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제안 방법
- 관수중단 후 8일차에 각 계통의 4개 식물체로부터 제3엽을 채취하여 탈이온수로 부드럽게 세척한 후 각 잎당 직경 7 mm의 구멍을 2개씩 뚫어 검정용 시료를 채취하였다. 15 mL 탈이온수를 담은 시험관에 시료를 넣고 잎 절편표면의 공기방울을 제거하기 위하여 펌프(DOA-P704- AC: GAST Manufacturing Inc., USA)를 사용하여 6 psi에서 5분 간격으로 3회 감압하였다. 시료가 담긴 시험관을 비스듬히 세워 300 rpm으로 2시간 진탕한 후 전기전도도계 (WalkLAB, Trans Instruments Ltd.
- AVP1 전사체 탐지, 제초제 저항성 검정, 관수중단에 따른 토양수분포텐셜 측정, 광계II 양자수율(фPSII) 측정, 상대적 수분함량 측정, 전해질누출 측정 및 3,3’-diaminobenzidine(DAB: Sigma-Aldrich, USA)염색 등을 위해 수확한 T3 세대 각 계통의 종자를 최아하여 유근의 생장이 유사한 실생만을 고른 후 상토를 담은 32공 plug tray에 이식하고 배양실(25±1°C, 16 h 일장, 약 20 μmol․m-2․s-1, 상대습도 45±5%)에서 주기적으로 저면관수하며 본잎 3~4매기까지 유식물체를 양성하였다(Park et al. 2012).
- DAB 염색 처리를 통해 활성산소족의 하나인 H2O2를 탐지하였다(Wu et al. 2012). Park 등(2012)의 방법을 일부 수정하였는데, 관수중단 6일차에 잎을 채취하여 25±1°C, 암상태로 0.
- cDNA와 AVP1 유전자 특이적 forward (5’-gtcggcgctgaccttgtcggtaaa-3’) 및 reverse (5’-ccaatgataactttaggggtcaaa-3’) primer를 각각 PerfectShot Ex Tag Kit (Takara Bio Inc., Japan)에 첨가하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 AVP1 전사체 유래 cDNA를 증폭하였다.
- 각 T3 계통의 유식물체로부터 추출한 총 RNA로부터 역전사를 통해 합성한 cDNA를 주형으로 PCR을 수행하였는데, 무작위로 선택된 모든 식물체에서 T0 세대(Park et al. 2012)에서와 마찬가지로 전사체가 탐지되었고 ‘CCAVP05’ 계통의 발현량이 ‘CCAVP06’ 계통에 비해 많았으며 각 계통의 개체간에는 균일한 정도의 전사량을 나타내었다(Fig. 1B).
- 2011). 강화되는 건조스트레스 조건에서 AVP1 형질전환 배추의 실제 광합성효율을 판단할 수 있는 척도인 фPSII를 엽록소형광소멸분석을 통해 추적하였다. 관수중단 후 토양수분포텐셜이 급하게 감소하는 4일차(Fig.
- 관수중단 후 6일차에 계통당 5개 식물체로부터 각각 제3엽을 채취하여 즉시 생체중(FW)을 측정한 후 증류수에 띄워 냉장고(4°C)에서 15시간 재흡수 시켰다.
- 관수중단 후 8일차에 각 계통의 4개 식물체로부터 제3엽을 채취하여 탈이온수로 부드럽게 세척한 후 각 잎당 직경 7 mm의 구멍을 2개씩 뚫어 검정용 시료를 채취하였다. 15 mL 탈이온수를 담은 시험관에 시료를 넣고 잎 절편표면의 공기방울을 제거하기 위하여 펌프(DOA-P704- AC: GAST Manufacturing Inc.
- 춘화처리가 완료된 식물체는 상온으로 이동하여 관리하다가 내엽 윗면의 왁스층 발달이 관찰되는 시점에 내경 30 cm 화분으로 이식하여 비배관리하며 추대를 유도하였다. 꽃가루 오염을 방지하기 위해 개화기 전에 봉지 씌우기를 하였으며 만개기에 봉지를 벗겨 인공 자가 뇌수분하였다. 각 계통 당 미숙모본으로 5개체를 활용하였으며 교배 후 평균 6주경에 씨꼬투리를 채취하였고 채취한 씨꼬투리는 음건한 후 탈종하여 각 계통의 T3 세대 종자를 확보하였다(Fig.
- 2011). 따라서 우리는 관수중단 처리 6일 후 양 유전자형의 RWC를 측정하였다. WT의 RWC는 0.
- 무작위로 선택한 각 계통의 4개 유식물체로부터 어린잎을 채취하여 Han (2010)의 방법에 따라 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen GmBH, German)을 사용하여 총 RNA를 추출한 후 오염되어 있을 수 있는 DNA를 제거하기 위하여 DNase I (Invitrogen, USA)으로 2회 처리하였다. RNA는 전기영동을 통해 대략적 농도와 순도를 파악하는 한편 분광광도계(NanoDrop 2000: Thermo Fisher Scientific Inc.
- 배양실에서 동일한 방법으로 생장시킨 각 계통의 유묘가 재식된 plug tray에 포장용수량까지 최종 관수한 후 관수를 중단하고 토양수분장력계(T5×/INFIELD7: USM GmbH, Germany)로 깊이 4 cm 위치의 토양수분포텐셜을 관수중단 6일 후까지 계통당 5개체에 대하여 매일 측정하였다.
- 2003). 본 연구에서는 건조스트레스를 심하게 받고 있는 관수중단 처리 8일 후 AVP1 형질전환체와 WT의 잎 절편을 채취하여 전해질누출을 측정하였다. 형질전환체의 전해질누출은 각 계통이 37.
- , USA)를 사용하여 6 psi에서 5분 간격으로 3회 감압하였다. 시료가 담긴 시험관을 비스듬히 세워 300 rpm으로 2시간 진탕한 후 전기전도도계 (WalkLAB, Trans Instruments Ltd., Singapore)로 전기전도도를 측정하였다. 시험관을 고압증기멸균기에 넣어 121°C에서 20분간 끓인 후 용액의 전기전도도를 다시 측정하였다.
- 애기장대 AVP1 유전자로 형질전환된 배추 내혼계통 ‘KSSD2810’의 T2 세대 ‘CCAVP05’와 ‘CCAVP06’ 계통 각 식물체는 인공 자가 뇌수분에 의해 정상적으로 씨꼬투리를 착생하였으며 T3 세대의 종자를 생산하였다(Fig. 1A).
- 잎 표면의 수분을 화장지를 이용하여 흡습 제거한 후 재흡수 생체중(RFW)을 측정하였으며 70°C에서 15시간 처리하여 건조중(DW)을 측정하였다.
- 지금까지 AVP1 유전자를 발현하는 배추 T2 계통을 세대진전한 후 T3 세대 식물체가 건조스트레스를 받았을 때의 수분관계, 광합성효율, 세포막투과성 및 활성산소족 발생 등의 측면에서 어떻게 생리적으로 반응을 하는지 WT와 비교하여 검토하였다. 결론적으로 배추에서 AVP1 유전자의 발현은 내염성(Park et al.
- 처리 후 70°C, 94% 에탄올로 4회 탈색시켜 H2O2-DAB 산물의 발색을 관찰하였다.
- , Japan)에 첨가하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 AVP1 전사체 유래 cDNA를 증폭하였다. 한편, 0.3%로 희석한 제초제 BastaTM (Bayer Crop Science, Korea)를 유식물체 전체에 살포하고 10일 후 그 피해를 관찰하였다.
- 한편, 기내 형질전환에서 선발표지유전자로 사용한 Bar의 발현을 검정하기 위하여 0.3% BastaTM 용액을 유식물체에 살포한 후 관찰하였는데, WT는 피해를 받아 고사한 반면 ‘CCAVP05’와 ‘CCAVP06’ 계통 모두는 정상적 생육을 진행하였다(Fig. 1C).
- 형질전환 배추 ‘CCAVP05’와 ‘CCAVP06’의 T2 세대 종자를 각각 파종하여 육묘한 본잎 5~6매 시점의 유식물체를 냉장진열장(ADVANZA: Carrrier, Korea)에 입상하여 8±3°C, 16 h (약 20 μmol․m-2․s-1) 조건에서 간헐적으로 관수하며 약 4주간 춘화처리 시켰다.
- , USA)로 실측한 후 시료당 동일한 농도가 되도록 희석하였다. 희석한 등량의 RNA를 주형으로 Super Script III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, USA)을 사용하여 cDNA를 역전사하였으며, 합성된 cDNA는 전기영동을 통해 확인하였다. cDNA와 AVP1 유전자 특이적 forward (5’-gtcggcgctgaccttgtcggtaaa-3’) 및 reverse (5’-ccaatgataactttaggggtcaaa-3’) primer를 각각 PerfectShot Ex Tag Kit (Takara Bio Inc.
대상 데이터
- LB::T35S::AVP1::2×P35S::PNOS::Bar::TNOS::RB T-DNA 로 배추(Brassica rapa L.) 내혼계통 ‘KSSD2810’을 형질전환 한 후 세대진전과 선발을 거쳐 육성한 목표유전자 고정 T2 독립 계통 중 비형질전환체(wild type: WT)에 비해 생물량이 많고 점진적으로 강화시킨 염스트레스 조건에서도 실 광합성 효율이 높으면서 체내에 활성산소족의 하나인 H2O2 존재량이 적은 것으로 확인된 ‘CCAVP05’와 ‘CCAVP06’ 계통의 T2세대 종자를 본 연구의 시작 식물재료로 사용하였다(Park et al. 2012).
- 꽃가루 오염을 방지하기 위해 개화기 전에 봉지 씌우기를 하였으며 만개기에 봉지를 벗겨 인공 자가 뇌수분하였다. 각 계통 당 미숙모본으로 5개체를 활용하였으며 교배 후 평균 6주경에 씨꼬투리를 채취하였고 채취한 씨꼬투리는 음건한 후 탈종하여 각 계통의 T3 세대 종자를 확보하였다(Fig. 1A).
이론/모형
- 관수중단 후 Park 등(2012)의 방법에 따라 Pulse amplitude modulation fluorometer (Mini-PAM: Heinz Walz GmbH, Germany)를 사용하여 각 식물체의 제3엽을 대상으로 광계II 형광(Chl-F)을 측정하였다. фPSII는 (Fm’-Ft)/Fm’식으로 구하였는데 Fm은 암적응된 상태에서의 최대 Chl-F, Fm’은 명적응된 상태에서의 최대 Chl-F, Ft는 명적응 후 포화광 pulse 조사 직전 Chl-F 값을 의미한다(Genty et al.
- 잎 표면의 수분을 화장지를 이용하여 흡습 제거한 후 재흡수 생체중(RFW)을 측정하였으며 70°C에서 15시간 처리하여 건조중(DW)을 측정하였다. 상대적 수분함량(RWC)은 (FW-DW)/ (RFW-DW) 식으로 구하였다.
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