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문제 정의
- 따라서, 이들이 발효 후기까지 우점하면서 종균으로써의 기능을 발휘하기 위해서는 발효의 진행에 따라 증가하는 산에 대한 저항성이 필요하다. 따라서 선행연구[29]에서 분리한 Leuconostoc 및 Weissella 속 68균주 중, 상대적으로 내산성이 높은 3균주를 선발하고, 이들이 생산하는 항균물질의 특성을 검토하였다.
제안 방법
- 0.01 g/ml의 농도로 멸균수에 녹인 조항균물질을 0.45 µm membrane filter (Gelman Science)로 제균하여 잔존하는 항균활성을 평가하였다.
- 1 M citrate buffer (pH 4)에 20 mg/ml 농도가 되도록 준비하였다. 5N NaOH를 이용해 중성으로 pH를 조절하여 동결건조한 조항균물질을 최종농도 0.01 g/ml가 되도록 멸균수에 녹이고, 준비한 각 효소용액과 동량혼합하여 37℃에서 24시간 반응시킨 다음, 5N HCl을 이용해 pH를 4.5로 재조정하여 항균활성을 평가하였다.
- Acetic acid와 lactic acid (2:1) 혼합액을 첨가해 pH 4.3으로 조정한 MRS broth에 전배양액을 2% 접종하여 30℃에서 배양하면서 24, 36, 48시간 후의 생균수를 측정한 다음, 접종 시 측정한 초기 균수 대비 각 배양시간에서의 생존율을 계산하여 내산성의 지표로 사용하였다[17].
- 또한, α-amylase, lipase, pepsin, proteinase K 처리가 항균활성에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 보아 이들 균주의 항균물질은 탄수화물, 지질을 포함하지 않으며 동시에 비단백질성 물질로 추정된다. B. cereus를 지시균으로 사용한 pH에 대한 안정성은 pH를 조정하지 않은 배양 상등액(pH 4.5)에서 나타난 항균활성을 대조군으로 평가하였다. pH를 5로 조정한 경우, 활성이 50% 이하로 감소하였으며, pH 6.
- 항균활성 평가를 위한 공시균 Bacillus cereus KCCM11341, Listeria monocytogenes ATCC19111, Staphylococcus aureus ATCC12692, Salmonella typhimurium KCCM11862, Vibrio parahaemolyticus KTCT3603은 Korean Culture Center for Microorganisms (KCCM), Korean Collection for Type Culture (KCTC), ATCC the global bioresource center로부터 구입하였고, Escherichia coli O157:H7 933 균주는 경원대학교 식품생물공학과 박종현 교수로부터 분양받았다(Table 3). L. monocytogenes는 Brain Heart Infusion (BHI) broth (Difco), V. parahaemolyticus는 marine broth (Difco)에 배양하였고 나머지 공시균주는 nutrient broth (Difco)에 각각 24시간 배양하여 사용하였다.
- pH에 따른 항균물질의 안정성 평가를 위하여 선발균주의 배양 상등액을 5N HCl과 5N NaOH를 사용하여 pH를 4에서 9까지 단계적으로 조절하고 4℃에서 24시간 방치시킨 다음, 원심분리(6,000×g, 20 min, 4℃)하여 회수한 상등액을 동결건조하였다.
- Lb. sakei 생육저해활성 보유 김치 유래 Leuconostoc 및 Weissella 속 68 유산균주의 산성조건(pH 4.3) 배지에서의 생존율을 검토하였고, Table 1에는 일부 균주의 결과를 나타내었다. 산성조건 배지에서 모든 균주는 배양시간이 길어짐에 따라 생존율이 감소하는 것으로 나타났고, KG6054, KM1211, CK0128, CK0633, KK0797, KK0798, KK0717 균주를 제외한 모든 균주가 48시간 배양에 의해 생존하지 못하는 것으로 나타났다.
- sakei KCTC3603을 각각 1%(v/v) 접종한 다음, 30℃에서 배양하면서 시간에 따른 흡광도(660 nm)를 측정하여 조항균물질에 의한 Lb. sakei의 생육저해를 측정하였다[29].
- monocytogenes, Sal. typhimurium, St. aureus, V. parahaemolyticus에 대한 생육저해활성을 확인하였다(Table 3). CK0128, CK0633, KK0797 균주가 생산하는 분획한 3,000 Da 이하의 조항균물질은 L.
- 김치로부터 분리한 유산균주는 MRS broth (Difco, USA)를 사용하여 30℃ 미호기적 조건에서 배양하였고, 고체배지의 제조에는 한천을 1.6% (w/v) 첨가하였다.
- 내산성 및 EPS 생산이 상대적으로 우수하게 나타난 CK0128, CK0633, KK0797 균주를 김치발효용 종균 후보로 선정하고, 이들이 생산하는 항균물질의 대략적인 분자량을 추정하였다. 균주들의 배양액으로부터 얻어진 조항균물질을 분자량 3,000 Da을 기준으로 분획하여 지시균 St.
- 동결건조하여 0.01 g/ml의 농도로 멸균수에 녹인 분자량 3,000 Da 이하의 조항균물질을 paper disk에 20 µl 첨가한 다음, 30℃에서 24시간 배양하여 생육저해환을 확인하였다.
- 분자량 3,000 Da을 기준으로 분획하여 동결건조한 조항균물질을 동결건조 전 부피의 1/20에 해당하는 멸균수에 녹여 각각 paper disk에 20 µl 첨가한 다음, 30℃에서 24시간 배양하여 형성된 생육저해환(clear zone)의 크기를 활성으로 평가하였다[29].
- 선발된 내산성 균주 CK0128, CK0633, KK0797이 생산하는 항균물질의 열, 효소, pH에 대한 안정성을 조사하였다(Table 2). 분획한 3,000 Da 이하의 조항균물질은 모두 121℃, 15분의 열처리에도 불구하고 지시균에 대한 항균활성을 유지함으로써 열에 대한 높은 안정성을 나타내었다.
- 세포 외 다당류(exopolysaccharides, EPS) 생성은 phenylethyl alcohol agar (Difco)에 sucrose를 2% 첨가한 PES agar를 이용하였고, 30℃ 배양에서 colony 주변에 생성되는 점질물질의 지름을 측정하여 EPS 생성능으로 간주하였다[31].
- 열에 대한 안정성은 분획하여 동결건조한 분자량 3,000 Da 이하의 조항균물질을 0.01 g/ml 농도로 물에 녹여 4℃, 30℃, 50℃, 70℃에서 24시간, 100℃에서 5분 및 30분, 121℃에서 15분간 처리한 후 잔존하는 항균활성을 평가하였다.
- 45 µm membrane filter (Gelman Science, USA)로 제균하여 조항균물질을 얻었다. 조항균물질을 Amicon Ultra-15 centrifugal filter devices 3K (Millipore, USA)를 이용하여 분자량 3,000 Da 이상과 이하의 분획으로 나누고 각각을 동결건조하였다(FD8512, Ilshinbio, Korea). 분자량에 따라 분획한 조항균물질은 agar disk diffusion method [44]에 의해 항균활성을 검토하였다.
- 지시균으로 사용한 St. aureus ATCC12692 약 107 CFU/ml 농도 배양액 700 µl를 nutrient agar (Difco)에 도말 후, 배양액이 건조되면 살균된 paper disk (Ø 6 mm, Whatman, UK)를 올려놓았다.
대상 데이터
- aureus의 생육저해환 크기를 활성으로 간주하였다. 단 St. aureus의 생장범위를 벗어나는 pH 4 이하의 안정성 실험 조건에서는 비교적 넓은 pH 범위에서 생장하는 B. cereus KCCM11341을 지시균으로 사용하였다. 안정성 평가를 위한 지시균의 배양에는 nutrient broth 또는 nutrient agar를 사용하였다.
- cereus KCCM11341을 지시균으로 사용하였다. 안정성 평가를 위한 지시균의 배양에는 nutrient broth 또는 nutrient agar를 사용하였다.
- 6% (w/v) 첨가하였다. 항균활성 평가를 위한 공시균 Bacillus cereus KCCM11341, Listeria monocytogenes ATCC19111, Staphylococcus aureus ATCC12692, Salmonella typhimurium KCCM11862, Vibrio parahaemolyticus KTCT3603은 Korean Culture Center for Microorganisms (KCCM), Korean Collection for Type Culture (KCTC), ATCC the global bioresource center로부터 구입하였고, Escherichia coli O157:H7 933 균주는 경원대학교 식품생물공학과 박종현 교수로부터 분양받았다(Table 3). L.
이론/모형
- Anti-bacterial activity was determined by agar disk diffusion method. Cell-free fraction with molecular weight smaller than 3,000 Da was used for anti-bacterial activity spectrum test.
- 조항균물질을 Amicon Ultra-15 centrifugal filter devices 3K (Millipore, USA)를 이용하여 분자량 3,000 Da 이상과 이하의 분획으로 나누고 각각을 동결건조하였다(FD8512, Ilshinbio, Korea). 분자량에 따라 분획한 조항균물질은 agar disk diffusion method [44]에 의해 항균활성을 검토하였다. 지시균으로 사용한 St.
- 선발된 내산성 균주가 생산하는 항균물질의 각종 식중독균에 대한 항균활성을 agar disk diffusion method를 이용하여 검토하였다. 약 107 CFU/ml 농도의 공시균 배양액 700 µl를 nutrient agar에 도말한 후, 공시균 용액이 건조되면 살균된 paper disk를 올려놓았다.
- 항균물질의 열, 효소 및 pH에 대한 안정성은 agar disk diffusion method를 이용하여 평가하였고, 지시균 St. aureus의 생육저해환 크기를 활성으로 간주하였다. 단 St.
성능/효과
- 지금까지 진행된 김치발효 관련 미생물 연구에 따르면 바람직한 김치발효 종균의 조건은 다음과 같이 정리된다. 1) hetero 발효형 유산균은 homo 발효형에 비해 산 생성이 많지 않아 김치의 유통기한 연장에 도움이 되고, CO2를 생성하여 상큼한 맛과 좋은 풍미를 가진 김치 생산에 기여할 수있다[6, 10, 15, 16]. 2) 발효의 진행에 따라 계속적으로 증가하는 산에 대한 내산성은 종균의 역할을 발효 후기까지 유지시켜 주는데 도움을 줄 수 있다[17, 23, 24].
- 1) hetero 발효형 유산균은 homo 발효형에 비해 산 생성이 많지 않아 김치의 유통기한 연장에 도움이 되고, CO2를 생성하여 상큼한 맛과 좋은 풍미를 가진 김치 생산에 기여할 수있다[6, 10, 15, 16]. 2) 발효의 진행에 따라 계속적으로 증가하는 산에 대한 내산성은 종균의 역할을 발효 후기까지 유지시켜 주는데 도움을 줄 수 있다[17, 23, 24]. 3) 다량의 유기산을 생성하는 homo 발효형 유산균에 대한 생육억제는 산의 생성을 감소시켜 가식기간 연장에 도움이 된다[14].
- 2) 발효의 진행에 따라 계속적으로 증가하는 산에 대한 내산성은 종균의 역할을 발효 후기까지 유지시켜 주는데 도움을 줄 수 있다[17, 23, 24]. 3) 다량의 유기산을 생성하는 homo 발효형 유산균에 대한 생육억제는 산의 생성을 감소시켜 가식기간 연장에 도움이 된다[14]. 4) 상업적으로 생산된 김치는 모두 저온에서 유통되기 때문에 저온에서의 생장은 종균이 우점종으로 정착하는데 필요한 특성이다[42].
- 4) 상업적으로 생산된 김치는 모두 저온에서 유통되기 때문에 저온에서의 생장은 종균이 우점종으로 정착하는데 필요한 특성이다[42]. 5) 식중독균 및 식품위해 세균에 대한 생육억제능은 김치의 안전성 확보에 기여할 수 있다[4,9,13, 14,35].이러한 특성들과 함께, 김치의 관능적 우수성이 종균에 의해 확보되어야 하며, 면역증진 효과와 같은 건강기능성이 입증된다면 발효식품용 종균으로써 뿐만 아니라 건강기능식품 소재로 발전할 수 있을 것이다.
- parahaemolyticus에 대한 생육저해활성을 확인하였다(Table 3). CK0128, CK0633, KK0797 균주가 생산하는 분획한 3,000 Da 이하의 조항균물질은 L. monocytogenesis에 대해 다소 낮은 생육저해활성을 보였으나 본 실험에서 사용한 그람 양성 및 음성 균들에 대하여 폭넓은 항균력을 나타내었다.
- 최근에는 유산균의 내산성 및 담즙산 내성이 EPS 생산과 비례한다는 보고에 따라 EPS 생산이 생균제 선발의 지표로 고려되고 있다[1, 2]. EPS의 생산은 내산성이 높은 균주 일수록 높다는 보고에 따라, 68균주에 대한 EPS 생산을 확인한 결과, Leuconostoc mesenteroides와 Weissella cibaria, Weissella confusa 균주는 모두 EPS를 생산하였다(Table 1, Fig. 1). 그러나, Leuconostoc citreum 균주들 중, CK0496 균주는 0.
- 발효 후기까지 생존할 수 있는 김치발효용 hetero 발효형 종균 선발을 위하여 이들 균주에 대한 내산성을 평가한 결과, Lc. mesenteroides CK0128, W. cibaria CK0633, W. cibaria KK0797 균주가 acetic acid와 lactic acid 혼합용액을 이용하여 pH를 4.3으로 조정한 MRS broth에서 상대적으로 높은 생존율을 보였고, 다량의 세포 외 다당류를 생산하였다. 세균주가 생산하는 항균물질의 분자량은 3,000 Da 이하로 추정되며 Staphylococcus aureus와 Lb.
- 내산성 및 EPS 생산이 상대적으로 우수하게 나타난 CK0128, CK0633, KK0797 균주를 김치발효용 종균 후보로 선정하고, 이들이 생산하는 항균물질의 대략적인 분자량을 추정하였다. 균주들의 배양액으로부터 얻어진 조항균물질을 분자량 3,000 Da을 기준으로 분획하여 지시균 St. aureus에 대한 생육저해를 확인한 결과 3,000 Da 이상의 분획에서는 활성이 나타나지 않았으나, 3000 Da 이하의 분획에서는 3 균주 모두로부터 활성이 나타나, 항균물질의 분자량이 3,000 Da 이하인 것으로 확인되었다(Fig. 2).
- 1). 그러나, Leuconostoc citreum 균주들 중, CK0496 균주는 0.6 mm의 높은 EPS 생성을 보였지만 KK0512 균주는 생성을 보이지 않았고, 48시간 배양에서 생존하지 않는 W. cibaria CK0232, CK0235, CK0487 균주가 높은 EPS 생성능을 나타내었으며, Weissella paramesenteroides는 배양 48시간에 25%의 높은 생존율을 보였지만 EPS는 생산하지 않았다. 본 연구에 사용한 균주들의 경우, 내산성과 EPS 생산과의 비례관계가 확인되지 않고, 동일한 종(species) 내의 균주들 간에도 내산성과 EPS 생산이 무관한 것으로 나타나, 내산성과 EPS 생산은 균주 특이적인 특성으로 추정된다.
- sakei와 식중독균의 생육을 저해하는 항균물질을 생산한다. 따라서 발효가 진행되어 상당한 양의 유기산이 생성된 발효 후기 김치에 생존하면서 homo 발효형 유산균의 생육억제를 통한 유기산의 생산을 지연하여 가식기간 및 유통기한 연장에 기여할 수 있는 효과적인 김치발효 종균으로써의 가능성을 지니고 있는 것으로 평가된다. 더불어 이들 균주는 EPS 생성능을 보유하고 있어 생성되는 EPS의 건강기능성이 과학적으로 규명된다면 건강기능성 발효균주로써 이용가치가 높아질 것으로 예상된다.
- cibaria CK0232, CK0235, CK0487 균주가 높은 EPS 생성능을 나타내었으며, Weissella paramesenteroides는 배양 48시간에 25%의 높은 생존율을 보였지만 EPS는 생산하지 않았다. 본 연구에 사용한 균주들의 경우, 내산성과 EPS 생산과의 비례관계가 확인되지 않고, 동일한 종(species) 내의 균주들 간에도 내산성과 EPS 생산이 무관한 것으로 나타나, 내산성과 EPS 생산은 균주 특이적인 특성으로 추정된다. 본 연구의 결과가 기존의 결과와 상이한 이유로 EPS 생산을 측정한 실험법의 차이를 들 수 있겠지만, 내산성과 EPS 생산과의 비례 관계에 대한 연구가 일부 연구자들에 의해 제한적으로 진행되었기 때문에 추가적인 연구가 필요한 것으로 평가된다[1, 2].
- 본 연구자들은 최근 김치발효 후기 우점종으로 알려진 homo 발효형 유산균 Lactobacillus sakei의 생육을 저해하는 hetero 발효형 유산균 Leuconostoc 및 Weissella 속 68균주를 분리하였다[29]. Leuconostoc 및 Weissella 속은 포도당을 비롯한 당류를 기질로 생육하여 lactic acid, acetic acid, alcohol, CO2를 생성함으로써 김치의 풍미를 증진시키고, Lb.
- sakei에 대한 생육저해를 나타내었다. 분획한 3,000 Da 이하의 조항균물질 모두가 121℃, 15분의 열처리에도 항균활성을 유지함으로써 항균물질의 열에 대한 높은 안정성이 확인되었다. pH의 감소에 따른 항균활성의 증가가 pH 5 이하의 산성조건에서 확인되어,이들 항균물질은 pH 5 이하의 산성조건에서 활성을 갖는 것으로 추정된다.
- 선발된 내산성 균주 CK0128, CK0633, KK0797이 생산하는 항균물질의 열, 효소, pH에 대한 안정성을 조사하였다(Table 2). 분획한 3,000 Da 이하의 조항균물질은 모두 121℃, 15분의 열처리에도 불구하고 지시균에 대한 항균활성을 유지함으로써 열에 대한 높은 안정성을 나타내었다. 또한, α-amylase, lipase, pepsin, proteinase K 처리가 항균활성에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 보아 이들 균주의 항균물질은 탄수화물, 지질을 포함하지 않으며 동시에 비단백질성 물질로 추정된다.
- 3) 배지에서의 생존율을 검토하였고, Table 1에는 일부 균주의 결과를 나타내었다. 산성조건 배지에서 모든 균주는 배양시간이 길어짐에 따라 생존율이 감소하는 것으로 나타났고, KG6054, KM1211, CK0128, CK0633, KK0797, KK0798, KK0717 균주를 제외한 모든 균주가 48시간 배양에 의해 생존하지 못하는 것으로 나타났다. 이들 균주들은 생존율을 결정한 모든 배양시간에서 높은 생존율을 나타내었고, 특히 48시간 배양에서 각각 27%, 36%, 32%의 생존율을 나타낸 CK0128, CK0633, KK0797 균주가 68균주 중, 상대적으로 높은 내산성을 나타내었다.
- 산성조건 배지에서 모든 균주는 배양시간이 길어짐에 따라 생존율이 감소하는 것으로 나타났고, KG6054, KM1211, CK0128, CK0633, KK0797, KK0798, KK0717 균주를 제외한 모든 균주가 48시간 배양에 의해 생존하지 못하는 것으로 나타났다. 이들 균주들은 생존율을 결정한 모든 배양시간에서 높은 생존율을 나타내었고, 특히 48시간 배양에서 각각 27%, 36%, 32%의 생존율을 나타낸 CK0128, CK0633, KK0797 균주가 68균주 중, 상대적으로 높은 내산성을 나타내었다.
- 이러한 pH 저하에 따른 활성의 증가는 pH에 의한 지시균의 생육저해를 배제할 수 없지만, 균주에 따른 생육저해의 차이가 나타나는 점으로 보아 항균물질에 의한 생육저해가 작용하고 있는 것으로 추정된다. 이상의 결과로부터 CK0128, CK0633, KK0797이 생산하는 항균물질은 pH 5 이하의 산성조건에서 활성을 갖는 비단백질성 물질로 추정된다.
후속연구
- 따라서 발효가 진행되어 상당한 양의 유기산이 생성된 발효 후기 김치에 생존하면서 homo 발효형 유산균의 생육억제를 통한 유기산의 생산을 지연하여 가식기간 및 유통기한 연장에 기여할 수 있는 효과적인 김치발효 종균으로써의 가능성을 지니고 있는 것으로 평가된다. 더불어 이들 균주는 EPS 생성능을 보유하고 있어 생성되는 EPS의 건강기능성이 과학적으로 규명된다면 건강기능성 발효균주로써 이용가치가 높아질 것으로 예상된다.
- 본 연구에 사용한 균주들의 경우, 내산성과 EPS 생산과의 비례관계가 확인되지 않고, 동일한 종(species) 내의 균주들 간에도 내산성과 EPS 생산이 무관한 것으로 나타나, 내산성과 EPS 생산은 균주 특이적인 특성으로 추정된다. 본 연구의 결과가 기존의 결과와 상이한 이유로 EPS 생산을 측정한 실험법의 차이를 들 수 있겠지만, 내산성과 EPS 생산과의 비례 관계에 대한 연구가 일부 연구자들에 의해 제한적으로 진행되었기 때문에 추가적인 연구가 필요한 것으로 평가된다[1, 2].
- 5) 식중독균 및 식품위해 세균에 대한 생육억제능은 김치의 안전성 확보에 기여할 수 있다[4,9,13, 14,35].이러한 특성들과 함께, 김치의 관능적 우수성이 종균에 의해 확보되어야 하며, 면역증진 효과와 같은 건강기능성이 입증된다면 발효식품용 종균으로써 뿐만 아니라 건강기능식품 소재로 발전할 수 있을 것이다.
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