇌혈류량 기저치를 100.00±4.60%라 하였을 때, 실험군 A의 국소 뇌혈류량은 뇌허혈 120분간 30분 간격으로 각각 54.33±6.92%, 57.55±6.64%, 57.63±6.8 %, 58.73±6.08%로 차단되었고, 재관류 후 120분간에는 기저치보다 각각 102.24±3.35%, 114.56±4.49%, 125.60±7.02%, 122.13±4.81%로 불안정하게 증가되었다.
- 정상 흰쥐의 국소 뇌혈류량 기저치를 100.00±5.75%라 하였을 때, 실험군 B의 국소 뇌혈류량은 뇌허혈 120분간 30분 간격으로 각각 55.08±4.18%, 55.35±5.54%, 54.55±5.41%, 55.99±5.10%로 차단되었고, 재관류 후 90분간에는 기저치보다 각각 95.56±3.18%, 114.92±5.86%, 122.03±7.30%로 불안정하게 증가되었다.
- 정상 흰쥐의 뇌혈류역학 변화를 관찰한 결과, 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸을 투여하였을 때의 국소 뇌혈류량은 기저치에 비해 유의성 있게 증가하였고, 평균 혈압은 기저치에 비해 감소하였다.
- 혈관확장 억제제를 전처치한 실험 결과, 十全大補湯加鹿茸 건조분말 투여로 유의성 있게 증가된 대조군의 국소 뇌혈류량은 인도메타신을 전처치하였을 때 감소하였고, 특히 메틸렌블루를 전처치하였을 때는 대조군의 국소 뇌혈류량보다 유의성 있게 감소하였다(Fig. 8). 또한 十全大補湯加鹿茸 건조분말을 투여하였을 때 감소되었던 평균 혈압은 인도메타신을 전처치하였을 때 변화가 나타나지 않았으나 메틸렌블루를 전처치하였을 때에 대조군의 평균 혈압보다 유의성 있게 증가하였다(Fig.
후속연구
- 이상과 같이, 血虛로 인해 나타나는 血虛生風證에 사용되는 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸이 허혈로 인해 나타나는 불안정한 뇌혈류를 개선시켜주고, 이를 통해 면역 양성반응을 나타냄으로써 뇌손상으로 인한 신경학적 이상반응을 회복시켜 준다는 결과를 볼 때, 본 저자는 한의학적으로도 혈류장애 시 補血藥物과 함께 補陽氣藥物을 加味하면 더욱 효과가 있을 것으로 생각되고, 또한 이와 같은 결과가 임상에 활용할 수 있는 객관적인 지표를 제시하여 주었다고 생각된다. 그러나 八珍湯, 十全大補湯, 十全大補湯加鹿茸에 대한 효능 및 작용기전 등에 관련된 연구는 앞으로도 더욱 진행하여 객관적인 치료기전을 밝혀야 할 것으로 생각된다.
- 이는 혈관에 미치는 十全大補湯加鹿茸의 기전이 메틸렌블루와 관련이 있으며, 그 작용에는 guanylate cyclase와 밀접함을 알 수 있었다. 상기 결과는 팔진탕이 cyclooxygenase와 관련되어 뇌혈류역학의 변동을 개선시킴으로써 허혈로 인한 뇌손상을 억제한다고 보고한 것45)과는 다른 결과이지만 녹용약침이 guanylate cyclase와 관련하여 뇌혈관의 직경을 확장시킴으로써 국소 뇌혈류량을 증가시키고, 또한 뇌허혈 후 재관류 과정에서 불안정하게 증가되었던 국소 뇌혈류량을 유의성 있게 개선시켜 항허혈 작용이 있음을 보고한 것46)에 비추어 볼 때, 팔진탕과 팔진탕에 황기와 육계를 배합한 십전대보탕, 십전대보탕에 녹용을 가미한 십전대보탕가녹용 모두 효능적인 측면에서는 유사할 수 있으나 기전적인 측면에서는 다소 다를 수 있음을 보여주는 결과로 향후 지속적인 연구가 이루어져야 할 것으로 보인다.
- 이상과 같이, 血虛로 인해 나타나는 血虛生風證에 사용되는 十全大補湯과 十全大補湯加鹿茸이 허혈로 인해 나타나는 불안정한 뇌혈류를 개선시켜주고, 이를 통해 면역 양성반응을 나타냄으로써 뇌손상으로 인한 신경학적 이상반응을 회복시켜 준다는 결과를 볼 때, 본 저자는 한의학적으로도 혈류장애 시 補血藥物과 함께 補陽氣藥物을 加味하면 더욱 효과가 있을 것으로 생각되고, 또한 이와 같은 결과가 임상에 활용할 수 있는 객관적인 지표를 제시하여 주었다고 생각된다. 그러나 八珍湯, 十全大補湯, 十全大補湯加鹿茸에 대한 효능 및 작용기전 등에 관련된 연구는 앞으로도 더욱 진행하여 객관적인 치료기전을 밝혀야 할 것으로 생각된다.
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