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문제 정의
- Mun(20)은 산초 및 그 활성성분이 사염화탄소를 투여한 마우스에 있어서 지질과산화 및 간손상 억제에 미치는 영향에 대하여 보고한바 있다. 본 연구에서는 중국 사천지역에서 상용되고 있는 마라소스의 주원료인 고추와 산초 에탄올추출물의 항산화 및 항비만 효과를 확인하고자 고추와 산초 에탄올추출물을 DPPH radical 소거능과 SOD 유사활성을 측정하여 항산화 효과 및 마우스에 실험 물질 경구투여 후 체중, 피하지방, 복부지방, 혈중 지질 농도 등을 측정하여 항비만 효과를 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 in vitro에서 중국 사천지역 고추와 산초 에탄올추출물의 항산화 효능 확인 후, 고지방식이에 의해 유도된 비만 마우스를 이용하여 중국 사천지역 고추, 산초, 고추와 산초복합물 투여 후 체중, 간과 복부 피하지방 무게, 혈중지질 함량을 측정하여 항비만 기능성 소재로서의 가능성 여부를 조사하였다. 실험군은 일반식이군, 고지방식이군, 고지방식이에 고추 및 산초, 고추와 산초복합물, HCA(hydroxyl citric acid)를 경구투여한 군의 6군으로 분류하여 8주간 사육 후, 체중, 간, 피하지방, 혈중지질 함량을 측정한 결과는 다음과 같다.
가설 설정
- 1)Normal diet is based on AIN-76 diet.
제안 방법
- 본 실험에 사용된 고추와 산초는 중국 사천지역에서 재배된 고추와 산초로 건조된 원료를 구매 후, 재료는 저온실(5℃)에 보관하여 실험시료로 사용하였다. 고추, 산초 50 g을 분쇄기로 마쇄 후 여과하여, 1 L 추출용 플라스크에 10배의 100% 에탄올을 가하여 40℃ 2시간 동안 sonicator(Qsonica Inc, New York, NY, USA) 추출 후, Whatman filter paper No.2(Whatman, Piscataway, NJ, USA)로 여과하였으며, 이러한 추출과정을 2회 더 진행하여 총 3회에 걸쳐 추출하였다. 추출한 여액을 감압농축기(rotary vacuum evaporator N-N series, Eyela, Tokyo, Japan)를 이용하여 60℃에서 감압 농축한 다음 농축액을 실험용 시료로사용하였다.
- DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)법에 의한 전자공여능 측정: 본 연구에 사용한 고추, 산초 에탄올 추출물의 전자 공여능은 Blois(21)의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료 1 mL에 100 mM DPPH 1.
- SOD 유사활성(superoxide dismutase-like activity): SOD 유사활성은 과산화수소(H2O2)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 시료 용액 2 mL에 Tris-HCl의 완충용액(50 mM tris+10 mM EDTA, pH 8.
- , Seoul, Korea) 60마리를 구입 후 일주일간의 적응 기간을 거친 다음, 대조군(normal diet, ND)을 제외한 모든 실험군에 고지방식이를 조제하여 공급하고 고지방식이를 4주 동안 섭취시켜 비만을 유도하였다. 식이는 Table 1에 나타내었고 고지방 식이를 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 식이구성은 지방 20%로 구성하였고 일반식이는 AIN-76 정제 식이를 기준으로 한 고형배합사료를 사용하여 자유롭게 섭취하도록 하였다. 4주 후 난괴법에 의거하여 대조군을 제외한 고지방식이군(high fat diet, HFD)을 총 5군의 실험군으로 분류하여, 고추, 산초, 고추와 산초를 1:1 비율로 혼합, HCA를 0.
- 식이는 Table 1에 나타내었고 고지방 식이를 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 식이구성은 지방 20%로 구성하였고 일반식이는 AIN-76 정제 식이를 기준으로 한 고형배합사료를 사용하여 자유롭게 섭취하도록 하였다. 4주 후 난괴법에 의거하여 대조군을 제외한 고지방식이군(high fat diet, HFD)을 총 5군의 실험군으로 분류하여, 고추, 산초, 고추와 산초를 1:1 비율로 혼합, HCA를 0.1 g/60 kg으로 8주 동안 경구투여 하였다(Table 2).
- 흰쥐는 희생 전 24시간 절식시킨 후 에테르로 마취시킨 후 개복하였다. 헤파린으로 처리한 멸균주사기를 이용하여 심장에서 약 1 mL 정도의 혈액을 채취하였고 간, 복부지방, 비장, 신장 등의 장기를 적출하여 0.9% 생리식염수로 세척한 다음 여과지로 수분을 완전히 제거하여 중량을 측정하였고 모든 시료는 -70℃에 보관하면서 시료로 사용하였다.
- 체중 및 식이섭취량은 8주 동안 1주 간격으로 체중계(CAS, Seoul, Korea)를 이용하여 일정시간에 측정하였고, 복부지방은 8주 후 복부지방을 전산화단층촬영(computerized tomography(CT), GE healthcare, Livingston, NJ, USA)과 개복하여 복부 장기에 있는 지방 함량의 무게를 측정하였다. 복부지방 전산화단층촬영은 C57BL/6계 마우스에게 ketamine(유한양행(주), 서울, 한국)과 RompunⓇ(Bayer Korea, Seoul, Korea)을 1:1로 혼합하여 제조한 마취약을 0.
- 체중 및 식이섭취량은 8주 동안 1주 간격으로 체중계(CAS, Seoul, Korea)를 이용하여 일정시간에 측정하였고, 복부지방은 8주 후 복부지방을 전산화단층촬영(computerized tomography(CT), GE healthcare, Livingston, NJ, USA)과 개복하여 복부 장기에 있는 지방 함량의 무게를 측정하였다. 복부지방 전산화단층촬영은 C57BL/6계 마우스에게 ketamine(유한양행(주), 서울, 한국)과 RompunⓇ(Bayer Korea, Seoul, Korea)을 1:1로 혼합하여 제조한 마취약을 0.8 mL/kg의 농도로 근육 주사하여 전신 마취하였고, 촬영 시 같은 자세를 유지시키기 위해 안전 고정장치에 대상 마우스를 고정하였다. 촬영은 전산화단층촬영 장치를 이용하였다.
- 촬영은 전산화단층촬영 장치를 이용하였다. 2 mm 두께, 3 mm 간격과 pitch 1.5, 120 kVp, 150 mAs의 조건으로 scan하였다.
- 를 무해한물 분자와 산소 분자로 전환시키는 역할을 하는 효소이다. 이번 실험에서는 생체 내의 항산화 방어기구 중 효소적 방어체계의 하나로서 superoxide radical을 환원시켜서 산소독으로부터 생체를 보호하는 superoxide radical 소거활성을 pyrogallol 자동 산화로 생성되는 superoxide anion radical 소거 여부로 확인하였다. 고추 및 산초 추출물의 SOD 유사활성 측정 결과는 Fig.
- 본 연구에서는 in vitro에서 중국 사천지역 고추와 산초 에탄올추출물의 항산화 효능 확인 후, 고지방식이에 의해 유도된 비만 마우스를 이용하여 중국 사천지역 고추, 산초, 고추와 산초복합물 투여 후 체중, 간과 복부 피하지방 무게, 혈중지질 함량을 측정하여 항비만 기능성 소재로서의 가능성 여부를 조사하였다. 실험군은 일반식이군, 고지방식이군, 고지방식이에 고추 및 산초, 고추와 산초복합물, HCA(hydroxyl citric acid)를 경구투여한 군의 6군으로 분류하여 8주간 사육 후, 체중, 간, 피하지방, 혈중지질 함량을 측정한 결과는 다음과 같다. 고지방식이만을 섭취한 군은 일반식이군과 비교하여 체중, 간, 복부 피하지방, 혈장지질 농도가 현저하게 증가하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 고추와 산초는 중국 사천지역에서 재배된 고추와 산초로 건조된 원료를 구매 후, 재료는 저온실(5℃)에 보관하여 실험시료로 사용하였다. 고추, 산초 50 g을 분쇄기로 마쇄 후 여과하여, 1 L 추출용 플라스크에 10배의 100% 에탄올을 가하여 40℃ 2시간 동안 sonicator(Qsonica Inc, New York, NY, USA) 추출 후, Whatman filter paper No.
- 실험용 시료는 5℃ 저온실에서 보관하여 사용하였다. HCA(hydroxyl citric acid, 대덕약업(주), 서울, 한국)는 가르시니아 캄보지아 껍질 추출물로 대덕약업(주)에서 구입 후, 증류수에 녹여 positive control로 사용하였다.
- 실험동물은 5주령의 C57BL/6계 수컷(Duyul biotech., Seoul, Korea) 60마리를 구입 후 일주일간의 적응 기간을 거친 다음, 대조군(normal diet, ND)을 제외한 모든 실험군에 고지방식이를 조제하여 공급하고 고지방식이를 4주 동안 섭취시켜 비만을 유도하였다. 식이는 Table 1에 나타내었고 고지방 식이를 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 식이구성은 지방 20%로 구성하였고 일반식이는 AIN-76 정제 식이를 기준으로 한 고형배합사료를 사용하여 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 8 mL/kg의 농도로 근육 주사하여 전신 마취하였고, 촬영 시 같은 자세를 유지시키기 위해 안전 고정장치에 대상 마우스를 고정하였다. 촬영은 전산화단층촬영 장치를 이용하였다. 2 mm 두께, 3 mm 간격과 pitch 1.
데이터처리
- 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었고 각 군 간의 유의성은 one-way ANOVA로 검증한 후 P<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였다.
이론/모형
- 총콜레스테롤 함량은 효소법에 의한 정량용 kit 시약(AM 202-K, 아산제약(주), 서울, 한국)을 사용하여 측정하였고 총 중성지질은 정량용 kit 시약(AM 157S-K, 아산제약(주))을 사용하였다.
성능/효과
- 이렇게 과잉 생산된 활성산소는 사람의 몸속에서 산화작용을 일으킨다. 그 결과 세포막과 DNA, RNA 외의 모든 세포 구조가 손상당하고 손상의 범위에 따라 세포가 기능을 잃거나 변질된다. 이와 함께 몸속의 여러 아미노산을 산화시켜 단백질의 기능저하를 가져온다.
- 1은 고추와 산초 에탄올 추출물의 농도별 전자공여능을 나타낸 것으로 L-ascorbic acid를 표준물질로 하여 활성을 비교한 결과이다. 모든 추출물에서 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하였고, 가장 좋은 활성을 나타낸 것은 산초와 고추 혼합물로 1,000 mg에서 DPPH radical 소거 능이 90%를 나타내어, 고추 단독군 65%, 산초 단독군 70%에 비해 우수한 활성을 나타냄을 확인하였다. 이는 Park 등(25)의 고추 capsaicin의 항산화 작용에 대한 연구, Lee 등(26) 및 Lee 등(27)의 HepG2 세포에서 capsaicin이 활성산소종에 미치는 영향에 대하여 보고한 고추의 항산화능에 대한 연구 결과, Mun 등(19)의 산초 추출물의 항산화 효과에 관한 연구 결과를 볼 때 고추와 산초의 항산화능이 우수하여 혼합 시 free radical 소거능이 증가함을 확인하였다.
- 각 군간 체중증가는 실험 전 마우스의 평균체중이 23g, 사육 8주 후의 평균체중은 고지방군이 43 g으로 가장 높았고, 정상대조군 27 g, 고추군 30 g, 산초군 31 g, 고추와 산초복합군 28 g, HCA군 30 g으로 나타났다(P<0.05).
- 고추군과 산초 군의 간무게는 고지방군에 비하여 각각 36% 감소하였고, HCA군은 41%, 고추와 산초 복합군은 37% 감소시켰다(P<0.05).
- 따라서 고지방식이에 의한 지방축적이 많은 장기는 간으로 관찰되었는데, 정상대조군보다 고지방군 간무게는 58% 증가하여 유의적인 차이를 보였다(P<0.05).
- 2와 같다. 모든 실험군에서 농도의존적으로 SOD 유사활성이 증가하여 고추와 산초 혼합군의 SOD 유사활성이 10 mg, 100 mg, 1,000 mg에서 18%, 51%, 90%로 고추 단독군 10%, 38%, 75%, 산초 단독군 15%, 48%, 82%에 비해 SOD 유사활성이 가장 높은 활성을 나타남을 확인하였다.
- 05). 실험군에서 고지방군에 비해 고추군, 산초군, 고추와 산초복합군의 체중증가량이 감소하였고, 고추와 산초복합군은 positive control인 HCA군에 비해 2% 정도 체중을 감소시켰다. 고추와 산초복합군의 체중 감량 효과는 고추의 매운맛을 결정하는 캡사이신 성분에 의한 것으로 캡사이신은 체중 감소나 중성지질 저하 등의 효과가 보고되어 있으며(28), 산초 또한, 활성성분이 혈청 중성지질 및 콜레스테롤을 억제한다는 보고가 있다(29).
- 고추와 산초복합군의 체중 감량 효과는 고추의 매운맛을 결정하는 캡사이신 성분에 의한 것으로 캡사이신은 체중 감소나 중성지질 저하 등의 효과가 보고되어 있으며(28), 산초 또한, 활성성분이 혈청 중성지질 및 콜레스테롤을 억제한다는 보고가 있다(29). 각 군간 식이섭취량은 유의한 차이가 없었으나, 식이효율은 정상대조군 0.82, 고지방군 3.65, 고추군 및 산초군, HCA군, 고추와 산초복합군의 식이효율이 각각 1.14, 1.43, 1.03, 0.97로 나타나 체중 감소가 증가할 수록 식이효율이 유의적으로 감소하였다.
- 이는 capsaicin을 포함한 활성성분이 체내 지방질을 분해, 연소시켜 간에서의 중성지질 합성을 억제시켰기 때문으로 사료되었다(30). 흰쥐의 복부를 중심으로 주요 장기를 덮고 있는 피하지방의 무게는 고지방군이 3.77 g으로 정상대조군 0.36 g에 비해 10배 증가하였고, 고추, 산초 및 HCA 군, 고추와 산초 복합군의 복부지방 무게는 각각 0.88 g, 0.9 g, 0.97 g, 0.76 g으로 정상대조군에 비해 각각 2배, 2.5배, 2.7배, 2배 증가하여 고추와 산초 에탄올추출물 섭취가 고지방식이로 인한 피하지방의 축적을 억제함을 확인할수 있었다(Fig. 3). 산초의 섭취는 섭취 열량소의 분해 및 연소를 촉진하여 잉여 열량소가 체지방질로 축적되는 것을 줄이게 된다고 보고된바 있다(29).
- 혈장 중성지질(TG) 농도는 정상군이 70 mg/dL, 고지방 군이 160 mg/dL로 고지방식이에 의한 혈중 중성지질 농도가 정상군에 비해 56% 정도 증가하였고(P<0.05), 고지방식이에 고추군, 산초군, 고추와 산초 복합군, HCA군의 혈장 중성지질 농도는 각각 77.5 mg/dL, 80 mg/dL, 78 mg/dL, 76.7 mg/dL로 고지방군에 비해 52%, 50%, 51%, 52% 정도 감소하였다(Fig. 4).
- 이상과 같이 고추와 산초 에탄올추출물의 혈장 중성지질이 고지방군에 비해 상당히 억제되는 결과는 간에서의 VLDL 과잉생성, triglyceride 합성 억제 및 유출 억제 시 혈중 triglyceride가 낮아진다는 보고(20)와 관련하여 산초와 고추 에탄올추출물이 이러한 작용을 가지기 때문에 혈장 triglyceride 저하 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 4). 특히 산초와 고추 복합군의 중성지질 감소율은 positive control인 HCA군에 비해 중성지질 감소율이 높아 체내 혈중 중성지질 감소에 효과적임을 확인하였다. Kawada 등(14)의 보고에서 고콜레스테롤 식이를 섭취한 흰쥐에 capsiate 또는 합성 capsaicin 투여 시 혈중 콜레스테롤 및 중성지질 저하효과를 확인할 수 있었으며, 산초군과 고추군의 중성지질 농도가 고지방식이군에 비해 떨어지고 특히, 산초와 고추복합군의 중성지질 농도가 낮아 고추유와 산초유 섭취한 흰쥐의 중성지질 농도가 대조군에 비해 낮은 함량이 나타난 Yoon과 Choi(32)의 보고와 유사한 경향을 나타내었다.
- 농도를 측정한결과 정상군 11.4 mg/dL에 비해 고지방군 30 mg/dL로 고지방군이 정상대조군에 비해 62% 정도 높았고(P<0.05), 고추군, 산초군, 고추와 산초복합군 및 HCA군은 각각 20 mg/dL, 20 mg/dL, 18 mg/dL, 23.3 mg/dL로 고지방군에 비해서 33%, 33%, 40%, 22% 감소하였다(Fig. 5).
- 혈장 콜레스테롤 농도의 상승은 사람을 비롯한 동물연구에서 순환기계 질환 발생의 위험인자로 알려져 왔으며, 식이 지방은 지질 농도의 중요한 조절인자임이 밝혀져 왔다(32). 총콜레스테롤(TC) 농도는 8주 투여 후 정상군이 94.3 mg/ dL, 고지방군이 210 mg/dL으로 고지방군이 55% 정도 유의적으로 높았다. 고지방식이에 고추, 산초, 고추와 산초 복합군의 혈장 콜레스테롤 농도는 각각 121.
- 3 mg/ dL, 고지방군이 210 mg/dL으로 고지방군이 55% 정도 유의적으로 높았다. 고지방식이에 고추, 산초, 고추와 산초 복합군의 혈장 콜레스테롤 농도는 각각 121.4 mg/dL, 123.3 mg/dL, 110 mg/dL, 130 mg/dL로 고지방군에 비하여 42%, 41%, 48%, 38% 정도 유의적으로 감소하였다(Fig. 6). 이와 같이 고추와 산초 에탄올추출물 투여가 고지방군에 비해 혈장 콜레스테롤 증가를 억제시킨 것은 이들이 강한 free radical scavenger로서(25), 사염화탄소에서 유도되는 CCl3를 제거함으로써 간손상을 억제하기 때문인 것으로 사료된다.
- 7과 같다. 정상군은 80 mg/dL, 고지방군은 76.6 mg/dL로 고지방군이 정상군에 비해 4% 정도 낮아졌고, 고지방식이에 고추군, 산초군, 고추와 산초복합군, HCA군의 HDL-콜레스테롤 농도는 93.8 mg/dL, 85 mg/dL, 136 mg/dL, 96.7 mg/dL로 고지방군에 비해 각각 22%, 6%, 77%, 26% 유의적으로 증가하였다. 특히 고추와 산초 복합군은 positive control인 HCA군에 비해 약 29% 상승됨을 확인하였다.
- 7 mg/dL로 고지방군에 비해 각각 22%, 6%, 77%, 26% 유의적으로 증가하였다. 특히 고추와 산초 복합군은 positive control인 HCA군에 비해 약 29% 상승됨을 확인하였다. HDL-콜레스테롤은 조직 중의 콜레스테롤을 간으로 운반하여 콜레스테롤의 분해 및 배설을 촉진하여 조직 중의 콜레스테롤량을 감소시키며(34), HDL-콜레스테롤 농도가 동맥경화증 등 순환기계 질환의 발병과 역상관 관계가 있다는 보고와 관련하여 산초와 고추 에탄올추출물 투여에 의한 혈중 HDL-콜레스테롤 증가는 이들이 동맥경화증 등 심장순환기계 질환의 발생을 억제할 수 있다는 것을 시사한다.
- 고지방식이에 고추와 산초 에탄올추출물을 경구투여한 군에서 8주 후 고지방군에 비해 유의적으로 체중을 감소시켰고, 복부 피하지방 양은 고지방군 3.77 g, 고추군, 산초군, 고추와 산초복합군은 각각 0.88 g, 0.9 g, 0.97 g으로 농도 의존적으로 복부 피하지방 양을 감소시켰다 (P<0.05).
- 혈중 중성지질, 총콜레스테롤을 농도 의존적으로 감소시켜 혈액 내 지방의 축적을 저해하였고, HDL 콜레스테롤 농도가 고지방군에 비해 고추, 산초 및 고추와 산초복합군이 농도 의존적으로 증가하여(P<0.05) 조직 중의 콜레스테롤을 간으로 운반하여 콜레스테롤의 분해 및 배설을 촉진하여 조직 중의 콜레스테롤량을 감소시켜, 고추 및 산초에탄올추출물 투여가 마우스의 비만을 억제함을 확인할 수 있었다.
- 실험군은 일반식이군, 고지방식이군, 고지방식이에 고추 및 산초, 고추와 산초복합물, HCA(hydroxyl citric acid)를 경구투여한 군의 6군으로 분류하여 8주간 사육 후, 체중, 간, 피하지방, 혈중지질 함량을 측정한 결과는 다음과 같다. 고지방식이만을 섭취한 군은 일반식이군과 비교하여 체중, 간, 복부 피하지방, 혈장지질 농도가 현저하게 증가하였다. 고지방식이에 고추와 산초 에탄올추출물을 경구투여한 군에서 8주 후 고지방군에 비해 유의적으로 체중을 감소시켰고, 복부 피하지방 양은 고지방군 3.
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