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문제 정의
- 그러나 아직까지 국소비만에 미치는 비파엽약침에 대한 연구보고가 없어, 이에 본 연구자는 고지방식이로 유도된 비만 생쥐에서 비파엽을 이용하여 약침을 제조하였으며 이를 고지방식이로 유발된 비만 생쥐를 이용하여 in vivo 약리효능을 연구하여 국소부위 항비만 효과를 연구하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
- 현재 비만을 치료하기 위한 방법으로 식습관 개선, 운동요법, 약물치료, 약침요법, 지방흡입술, 위 절제술과 같은 수술요법이 있으나 주로 행해지는 약물치료법은 현재 사용 가능한 비만치료 약물이 fluoxetine, orlistat, sibutramine, rimonabant 등 소수에 불과하고 장기 사용에 따른 약물의 부작용이 발생한다. 따라서 본 연구자는 부작용이 없고 효과적이면서 안전한 천연 한약재로 비만치료법 중 하나인 약침요법을 통해 국소부위 지방 조직을 유의성 있게 경감시킬 수 있는 연구를 수행하였다7-9).
- 이중 약물요법은 빠른 시간 내에 효과를 볼 수 있다는 장점이 있으나 약물 부작용이란 추가적인 고통이 따른다. 따라서 본 연구자는 비만 약물요법으로 부작용이 거의 없는 천연 한약재를 이용하여 치료법 중 하나인 약침요법을 통해 국소부위 지방 조직을 유의성 있게 경감시킬 수 있는 항비만 효과를 연구하였다.
제안 방법
- 실험동물은 plastic mouse cage에 보관하여 동물실험실에서 온도 22±2℃, 상대 습도 50±5%, light/dark cycle(12 h/12 h)의 조건하에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 1주일 후 고지방식이(high fat diet)로 식이를 대체하였으며, 식이 1주일 후 체중을 측정하여 비만이 유발된 마우스만을 선별하여 변량인자의 수준을 선택한 후 모수인자를 무작위로 택하여 실험하는 방법인 난괴법을 사용하여 3그룹으로 분리하였다. 8주 동안 실험하였으며 물과 식이는 자유급식하였다.
- 체중은 주 1회, 사료섭취량(food intake)은 주 3회 측정하였다. 4주 동안은 하루에 1회, 후반 4주 동안은 2일에 1회 복강 및 피하로 약침 주입을 시행하였다(Fig. 1).
- 1주일 후 고지방식이(high fat diet)로 식이를 대체하였으며, 식이 1주일 후 체중을 측정하여 비만이 유발된 마우스만을 선별하여 변량인자의 수준을 선택한 후 모수인자를 무작위로 택하여 실험하는 방법인 난괴법을 사용하여 3그룹으로 분리하였다. 8주 동안 실험하였으며 물과 식이는 자유급식하였다.
- 그러나 아직까지 비파엽약침에 대한 항비만 효능은 연구되지 않았으며, 비파엽약침의 비만 예방 효과를 조사하기 위하여 8주 동안 45 %(W/W)의 지방이 함유된 고지방식이를 실험대조군(HFD군)으로 공급하면서 실험군에 비파엽약침(50 mg/kg)을 복부 주입하였다. 정상대조군은 16 % 지방을 포함하고 있는 식이를 8주간 공급한 후 체중증가율, 사료섭취량, 사료효율을 조사하였다.
- 지방은 일률적으로 마우스 기준 왼쪽 부위를 분리하였으며 부고환주위지방, 신장주위지방, 복부피하지방을 합하여 총 지방 무게를 정밀저울(Mettler toledo EL202, Greifensee, Switzerland)을 이용하여 측정하여 이를 절대중량으로 기록하여 분석하였다. 또한 절대 중량을 체중으로 나눈 상대중량을 측정하였다.
- 비파엽약침 처치가 고지방식이로 유발된 비만 생쥐에서 사료섭취량 및 체중 변화에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 normal군(이하 N군), HFD군 및 HFD+E군 간의 사료 섭취량은 유의적 차이가 없었다(Fig.
- 실험동물에서 적출한 간조직 및 지방조직을 10 % neutral buffered formalin을 사용하여 고정하고 탈수 및 포매 과정을 거쳐 파라핀 블록을 제작하였다. 파라핀 블록을 두께 5 ㎛의 관상 절편으로 제작한 후 xylene을 이용하여 파라핀을 제거하고, 100, 95, 90, 80, 70 % alcohol로 친수화한 후 Hematoxylin&Eosin(H&E) 염색을 한 후 Canada balsam으로 봉입하고 광학현미경(Olympus optical microscope BX51, Japan)으로 관찰하였다.
- 실험동물은 plastic mouse cage에 보관하여 동물실험실에서 온도 22±2℃, 상대 습도 50±5%, light/dark cycle(12 h/12 h)의 조건하에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 요컨대 비파엽은 지방세포 분화를 억제한다는 연구결과가 있으며, 이와 관련하여 비파엽 약침액을 제조하여 고지 방식이로 비만을 유도시킨 생쥐의 국소지방에 미치는 영향을 관찰하였다. 비파엽약침액은 간독성이 없고, 국소부위 지방세포 증식 및 크기를 억제하여 지방 축적을 유의성 있게 줄였고, adiponectin 발현 증가를 통해 HDL의 수치를 유의성 있게 높이고 내장지방의 무게를 유의성 있게 감소시켰다.
- 그러나 아직까지 비파엽약침에 대한 항비만 효능은 연구되지 않았으며, 비파엽약침의 비만 예방 효과를 조사하기 위하여 8주 동안 45 %(W/W)의 지방이 함유된 고지방식이를 실험대조군(HFD군)으로 공급하면서 실험군에 비파엽약침(50 mg/kg)을 복부 주입하였다. 정상대조군은 16 % 지방을 포함하고 있는 식이를 8주간 공급한 후 체중증가율, 사료섭취량, 사료효율을 조사하였다. 분석 결과, 고지방식이 비만유도 대조군과 정상군 및 비파엽약침액 투여군의 사료섭취율 간에는 유의적인 차이가 보이지 않았다.
- 지방은 일률적으로 마우스 기준 왼쪽 부위를 분리하였으며 부고환주위지방, 신장주위지방, 복부피하지방을 합하여 총 지방 무게를 정밀저울(Mettler toledo EL202, Greifensee, Switzerland)을 이용하여 측정하여 이를 절대중량으로 기록하여 분석하였다. 또한 절대 중량을 체중으로 나눈 상대중량을 측정하였다.
- 본 실험에 사용한 고지방식이는 피드랩(Guri, Korea)에서 공급받았으며 정상식이 (AIN-93G)와 고지방식이(high fat 45% diet)의 조성은 Table 1과 같다. 체중은 주 1회, 사료섭취량(food intake)은 주 3회 측정하였다. 4주 동안은 하루에 1회, 후반 4주 동안은 2일에 1회 복강 및 피하로 약침 주입을 시행하였다(Fig.
- 그 후 혈액을 3,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 혈청을 분석에 사용하였다. 총 콜레스테롤(total cholesterol, TC), 중성지방(triglyceride, TG), 고밀도지단백(high density lipoprotein, HDL-cholesterol), 저밀도지단백(low density lipoprotein, LDL-cholesterol), alanine aminotransferase(ALT), asparate aminotransferase(AST)를 시판 시약(Sentron GmbH, Dresden, Germany)을 구입하여 생화학분석기(METROLAB 1600DR, Argentina)를 이용하여 측정하였다.
- 파라핀 블록을 두께 5 ㎛의 관상 절편으로 제작한 후 xylene을 이용하여 파라핀을 제거하고, 100, 95, 90, 80, 70 % alcohol로 친수화한 후 Hematoxylin&Eosin(H&E) 염색을 한 후 Canada balsam으로 봉입하고 광학현미경(Olympus optical microscope BX51, Japan)으로 관찰하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 고지방식이는 피드랩(Guri, Korea)에서 공급받았으며 정상식이 (AIN-93G)와 고지방식이(high fat 45% diet)의 조성은 Table 1과 같다. 체중은 주 1회, 사료섭취량(food intake)은 주 3회 측정하였다.
- 본 연구에서 사용한 비파엽(leaves of Eriobotrya japonica Lindley)은 옴니허브(Youngchun, Korea)에서 구입한 것을 대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실에서 관능검사상 약전에 합격한 것만을 정선하여 사용하였다. 枇杷葉 200 g에 증류수 1 L를 첨가하여 열탕 추출기에서 3시간 추출하여 얻은 추출 여과액을 감압농축(45 ℃)한 후 동결건조기를 이용하여 얻은 분말가루를 deep freezer(-84 ℃)에 보관하였다.
- 시판 중인 ELISA kit(영인프론티어, Korea)를 구입하여 adiponectin 및 leptin 을 측정하였다. 혈청을 분리한 후 완충용액으로 1 : 9로 희석(10 ㎕ 혈청에 90 ㎕ sample diluent buffer를 섞어 희석하여 sample을 제작)하여 총 용량을 100 ㎕로 맞추어 둔다.
- 실험에 사용한 마우스는 4주령의 웅성 ICR 마우스를 (주) 오리엔트(Sungnam, Korea)에서 구입하였다. 실험동물은 plastic mouse cage에 보관하여 동물실험실에서 온도 22±2℃, 상대 습도 50±5%, light/dark cycle(12 h/12 h)의 조건하에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 각 군의 결과값에 대해 one-way ANOVA 분석 후 Duncan’s multiple range test를 이용하여 p-value가 p<0.05 이하인 경우 통계적인 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 모든 실험 결과는 SPSS for windows(Release 14.0K, SPSS Inc, USA)를 이용하여 분석하였으며, 분석결과는 평균±표준편차로 나타내었다.
성능/효과
- 6). HDL-C/LDL-C를 분석해본 결과, HFD+E군(3.19)이 HFD군(1.07)에 비해 약 3배가량 증가하였으나 유의성은 보이지 않았다(Fig. 6).
- 간의 상대 중량을 측정한 결과, N군, HFD군 및 HFD+E군 사이의 상대 중량은 유의성이 없었다. 그러나 지방조직 상대 중량을 분석한 결과, HFD군 지방무게가 1.
- 고지방식이로 비만이 유발된 생쥐에서의 비파엽약침이 체중증가에 미치는 영향을 조사해본 결과, N군에 비해 HFD군의 체중이 증가하였으며, 이는 실험 종료 시 8주까지 체중이 증가하였음을 알 수 있었다. 반면에 비파엽약침을 50 mg/kg 농도로 각각 복강 주입한 HFD+E군의 체중은 4주부터 8주까지 HFD군에 비해 유의성 있게 체중이 감소하였다(Fig.
- 비파엽약침 처치가 고지방식이로 유발된 비만 생쥐에서 사료섭취량 및 체중 변화에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 normal군(이하 N군), HFD군 및 HFD+E군 간의 사료 섭취량은 유의적 차이가 없었다(Fig. 2).
- 그러나 지방조직 상대 중량을 분석한 결과, HFD군 지방무게가 1.88±0.40%로 N군의 지방무게 1.15±0.14 %에 비해 유의성 있게 증가하였고(*p<0.05), HFD+E군의 지방 상대중량은 1.0±0.39 %로 HFD군에 비해 유의성 있게 감소하였다(#p<0.05)(Fig. 4).
- 즉 leptin은 식욕조절과 지방대사를 총체적으로 조절한다고 할 수 있다. 그러나 혈청 내 leptin 분비량은 실험군 간에 유의성 있는 변화가 없었고, adiponectin의 농도는 비파엽 약침군에서 유의성 있는 증가를 보였다. 이러한 adiponectin의 증가는 HLD의 증가, LDL의 감소 결과와 일치한다34-37).
- 단위면적당 지방세포 수를 비교한 결과, HFD군(75.3±9.1 cells/25 ㎛2)은 N군(99.9±9.7 cells/25 ㎛2)에 비해 유의성 있게 지방세포 수가 감소하였고, HFD+E 군의 단위면적당 지방세포 수(90.5±8.4 cells/25 ㎛2)는 HFD군보다 유의성 있게 증가하였다(Fig. 8).
- 따라서 비만 약침액은 국소부위의 지방 크기 및 무게 감소뿐만 아니라, 내장의 지방 축적을 감소시키고 전신 혈액학적으로 총콜레스테롤, 중성지방 및 저밀도지질단백질의 혈청 내 함량을 유의성 있게 감소시켰으며, 반대로 고밀도 지질단백질의 함량은 유의성 있게 증가시켰다. 이러한 결과는 Fig.
- 반면 LDL-C는 HFD+E군(34.3±3.53 mg/dl)으로 HFD군(63.64±7.26 mg/dl)보다 유의성 있게 감소하였으며(#p<0.05), N군(40.19±8.02 mg/dl) 보다 더 감소한 결과를 보여주었다(Fig. 6).
- 복벽 피하지방, 부신 주위 지방과 부고환 주위 지방을 각각 적출하여 육안으로 관찰한 결과 N군에 비해 HFD군의 지방 크기가 증가되었음을 볼 수 있었으며, HFD+E군의 지방 조직은 HFD군에 비해 크기가 감소하였음을 관찰할 수 있었다(Fig. 5).
- 정상대조군은 16 % 지방을 포함하고 있는 식이를 8주간 공급한 후 체중증가율, 사료섭취량, 사료효율을 조사하였다. 분석 결과, 고지방식이 비만유도 대조군과 정상군 및 비파엽약침액 투여군의 사료섭취율 간에는 유의적인 차이가 보이지 않았다. 이는 사료 효율면에서 차이가 없다는 의미이며, 식욕과 관련된 중추신경계에 미치는 영향은 없는 것으로 판단된다.
- 요컨대 비파엽은 지방세포 분화를 억제한다는 연구결과가 있으며, 이와 관련하여 비파엽 약침액을 제조하여 고지 방식이로 비만을 유도시킨 생쥐의 국소지방에 미치는 영향을 관찰하였다. 비파엽약침액은 간독성이 없고, 국소부위 지방세포 증식 및 크기를 억제하여 지방 축적을 유의성 있게 줄였고, adiponectin 발현 증가를 통해 HDL의 수치를 유의성 있게 높이고 내장지방의 무게를 유의성 있게 감소시켰다. 이에 대해 향후 약침액의 분획을 통한 유효성분 및 약리활성 rich fraction에 대한 심도 있는 연구가 필요하다고 판단된다
- 약물의 독성, 지방간, 알코올의 섭취, 고지방섭취로 인한 지방대사 이상 등의 이유로 간에 염증이나 세포의 파괴가 일어나면 정상적인 양보다 더 많은 AST, ALT가 혈액 속으로 분비된다. 비파엽약침액의 간독성 및 지방간에 의한 세포 독성에 미치는 영향을 알아본 결과, 정상군에 비해 비만유도 대조군의 AST, ALT 함량이 혈청 내에서 유의성 있게 증가한 반면에 비파엽약침액 투여군의 AST, ALT 함량은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다. 이는 비파엽약침에 간독성이 없다는 의미이며, 아울러 지방대사 이상으로 인한 간세포 파괴를 억제했다는 것을 시사한다(Fig.
- 실험 종료 후, 장기 적출을 통해 간과 지방을 분리하였으며, 간과 지방조직의 절대 중량을 측정한 결과, N군보다 HFD군의 간 및 지방조직 무게가 유의성 있게 증가하였음을 알 수 있었으며(*p<0.05), HFD+E군의 간 및 지방조직 무게는 1.45±0.27 g, 0.37±0.16 g로 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다(#p<0.05).
- 조직학적 분석결과, 대조군에서 간 손상이 진행된 것을 확인할 수 있었으며, 정상군과 HFD+E의 간 조직 손상은 보이지 않았다. 단위면적당 지방세포 수를 비교한 결과, HFD군(75.
- 이러한 결과는 식욕억제 호르몬인 leptin 분석 결과와 일치된다. 체중 측정 결과 비만유도 대조군은 정상군에 비해 5주부터 유의성 있는 증가를 보였고, 비파엽약침액 투여군 생쥐의 체중은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다. 체중 감소 결과는 간조직과 지방 조직의 무게 측정 결과와 일치하는 결과로 비파엽약침 주입군에서의 간 및 지방조직의 절대 중량과 상대 중량이 대조군에 비해 유의성 있게 감소된 것을 볼 수 있다.
- 총 콜레스테롤 함량은 HFD+E군에서 170.7±16.4 mg/dl로 측정되어 HFD군의 210.4±15.4 mg/dl보다 유의적으로 감소하였다.
- 혈액생화학적 분석결과, 대조군의 간 손상 지표인 AST, ALT는 91.2±16.4 U/L, 62.4±14.7 U/I로 정상군의 AST, ALT보다 유의성 있게 증가하였으며, HFD+E군의 혈청 내 AST, ALT 함량은 각각 43.4±5.5 U/L, 18.5±1.7 U/L로 유의성 있게 감소하였다.
- 체내 항상성에 의해 균형을 이루고 있는 체내 지질 균형이 깨어지면 LDL-C는 증가하고, HDL-C는 감소하여 동맥경화증, 고혈압 및 심혈관계 질환을 유발한다. 혈청 HDL-C은 HFD군에 비해 HFD+E군에서 유의성 있게 증가하였으며, HFD군은 정상군에 비해 유의하게 감소하였다. 반면 LDL-C는 HFD+E군의 혈청 내 함량이 34.
- 혈청 HDL-C은 HFD군의 67.56±6.53 mg/dl에 비해 HFD+E군의 107.11±18.25 mg/dl에서 증가하였으며(#p<0.05), HFD군(67.6±6.5 mg/dl)은 N군(103.97±12.81 mg/dl)에 비해 유의하게 감소하였다.
- 혈청 내 adiponectin 함량 분석 결과, HFD 군은 2.06±1.48 ng/ml로 N군의 4.51±2.04 ng/ml에 비해 현저하게 adiponectin 함량이 감소하엿고(*p<0.05), HFD+E군의adiponectin 함량은 12.30±4.53 ng/ml로 HFD군보다 유의성 있게 증가하였다(#p<0.05).
- 혈청 내 leptin 함량 분석 결과 N군, HFD군 그리고 HFD+E군 간의 leptin 함량은 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 7).
- 혈청 내 leptin 함량 분석결과, N군과 HFD군, 그리고 HFD+E군 간의 leptin 함량은 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 7).
후속연구
- 비파엽약침액은 간독성이 없고, 국소부위 지방세포 증식 및 크기를 억제하여 지방 축적을 유의성 있게 줄였고, adiponectin 발현 증가를 통해 HDL의 수치를 유의성 있게 높이고 내장지방의 무게를 유의성 있게 감소시켰다. 이에 대해 향후 약침액의 분획을 통한 유효성분 및 약리활성 rich fraction에 대한 심도 있는 연구가 필요하다고 판단된다
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