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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 표고버섯 (Shiitake mushroom; SM, Lentinus edodes) 추출물의 항혈소판 응집 및 항혈전에 미치는 영향을 알아보기 위해 in vitro실험에서 Aggregometer 실험을 진행하고, DPPH solution을 이용한 항산화능을 관찰하였다. 또한 in vivo 실험을 통해 경동맥 혈전 동물모델을 이용하여 혈전무게를 측정하고 혈류의 흐름을 탐색함으로써 산화 관련 질환 및 혈소판 응집, 혈전 관련 질환 또는 혈행 개선의 응용 가능성을 검토하였다.
- 본 연구에서는 표고버섯 (Shiitake mushroom ; SM, Lentinus edodes) 추출물의 항혈소판 응집 및 항혈전에 미치는 영향을 알아보기 위해, in vitro 실험에서 Aggregometer 실험을 진행하고, DPPH solution을 이용한 항산화능을 관찰하였다. 또한 in vivo 실험을 통해 경동맥혈전 동물모델을 이용하여 혈전무게를 측정하고 혈류의 흐름을 탐색함으로써 산화 관련 질환 및 혈소판 응집, 혈전 관련 질환 또는 혈행 개선의 응용 가능성을 검토하였다.
- 본 연구에서는 표고버섯 (Shiitake mushroom ; SM, Lentinus edodes)에서 추출한 lenthionine 성분의 항혈소판 응집 및 항혈전에 미치는 영향을 알아보기 위해, in vitro 실험에서 Aggregometer 실험을 진행하고, DPPH solution을 이용한 항산화능을 관찰하였다. 또한 in vivo 실험을 통해 경동맥혈전 동물모델을 이용하여 혈전무게를 측정하고 혈류의 흐름을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 혈관에 filter paper(2 mm square)를 대어 3분 간 35% FeCl3를 가하였다. 3분이 지나면 filter paper를 제거하고 경동맥을 세척하고 30분 간 관찰하였다. 어느 정도의 시간이 지나면 혈전이 형성이 되며 30분 후 혈전이 생긴 부위의 혈전을 조심스럽게 박리한 후 무게를 측정하였다.
- . DPPH 16 ㎎을 100 ㎖의 에탄올에 녹인 후 100 ㎖의 증류수를 혼합하여 여과지로 여과한 후 여액 2.5 ㎖에 표고버섯 추출물을 각각 5, 10, 25 ㎎/㎖가 되도록 생리식염수에 녹인 후 0.5㎖을 혼합하고 실온에서 10분간 반응시켰다.
- PRP의 혈소판 수를 Coulter Counter (Coulter electronics, USA)를 이용하여 측정하고 3 × 105/㎕로 조정하여 사용하였다.
- 또한 항혈전 효과 검색을 위해 아무런 처치를 실시하지 않은 대조군, 표고버섯 추출물 50, 100, 250 ㎎/㎏ 투여군으로 총 네 개의 군으로 구분하였다. 각 군마다 12마리씩 나누고, 표고버섯 추출물을 1일 1회 주 5회, 3주간 매일 1 ㎖씩 동일한 시간에 경구투여 하였다.
- 각 군의 혈액을 100 ㎕ 채취하여 헤파린을 이용하여 항응고 처리 후, 일정한 압력에 의해 혈액이 모세관을 통과하는 시간을 Micro Channel Array Flow Analyzer KH-6(MC Lab, Japan)으로 측정하였다.
- 경동맥혈전 유발 동물모델을 제작하기 위해 FeCl3를 이용하여 경동맥혈전을 유발하였다14). 동물 실험실에서 적응된 흰쥐를마취 챔버 (Royal medical, 한국)에 넣고, 70% N2O와 28.
- 목의 정중부를 절개를 하고 미주신경이 손상되지 않도록 주의하여 우측 총경동맥 (common carotid, CCA)을 찾아 확인한 후 노출시켰다. 그리고 Doppler flow prove를 경동맥에 위치시켜 모니터를 통하여 혈행을 관찰하였다. 혈관에 filter paper(2 mm square)를 대어 3분 간 35% FeCl3를 가하였다.
- 남아있는 DPPH의 양을 측정하기 위해서 microplate reader(Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 528 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 양성 대조물로는 ascorbic acid성분을 사용하였다.
- 동물 실험실에서 적응된 흰쥐를마취 챔버 (Royal medical, 한국)에 넣고, 70% N2O와 28.5% O2가스에 2.0% 엔플루란 (enflurane, 중외제약, 한국)을 혼합시킨 마취가스를 사용하여 흡입마취 후 수술대에 고정하고, 흡입전신 마취를 계속하여 유지하였다. 목의 정중부를 절개를 하고 미주신경이 손상되지 않도록 주의하여 우측 총경동맥 (common carotid, CCA)을 찾아 확인한 후 노출시켰다.
- 따라서 본 연구에서는 표고버섯 (Shiitake mushroom; SM, Lentinus edodes) 추출물의 항혈소판 응집 및 항혈전에 미치는 영향을 알아보기 위해 in vitro실험에서 Aggregometer 실험을 진행하고, DPPH solution을 이용한 항산화능을 관찰하였다. 또한 in vivo 실험을 통해 경동맥 혈전 동물모델을 이용하여 혈전무게를 측정하고 혈류의 흐름을 탐색함으로써 산화 관련 질환 및 혈소판 응집, 혈전 관련 질환 또는 혈행 개선의 응용 가능성을 검토하였다.
- 또한 in vivo 실험을 통해 경동맥혈전 동물모델을 이용하여 혈전무게를 측정하고 혈류의 흐름을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 따라서 본 연구에서는 표고버섯 (Shiitake mushroom; SM, Lentinus edodes) 추출물의 항혈소판 응집 및 항혈전에 미치는 영향을 알아보기 위해 in vitro실험에서 Aggregometer 실험을 진행하고, DPPH solution을 이용한 항산화능을 관찰하였다. 또한 in vivo 실험을 통해 경동맥 혈전 동물모델을 이용하여 혈전무게를 측정하고 혈류의 흐름을 탐색함으로써 산화 관련 질환 및 혈소판 응집, 혈전 관련 질환 또는 혈행 개선의 응용 가능성을 검토하였다.
- 또한 항혈전 효과 검색을 위해 아무런 처치를 실시하지 않은 대조군, 표고버섯 추출물 50, 100, 250 ㎎/㎏ 투여군으로 총 네 개의 군으로 구분하였다. 각 군마다 12마리씩 나누고, 표고버섯 추출물을 1일 1회 주 5회, 3주간 매일 1 ㎖씩 동일한 시간에 경구투여 하였다.
- 0% 엔플루란 (enflurane, 중외제약, 한국)을 혼합시킨 마취가스를 사용하여 흡입마취 후 수술대에 고정하고, 흡입전신 마취를 계속하여 유지하였다. 목의 정중부를 절개를 하고 미주신경이 손상되지 않도록 주의하여 우측 총경동맥 (common carotid, CCA)을 찾아 확인한 후 노출시켰다. 그리고 Doppler flow prove를 경동맥에 위치시켜 모니터를 통하여 혈행을 관찰하였다.
- 본 연구에서는 표고버섯 추출물이 혈류의 흐름에 미치는 영향을 검토해보기 위해 각 군의 혈액을 채취하여 헤파린으로 항응고 처리 후, Micro channel array flow analyzer(MC-FAN)를 이용하여 일정한 압력으로 인해 혈액이 모세관을 25, 50, 75, 100 ㎕ 통과하는 시간을 측정하였다. 실험결과 혈액 25 ㎕ 이동시에는 각 군의 혈액유동성에 차이를 보이지 않았으나, 50 ㎕에서 대조군과 비교하여 25 ㎎/㎖ 투여군(p<.
- 실험 동물실에서 적응된 흰쥐를 마취 챔버 (Royal medical, 한국)에 넣고, 70% N2O와 28.5% O2 가스에 2.0% 엔플루란(enflurane, 중외제약, 한국)을 혼합시킨 마취가스를 사용하여 흡입마취 후 수술대에 고정하고, 흡입전신마취를 계속하여 유지하였다. 항응고제를 혈액과 1:9 (v/v)의 비율이 되도록 항응고 처리(3.
- 3분이 지나면 filter paper를 제거하고 경동맥을 세척하고 30분 간 관찰하였다. 어느 정도의 시간이 지나면 혈전이 형성이 되며 30분 후 혈전이 생긴 부위의 혈전을 조심스럽게 박리한 후 무게를 측정하였다.
- Plastic cuvettes에 혈액 450 ㎕를 분주하여 37℃에서 약 10분간 반응시키고, 다양한 농도의 시료 20㎕를 가하여 stir bars를 넣고 1200 rpm에서 교반하면서 반응시켰다. 이에 2분 정도 baseline을 확인 후, collagen 7 ㎕ (1 ㎎/㎖)을 넣어 혈소판 응집을 유도하고 최대 10분간 측정하였다. 표고버섯의 최종 농도는 5, 10, 25 ㎎/㎖가 되도록 10% (v/v) DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 제조하였고, 대조군은 시료가 함유되지 않은 용매 DMSO를 사용하였다.
- 표고버섯 추출물의 항혈전 효과를 보기 위하여 FeCl3를 이용하여 경동맥혈전증 유발 동물모델을 제작하여 혈전무게를 측정하였다. 표고버섯 추출물을 5, 10, 25 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 혈전무게를 측정한 결과 0.
- 표고버섯 추출물의 혈류의 흐름에 미치는 영향을 실험하기 위해 각 군의 혈액을 채취하여 혈액이 모세관을 25, 50, 75, 100㎕ 통과하는 시간을 Micro channel arrary를 이용하여 측정하였다. 각 군간의 유의성을 알아보고자 일원배치분산분석 (one-way ANOVA)을 실시한 결과 통계학적 유의한 차이를 나타냈고(p<.
- 표고버섯 추출물의 혈소판 응집반응에 대한 억제 효과를 보기 위하여 collagen으로 응고를 유도하여 검사를 시행하였다. 표고버섯 추출물을 5, 10, 25 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 응집률을 측정한 결과 66.
- 이에 2분 정도 baseline을 확인 후, collagen 7 ㎕ (1 ㎎/㎖)을 넣어 혈소판 응집을 유도하고 최대 10분간 측정하였다. 표고버섯의 최종 농도는 5, 10, 25 ㎎/㎖가 되도록 10% (v/v) DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 제조하였고, 대조군은 시료가 함유되지 않은 용매 DMSO를 사용하였다. 혈소판 응집억제 활성은 collagen으로 유도된 aggregation (%)을 대조군(A)으로, 표고버섯 추출물을 처리한 후 유도된 aggregation (%)을 실험군(B)으로 하여 다음 계산식에 따라 저해율 (%)로 나타내었다.
- 0% 엔플루란(enflurane, 중외제약, 한국)을 혼합시킨 마취가스를 사용하여 흡입마취 후 수술대에 고정하고, 흡입전신마취를 계속하여 유지하였다. 항응고제를 혈액과 1:9 (v/v)의 비율이 되도록 항응고 처리(3.8% sodium citrate)한 plastic syringes를 사용하여 심장천자를 통해 채혈하였다. 채취한 혈액은 1,100 rpm에서 10분간 원심분리 후 상등액을 분취하여 혈소판농축혈장 (platelet-rich plasma, PRP)을 얻는다.
- 표고버섯의 최종 농도는 5, 10, 25 ㎎/㎖가 되도록 10% (v/v) DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 제조하였고, 대조군은 시료가 함유되지 않은 용매 DMSO를 사용하였다. 혈소판 응집억제 활성은 collagen으로 유도된 aggregation (%)을 대조군(A)으로, 표고버섯 추출물을 처리한 후 유도된 aggregation (%)을 실험군(B)으로 하여 다음 계산식에 따라 저해율 (%)로 나타내었다.
- 혈소판 응집에 대한 표고버섯의 억제 효과를 알아보기 위하여 Aggregometer (Chrono Log, Havertown, PA, USA)를 이용하여 전혈의 혈소판 응집을 측정하는 impedance 방법으로, 혈소판의 응집에 따라 형성되는 두 전극사이에 형성된 전기적 저항(ohm)의 변화로 나타내었다. Plastic cuvettes에 혈액 450 ㎕를 분주하여 37℃에서 약 10분간 반응시키고, 다양한 농도의 시료 20㎕를 가하여 stir bars를 넣고 1200 rpm에서 교반하면서 반응시켰다.
- 혈소판의 기능을 알아보는 실험으로 전통적인 방법으로는 bleeding time, platelet aggregometry가 있고, 새로운 실험으로는 Verify Now, Plateletworks, Thrombelastograph Platelet Mapping System, Impact cone and plate(let) analyzer 등이 있다, 이 중 Bleeding time 은 비특이적이고, 임상적 상관관계가 부족하여 더 이상 추천되지 않으며, 새로운 실험들은 아직 표준화 되어있지 않은 상태여서, 현재 혈소판 기능 실험의 절대표준인 Aggregometer를 사용하였다35). Aggregometer는 Born's principle을 사용하는 방법으로 혈소판 기능이상을 발견하거나, aspirin, thienopyridines, GP Ⅱb/IIIa inhibitors와 같은 약물의 영향을 평가하거나, 응집 억제 물질을 연구하기 위해 사용된다36).
대상 데이터
- 본 연구에서는 전남 장흥산 표고버섯을 재료로 하여 사용하였다. 표고버섯 1 ㎏을 80% 에탄올 (에탄올:물=4:1) 5,000 ㎖에 넣고 환류 냉각기를 장치한 후 95∼100℃ 수욕조에서 12시간 동안 온탕 하였다.
- 본 연구에서는 체중이 약 250 ± 50 g의 Sprague-Dawley(SD)계 수컷 흰쥐 (8주령, 웅성, 다물사이언스)를 사용하였으며 1주일 정도 적응시킨 후 사용하였다.
- 양성 대조물로는 ascorbic acid성분을 사용하였다.
- 항혈소판 응집 효과 검색을 위해 각 농도별로 4마리를 사용하였다. 또한 항혈전 효과 검색을 위해 아무런 처치를 실시하지 않은 대조군, 표고버섯 추출물 50, 100, 250 ㎎/㎏ 투여군으로 총 네 개의 군으로 구분하였다.
데이터처리
- Tested by one way ANOVA and Tukey's multiple range test.
- Tested by one way ANOVA) and Tukey's multiple range test.
- 각 군간의 유의성을 알아보고자 일원배치분산분석 (one-way ANOVA)을 실시한 결과 통계학적 유의한 차이를 나타냈고(p<.001), 사후검정에서는 대조군과 비교하여 모든 농도에서 유의한 차이를 나타냈다(p<.001)(Fig. 1).
- 각 군간의 유의성을 알아보고자 일원배치분산분석 (one-way ANOVA)을 실시한 결과 통계학적 유의한 차이를 나타냈고(p<.01), 사후검정에서는 대조군과 비교하여 5 ㎎/㎖ 투여군은 수치상의 감소는 있었으나, 유의성은 나타나지 않았고, 10 ㎎/㎖ 투여군(p<.05), 25 ㎎/㎖ 투여군(p<.01)에서 유의한 차이를 나타냈다(Fig. 4).
- 각 군간의 유의성을 알아보고자 일원배치분산분석 (one-way ANOVA)을 실시한 결과 통계학적 유의한 차이를 나타냈고(p<.01), 사후검정을 통한 각 혈액량에 따른 군간 차이 검정은 50㎕에서 대조군과 비교하여 25 ㎎/㎖ 투여군(p<.001)에서 유의한 차이를 나타냈다.
- 농도에 따른 실험군 간의 통계적 유의성 검정을 위하여 일요인 분산분석 (one-way ANOVA)을 실시하였으며, 사후검정으로 Tukey's multiple range test를 실시하였다.
이론/모형
- 표고버섯의 항산화능을 알아보기 위하여 Blois13)에 의한 방법에 따라 항산화 활성 중의 하나인 자유라디칼 소거능을 측정하였다. DPPH 16 ㎎을 100 ㎖의 에탄올에 녹인 후 100 ㎖의 증류수를 혼합하여 여과지로 여과한 후 여액 2.
성능/효과
- Collagen으로 응고를 유도하여 혈소판 응집반응에 대한 억제 효과 평가에서 대조군과 비교하여 모든 농도에서 유의한 차이를 나타냈으며, 농도에 의존적으로 응집 억제율이 증가하는 경향을 보였다.
- DPPH solution을 이용한 항산화능 평가에서 각각의 농도에서 Ascorbic acid에 비하여 농도 의존적으로 DPPH radical 소거효과를 나타냈으며, 가장 높은 소거효과를 보인 농도는 최고 농도인 25 ㎎/㎖로 약 24%의 공여능을 보였다.
- 각각의 농도별로 최대 응집율(%)을 측정하여 control의 최대 응집율(%)에 대한 응집 억제율을 구한 결과 5, 10, 25 ㎎/㎖ 농도에서 11.02±5.4%, 35.85±2.86%, 50.24±1.24%로 농도가 증가함에 따라 응집 억제율이 증가하는 경향을 보였다(Fig. 2)
- 경동맥혈전증 동물모델의 혈전무게를 측정한 결과 대조군과 비교하여 5 ㎎/㎖ 투여군은 수치상의 감소는 있었으나 유의성은 나타나지 않았고, 10 ㎎/㎖ 투여군, 25 ㎎/㎖ 투여군에서 유의한 차이를 나타냈다.
- 표고버섯 추출물의 각각의 농도에서 Ascorbic acid에 비하여 농도 의존적으로 DPPH radical 소거효과를 나타냈다. 대조군에 비하여 가장 높은 소거효과를 보인 농도는 최고농도인 25 ㎎/㎖로 약 24%의 공여능을 보였다.
- 본 연구에서 상기 모델에 항혈전 효과를 보기 위해 표고버섯 추출물을 적용해본 결과 혈전무게가 대조군과 비교하여 10 ㎎/㎖ 투여군(p<.01), 25 ㎎/㎖ 투여군(p<.001)에서 유의하게 감소하는 결과가 나왔다.
- 본 연구에서는 Collagen을 이용하여 응집을 유도한 후 aggregometer 실험 결과 표고버섯 추출물을 5, 10, 25 ㎎/㎖의 농도로 처리했을 때 대조군과 비교하여 모든 농도에서 유의한 차이를 나타냈으며, 농도에 의존적으로 최대응집율은 낮아지고 응집억제율은 증가하였다(p<.001).
- DPPH는 항산화물질로부터 전자나 수소를 받아 안정한 분자를 형성하여 라디칼을 소거하게 되는데, 이때 고유의 청남색이 엷어지는 특징을 갖고 있어 이 색차를 비색정량하여 전자공여능력을 측정 한다39). 본 연구에서는 표고버섯 추출물의 농도에 따른 항산화능을 측정하기 위하여 DPPH radical에 대한 전자공여능을 측정한 결과, 각각의 농도에서 Ascorbic acid에 비하여 농도 의존적으로 DPPH radical 소거효과를 나타냈으며, 대조군에 비하여 가장 높은 소거효과를 보인 농도는 최고농도인 25 ㎎/㎖로 약 24%의 공여능을 보였다. 따라서, 항산화효과가 큰 천연물은 산화적 스트레스를 감소시켜 동맥경화와 같은 심혈관 질환의 예방 및 치료에 중요한 역할을 할 수 있을 것이다.
- 실험결과 혈액 25 ㎕ 이동시에는 각 군의 혈액유동성에 차이를 보이지 않았으나, 50 ㎕에서 대조군과 비교하여 25 ㎎/㎖ 투여군(p<.001)에서 유의한 차이를 나타냈다.
- 이상의 결과들을 종합해 볼 때 표고버섯 추출물은 collagen으로 유도된 혈소판 응집 반응을 억제시키고 DPPH solution을 이용한 항산화능에도 유의한 효과를 보였으며, 실험적으로 유도된 혈전 생성을 억제시키고 혈행 개선에 효과를 나타냈다.
- 이상의 결과로 미루어 보아 표고버섯 추출물은 혈소판 응집반응을 억제시키고 항산화 효능이 나타났으며, 경동맥혈전증 동물모델의 혈전의 크기를 감소시키고 혈류를 개선시켜 항혈전의 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 표고버섯 추출물을 5, 10, 25 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 응집률을 측정한 결과 66.53±3.3 %, 47.97±1.5 %, 37.23±1.41%로 나타났다.
- 표고버섯 추출물을 5, 10, 25 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 혈전무게를 측정한 결과 0.63±0.17 ㎎/㎜, 0.55±0.19 ㎎/㎜, 0.47±0.12 ㎎/㎜로 나타났다.
- 혈류개선 평가에서는 모든 농도에서 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 혈류의 흐름의 차이를 나타냈고, 특히 25 ㎎/㎖투여군에서 유의한 차이를 나타냈다.
후속연구
- 본 연구에서는 표고버섯 추출물의 농도에 따른 항산화능을 측정하기 위하여 DPPH radical에 대한 전자공여능을 측정한 결과, 각각의 농도에서 Ascorbic acid에 비하여 농도 의존적으로 DPPH radical 소거효과를 나타냈으며, 대조군에 비하여 가장 높은 소거효과를 보인 농도는 최고농도인 25 ㎎/㎖로 약 24%의 공여능을 보였다. 따라서, 항산화효과가 큰 천연물은 산화적 스트레스를 감소시켜 동맥경화와 같은 심혈관 질환의 예방 및 치료에 중요한 역할을 할 수 있을 것이다.
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