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문제 정의
- 본 연구에서는 현대인들의 대다수가 한번씩 경험했을 스트레스로 인한 수면장애에 대한 치료 보조제적 수단으로 해양생물인 굴과 다시마의 발효로 통해 생산된 GABA가 수면유도 호르몬에도 영향을 줄 것이라는 것에 주목하여 스트레스로 인한 긴장완화와 수면유도 증진에 대한 기능성에 대해 연구함으로써 굴∙다시마 발효 추출물에 함유된 GABA를 스트레스로 인한 긴장 완화 및 수면유도 기능성 식품소재로서 활용하기 위한 탐색과 기초자료를 확보하고자 한다.
제안 방법
- 24 well plate에 마우스 대식세포주 5×105개를 분주하고, 4시간 뒤에 새로운 배지로 교체한 후 일정농도 (2.5, 5.0, 10.0, mg/ mL)의 시료를 1시간 동안 전치리한 다음 LPS를 1 μg/mL로 16시간 동안 처리하였다.
- 24 well plate에 마우스 대식세포주 5×105개를 분주하고, 4시간 뒤에 새로운 배지로 교체한 후 일정농도(2.5, 5.0, 10.0, mg/ mL)의 시료를 24시간 동안 처리하였다.
- 이었다. DPPH radical 소거능은 H와 H0의 상대적인 radical signal peak 높이의 차이에 의하여 계산하였다.
- FSO의 세포독성에 대해 조사하기 위하여 MTT assay 시행하였고, 이에 대한 결과는 Fig. 6A에 나타내었다. Positive control 인 kojic acid의 경우 12.
- FSO의 항염증 실험에 대한 결과를 알아 보기 위해서 다양한 해조류 추출액의 항산화 활성 및 항염증에 대한 활성 보고를 참고하였으며(Ryu and Kim, 2006), 항염증 실험에 진행하기 위하여 MTT assay에서 세포 독성을 나타내지 않는 농도인 50 및 100 μg/mL에서 FSO 항염증 활성을 조사하였다.
- 굴 추출물은 상업용 가수분해효소(Alcalase)로 40ºC, 1시간 동안 효소 분해한 이후 60ºC, 1시간 동안 효소를 실활 시킨 이후 원심 분리하여 제조하였다.
- 굴∙다시마 발효분말(fermented sea tangle and oyster powder, FSO)은 다시마 추출액 45% (w/v), 굴 추출액 45% (w/v), yeast extracts 4 % (w/v), glucose 4% (w/v)를 각각 혼합하고, 멸균 (121℃에서 30분) 및 균주(2% L. brevis BJ20) 접종을 실시한 다음 발효 (37℃에서 24시간) 및 재멸균(121℃에서 30분)하고 건조하여 제조하였다. 제조된 발효 분말을 이용하여 항산화 및 항염증 활성 평가용 시료로 사용하였다.
- 다시마 추출물은 수세, 탈염, 분쇄공정을 거쳐 적당한 크기로 분쇄한 다음 여기에 16배의 물(w/v)을 첨가하고, 80℃에서 30분간 열수 추출한 다음 20 mesh 망으로 걸러 제조하였다. 굴 추출물은 상업용 가수분해효소(Alcalase)로 40ºC, 1시간 동안 효소 분해한 이후 60ºC, 1시간 동안 효소를 실활 시킨 이후 원심 분리하여 제조하였다.
- 스트레스에 인한 긴장 완화와 수면 증진에 효과가 있는 FSO의 제조를 위해서 굴과 다시마 추출물을 각각 다른 농도를 넣어 유산균 발효 시 최대 GABA 생산량을 비교 분석하였고, 그 결과는 Fig. 1과 Table 1에 나타내었다. 굴과 다시마 추출액의 농도는 각각 1:9 비율에서 9:1 비율까지 배지 조성 성분에 함유 시켰으며 그 결과 굴과 다시마의 함량이 5:5인 비율에서 잔존 글루탐산 함량 2.
- 시료 30 μL에 60 μM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 30 μL를 혼합 후 반응액을 100 μL quartz capillary tube에 옮겨 2분 후 electron spin resonance (ESR) spectrometer(JES-FA, JEOL Ltd, Tokyo, Japan)로 측정하였다.
- , 1995). 이러한 활성산소에 대한 보호 효과를 측정하기 위해서 FSO의 활성 산소 제거 능을 측정하였고, 그 결과는 Fig. 3에 나타내었다. 활성산소 제거능은 positive control인 BHA의 경우 50 μg/mL와 100 μg/mL의 농도에서 각각 56.
- 이어서 세포배양 상층액 100 μL를 96 well에 분취하고, Griess 용액(1% sulfanilamide/0.1% N-(1- naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H3PO4) 100μL를 첨가한 다음 5분간 반응 후 ELISA reader (Wallac 1420, BMS, USA)를 통해 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 즉, magnetic field, 336.5±5 mT; power, 10 mW; modulation frequency, 9.41 GHz; amplitude, 1×1,000; sweep time, 30 s; temperature, 298 K. superoxide radical 소거능은 H 와 H0의 상대적인 radical signal peak를 이용하는 수식에 의해 계산하였다.
대상 데이터
- 다시마는 2012년 10월에 부산광역시 소재 서진기장영어조합법인에서 구입하여 사용하였고, 굴은 2012년 11월에 경상남도 통영산 굴을 구입하여 사용하였다. Lactobacillus brevis BJ20은 Marinebioprocess Co., Ltd (Busan, Korea)에서 분리 동정한 것을 사용하였다.
- 다시마는 2012년 10월에 부산광역시 소재 서진기장영어조합법인에서 구입하여 사용하였고, 굴은 2012년 11월에 경상남도 통영산 굴을 구입하여 사용하였다. Lactobacillus brevis BJ20은 Marinebioprocess Co.
- 마우스 대식세포(RAW 264.7)는 ATCC (No. TIb-71, USA) 에서 분양 받았고, Penicilline/Streptomycine, fetal bovine serum 및 DMEM은 Invitrogen (GIBCOBRL, USA)에서 구입하였으며 각 실험에 필요한 3-(4,5-dimethylthiozol-2-ly)-2,5- diphebyltetrazolium bromide, Lipopolysaccharide (LPS), sulfanilamide, N-(1-naphthyl)-ethylene-diamine dihydrochloride, H3 PO4는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다. 기타 다른 모든 시약은 analytical grade를 사용하였다.
- 마우스 대식세포를 pencillin (100 units/mL)/ streptomycin(100 μg/mL) solution과 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ incubator (Forma series II, Thermo, USA)에서 배양하여 사용하였다.
- 상업적으로 시판되고 있는 항산화제인 BHA (butylated hydroxyanisole)과 FSO을 대상으로 ESR spectrometer를 이용하여 DPPH radical scavenging activity를 실험한 결과는 Fig. 2와 같다. Positive control인 BHA (butylated hydroxyanisole)의 경우 50 μg/mL와 100 μg/mL의 농도에서 각각 48.
- brevis BJ20) 접종을 실시한 다음 발효 (37℃에서 24시간) 및 재멸균(121℃에서 30분)하고 건조하여 제조하였다. 제조된 발효 분말을 이용하여 항산화 및 항염증 활성 평가용 시료로 사용하였다.
이론/모형
- FSO의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼에 대한 소거 활성은 Nanjo et al. (1996)의 방법에 따라 측정하였다. 시료 30 μL에 60 μM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 30 μL를 혼합 후 반응액을 100 μL quartz capillary tube에 옮겨 2분 후 electron spin resonance (ESR) spectrometer(JES-FA, JEOL Ltd, Tokyo, Japan)로 측정하였다.
- FSO의 superoxide radical은 Zhao et al. (2006)에 따라 시료 10 μL에 0.3 mM riboflavin 10 μL, 1.6 mM EDTA 10 μL, 800 mM DMPO 10 μL를 첨가 한 후 365 nm의 UV lamp에서 1분 동안 조사하였다.
성능/효과
- 4%로 확인되었다. BHA와 FSO의 활성산소 제거능의 비교 시 FSO가 superoxide radical 소거능이 뛰어난 것으로 분석되며 FSO만의 농도에 따른 SDO 활성은 농도 차이에 따른 변화가 없었다. 따라서 SOD radical scavenging 효과는 DPPH radical 소거능과 같이 FSO 50 μg/mL에서 가장 높은 활성을 가지는 것으로 판단된다.
- FSO 농도에 따른 세포 생존율은 12.5μg/mL일 때 115.4%, 25 μg/mL의 경우 105.1%, 50 μg/mL의 경우 105% 및 100 μg/mL의 경우 104.2%로 농도에 관계없이 거의 일정한 세포 생존율을 보였다.
- FSO의 LPS에 의해 유도된 NO의 생성 정도의 억제율은 50 μg/mL의 경우 29.1 %이며, 100 μg/mL의 경우 48.1%로 positive control인 kojic acid보다 높은 수준을 보이긴 하지만 큰 차이는 없었으며 전체적으로 억제율은 낮았다.
- 2%로 농도에 관계없이 거의 일정한 세포 생존율을 보였다. FSO의 마우스 대식세포에 대하여 세포독성이 없는 것으로 나타났으며 오히려 세포의 증식을 촉진하였다.
- 5와 같다. GABA 생성 FSO의 항산화능을 nitric oxide scavenging assay로 살펴 본 결과 항산화능은 GABA 생성 유산균 첨가 다시마∙굴 발효물이 36.1%로 상업적 항산화제로 많이 이용되고 있는 대조군인 BHA의 63.9%에 비하여 낮아, nitric oxide 소거능은 기존 항산화제에 비하여 낮다고 판단된다.
- Positive control인 BHA (butylated hydroxyanisole)의 경우 50 μg/mL와 100 μg/mL의 농도에서 각각 48.7%, 86.5%의 활성을 나타내었고, FSO의 경우에는 각각 89.7%, 91%로 확인되었다.
- 4와 같다. Xanthine oxidase inhibitory assay로 살펴 본 결과 항산화능은 GABA 생성 FSO가 88.1%, 다시마 추출액은 89% (Lee et al., 2010)이며, 상업적 항산화제로 많이 이용되고 있는 대조군인 BHA의 71.3%에 비하여 약 17%가 높아, xanthine oxidase inhibitory가 아주 우수하다고 판단된다.
- 1과 Table 1에 나타내었다. 굴과 다시마 추출액의 농도는 각각 1:9 비율에서 9:1 비율까지 배지 조성 성분에 함유 시켰으며 그 결과 굴과 다시마의 함량이 5:5인 비율에서 잔존 글루탐산 함량 2.9%이며 GABA 생산량은 3.7%로 확인되어 굴과 다시마 추출액의 최적 함량비는 1:1로 판단되었다.
- 따라서 SOD radical scavenging 효과는 DPPH radical 소거능과 같이 FSO 50 μg/mL에서 가장 높은 활성을 가지는 것으로 판단된다.
- 따라서, FSO는 50 μg/mL 농도에서 DPPH radical 소거능이 가장 우수한 것으로 판단되며, 상용화된 BHA 보다 소거능이 아주 우수하다고 판단된다.
- 상용화된 항산화제인 BHA와 FSO의 DPPH radical 소거능 비교 시 적은 농도에서 FSO의 DPPH radical 소거능이 월등이 뛰어난 것으로 분석되며 FSO만의 농도에 따른 DPPH radical 소거능의 비교 시 50 μg/mL와 100 μg/mL의 농도 차이에 따른 소거능은 큰 변화가 없었다.
- 활성산소 제거능은 positive control인 BHA의 경우 50 μg/mL와 100 μg/mL의 농도에서 각각 56.4%, 83.5%이었고, FSO의 경우 각각 80.2%, 93.4%로 확인되었다.
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