가미십전대보탕(이하 KSD로 표기) 추출물은 생약 성분으로 인체 및 동물에 투여 시 세포 독성 및 장기에 중금속 등에 의한 독성 물질이 발생할 수 있어 안전성이 매우 중요하다. 따라서 본 연구에서는 KSD의 안전성 확보를 위해 중금속 검사, 간과 신장 기능 지표 검사 및 RAW 264.7 세포 생존 시험을 거친 후 RAW 264.7 세포를 이용하여 KSD 추출물의 항산화 및 항염증 효과를 알아보았다. KSD 추출물에서 중금속은 발견되지 않거나 기준치 미만으로 검출되었다. 간기능지표인 AST, ALT는 정상군에 비해 낮게 나타났으며 신기능 지표인 Cr, BUN도 정상군과 같거나 낮아 인체에 안전함을 확인하였다. RAW 264.7 세포 독성은 대조군 대비 농도별 생존율에 차이가 없었다. KSD 추출물의 항산화 효능 측정 결과 DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능은 $10{\mu}g/mL$ 이상의 농도에서 의존적으로 활성이 증가하였다. 항염증 효과 측정 결과 NO 생성량은 대조군에 비해 10, $100{\mu}g/mL$에서 유의성 있는 감소를 보였으며, $IL-1{\beta}$와 IL-6는 농도 의존적으로 발현량이 감소하였고, $TNF-{\alpha}$는 유의적 차이점을 발견할 수 없었다. 이상의 결과를 보아 KSD는 골절 치료를 위한 생약으로 안전성 및 항산화 및 염증 감소에 효과가 있을 것으로 생각된다.
가미십전대보탕(이하 KSD로 표기) 추출물은 생약 성분으로 인체 및 동물에 투여 시 세포 독성 및 장기에 중금속 등에 의한 독성 물질이 발생할 수 있어 안전성이 매우 중요하다. 따라서 본 연구에서는 KSD의 안전성 확보를 위해 중금속 검사, 간과 신장 기능 지표 검사 및 RAW 264.7 세포 생존 시험을 거친 후 RAW 264.7 세포를 이용하여 KSD 추출물의 항산화 및 항염증 효과를 알아보았다. KSD 추출물에서 중금속은 발견되지 않거나 기준치 미만으로 검출되었다. 간기능지표인 AST, ALT는 정상군에 비해 낮게 나타났으며 신기능 지표인 Cr, BUN도 정상군과 같거나 낮아 인체에 안전함을 확인하였다. RAW 264.7 세포 독성은 대조군 대비 농도별 생존율에 차이가 없었다. KSD 추출물의 항산화 효능 측정 결과 DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능은 $10{\mu}g/mL$ 이상의 농도에서 의존적으로 활성이 증가하였다. 항염증 효과 측정 결과 NO 생성량은 대조군에 비해 10, $100{\mu}g/mL$에서 유의성 있는 감소를 보였으며, $IL-1{\beta}$와 IL-6는 농도 의존적으로 발현량이 감소하였고, $TNF-{\alpha}$는 유의적 차이점을 발견할 수 없었다. 이상의 결과를 보아 KSD는 골절 치료를 위한 생약으로 안전성 및 항산화 및 염증 감소에 효과가 있을 것으로 생각된다.
As Kamisipjeondaebotang (KSD) extract is an herbal ingredient, safety is very important due to possible cell poisoning or heavy metal toxicity to organs when administered to humans or animals. Accordingly, this study examined the antioxidant and anti-inflammatory effects of KSD extract to confirm it...
As Kamisipjeondaebotang (KSD) extract is an herbal ingredient, safety is very important due to possible cell poisoning or heavy metal toxicity to organs when administered to humans or animals. Accordingly, this study examined the antioxidant and anti-inflammatory effects of KSD extract to confirm its medicinal safety by using RAW 264.7 cells after heavy metal screening, functional index test of the liver and kidney, and cell survival rate test. Heavy metals were not found in KSD extracts or were less than standard amounts. Liver function indices such as aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase revealed low values and kidney function indices such as creatinine and blood urea nitrogen were not significantly different from the normal group. This proved the safety to the human. RAW 264.7 cells showed no poisoning compared to the control group in terms of survival rate. Regarding the antioxidant effect of KSD extract, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging activity and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazo-line-6-sulphonic acid) radical scavenging activity increased at concentrations over $10{\mu}g/mL$. The anti-inflammatory effect of KSD extract significantly decreased based on the amount of nitric oxide at concentrations of 10 and $100{\mu}g/mL$ compared to the control group. Expression of interleukin (IL)-$1{\beta}$ and IL-6 decreased in a concentration-dependent manner. There was no significant difference in tumor necrosis factor-${\alpha}$ level. Based on the results, KSD can be regarded as a safe antioxidant with anti-inflammatory effects for fracture treatment.
As Kamisipjeondaebotang (KSD) extract is an herbal ingredient, safety is very important due to possible cell poisoning or heavy metal toxicity to organs when administered to humans or animals. Accordingly, this study examined the antioxidant and anti-inflammatory effects of KSD extract to confirm its medicinal safety by using RAW 264.7 cells after heavy metal screening, functional index test of the liver and kidney, and cell survival rate test. Heavy metals were not found in KSD extracts or were less than standard amounts. Liver function indices such as aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase revealed low values and kidney function indices such as creatinine and blood urea nitrogen were not significantly different from the normal group. This proved the safety to the human. RAW 264.7 cells showed no poisoning compared to the control group in terms of survival rate. Regarding the antioxidant effect of KSD extract, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging activity and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazo-line-6-sulphonic acid) radical scavenging activity increased at concentrations over $10{\mu}g/mL$. The anti-inflammatory effect of KSD extract significantly decreased based on the amount of nitric oxide at concentrations of 10 and $100{\mu}g/mL$ compared to the control group. Expression of interleukin (IL)-$1{\beta}$ and IL-6 decreased in a concentration-dependent manner. There was no significant difference in tumor necrosis factor-${\alpha}$ level. Based on the results, KSD can be regarded as a safe antioxidant with anti-inflammatory effects for fracture treatment.
이에 본 연구는 십전대보탕의 주 기능인 항산화, 항염증작용 및 자연동, 합합피, 골쇄보의 골절 유합 성분을 가미하여 생약성분으로 세포독성 및 중금속에 의한 장기의 안전성을 확보하고 항산화 효과 및 RAW 264.7 세포를 이용한 항염증 효과를 입증하여 골절 치료제로의 기초자료를 얻고자 하였다.
제안 방법
세척 후 Dulbecco’s phosphate buffered saline(D-PBS, Welgene, Gyeongbuk, Korea)을 150 μL 넣고 Luminex를 이용하여 tumor necrosis factor(TNF)-α, interleukin(IL)- 1β, IL-6를 측정하였다. 염증성 사이토카인 생성을 유도하지 않은 RAW 264.7 세포를 정상군(Normal), 염증성 사이토카인 생성을 유도하고 FU 추출물을 처리하지 않은 RAW264.7 세포를 대조군(Control)으로 표기하였으며, 대조군에 대한 백분율 계산을 통해 NO 생성 저해능을 분석하였다.
대상 데이터
7 실험세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 사용한 가미십전대보탕(이하 KSD로 표기)에 구성된 약재들은 (주)옴니허브(Daegu,Korea)에서 구입 후 대전대학교 TBRC-RIC에서 정선한 다음 사용했으며, 그 내용과 사용량(1첩)은 Table 1과 같으며, KSD 2첩에 DW 1,000 mL를 넣고 3시간 환류 추출한 여과액을 이용, rotary vacuum evaporator(B-480, Büchi Co., Flawil, Switzerland)에서 감압 농축하였다. 농축한 용액은 freeze dryer(FDU-540, EYELA Co.
실험에 사용된 RAW 264.7 실험세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 사용한 가미십전대보탕(이하 KSD로 표기)에 구성된 약재들은 (주)옴니허브(Daegu,Korea)에서 구입 후 대전대학교 TBRC-RIC에서 정선한 다음 사용했으며, 그 내용과 사용량(1첩)은 Table 1과 같으며, KSD 2첩에 DW 1,000 mL를 넣고 3시간 환류 추출한 여과액을 이용, rotary vacuum evaporator(B-480, Büchi Co.
데이터처리
통계처리는 SPSS(Statistical Package for the Social Science, ver 11.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 unpaired Student’s t-test 및 ANOVA를 이용하여 분산분석 및 Duncan’s multiple range test로 통계처리 하였으며, P<0.05와 P<0.01 수준에서의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
혈액을 30분간 상온에서 보관한 후 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 분리된 혈청을 대전대학교 임상병리학과(Daejeon, Korea)에 분석 의뢰하였다. Cr의 함량은 creatinine Jaffe method의 원리, BUN의 함량은 Kinetic UV assay for urea/urea nitrogen의 원리를 이용하여 생화학자동분석기로 정량 측정하였다.
자유라디칼 소거 활성 시험은 안정된 자유라디칼 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)을 사용하는 방법이다. KSD 추출물은 최종 1, 10, 100, 1,000 μg/mL의 농도로 희석하였으며, 에탄올에 용해시킨 0.
성능/효과
DPPH는 안정한 라디칼로 천연 추출물의 항산화 활성 측정법으로 널리 사용되고 있다. KSD 추출물의 DPPH 소거율을 측정한 결과 Table 3과 같이 1 μg/mL 농도에서 0.30±1.77%, 10 μg/mL 농도에서 1.66±1.26%, 100 μg/mL 농도에서 4.47±0.97%, 1,000 μg/mL 농도에서 41.35±1.77%로 나타나 10 μg/mL 이상의 농도에서 의존적으로 라디칼소거능이 증가함을 보였으며, Lee와 Oh(26)에 의한 십전대보탕 항산화 연구에서도 동일한 농도에서 7.4~94.3%의 소거능으로 비율 차이는 있지만 농도 의존적으로 DPPH 소거능이 증가함을 볼 수 있다. ABTS 측정법은 DPPH 소거 활성법과 차이는 있으나(27) 측정시간이 짧고 결과의 재현성이 높아 DPPH 소거 활성법과 같이 비교하였다.
KSD 추출물의 중금속 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같이 기준치 이하로 나타났고 간 기능의 지표 성분인 AST, ALT 측정은 Fig. 1, Fig. 2와 같이 정상군과 비교하여 차이를 보이지 않아 간 기능에 영향을 미치지 않아 안전한 것으로 보이며, 신기능 또한 Fig. 3의 Cr 및 Fig. 4의 BUN 함량이 정상군과 비교하여 차이를 보이지 않아 신기능에 영향을 미치지 않았으며, RAW 264.7 세포에 대한 독성 측정은 Fig. 5와 같은 생존율로 안전한 것으로 나타났다.
9%로 나타나 대조군에 비하여 10, 100 μg/mL 농도에서 유의성 있게 감소하여 Lee와Oh(26)의 연구에서의 독활, 참죽나무잎 추출물을 대식세포에 처리한 결과인 추출물 농도 증가에 비례해 NO 생성량 억제와 비슷한 결과를 나타내었다. 따라서 KSD의 생약 추출물은 NO 생성을 억제시켜 감염 반응에 대한 초기 면역기능에 활성도가 높을 것이라 생각된다.
후속연구
9~86%의 소거능으로 비율의 차이는 있지만 농도 의존적으로 ABTS 소거능이 증가함을 볼 수 있다. 이러한 결과는 KSD 성분이 항산화 물질로써 유의성이 있음을 확인할 수 있으며 이후 소거능을 높일 수 있는 다양한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
십전대보탕의 용도와 효능은?
십전대보탕은《태평혜민화제국방(太平惠民和劑局方)》에 최초로 기재된 이래, 몸을 전반적으로 보양하는 대표 처방으로 사용되어 왔으며(1), 골절 치유에 충분한 혈액 공급(2)을 위해 혈허(血虛)된 기혈(氣血)을 보혈(補血)하기 위한 기혈쌍보제(氣血雙補劑)로 사용되며(3), 항산화 및 항당뇨 작용(4), 신장조직 손상에서 보이는 항산화 효과(5), 남성 생식세포에서 보이는 항산화 효과(6), 성장지능 발달 조혈 작용(7), 항노화(8) 및 항염증 작용에 효과가 있다(9).
십전대보탕이 함유한 성분은?
십전대보탕에 골절치료약제로 쓰이는 FeS2를 함유하여(10) 신속한 골 접합과 타박상(打撲傷), 경계(驚悸), 영류(癭瘤), 창양(瘡瘍), 화상(火傷)(11)에 쓰이는 자연동(12), 불안증, 신경쇠약, 타박상, 근골절상(13,14)에 쓰이는 합환피, 페놀 화합 성분과 전분 및 포도당 등이 함유되어 있으며(15), 항고혈압 작용(16) 및 항산화 작용(17), 골 형성 및 골 석회화 등 골 질병 치료 효과(18)가 증명된 골쇄보(19)를 가미하여 십전대보탕을 통해 항산화 및 항염증 작용과 기혈을 높이는 동시에 골절 치료에 효과적인 약제들을 복합한 탕을 가미십전대보탕이라 한다.
골절의 유합과정 중 결합조직이 증식한 후의 과정은?
골절의 유합과정을 살펴보면 골절 발생 후 초기 단계에선 조직 결손부와 혈종이 육아조직으로 바뀌고 거기에 결합조직이 증식한다. 그리고 그 부위에 조골세포(osteoblast)가증식하여 뼈의 기질을 만들어 골절된 뼈의 양 끝을 일시적으로 결합시킨다. 조골세포가 증식하여 만든 기질로 인한 유골(osteoid)에 칼슘이 침착되면 초기골(woven bone)이 된다 (23).
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