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문제 정의
- 본 연구는 식품산업에서 큰 비중을 차지하고 있는 음료류에 대한 인공감미료 (삭카린나트륨, 아스파탐, 아세설팜칼륨, 수크랄로스, 싸이클라메이트)의 함유현황 파악을 위한 동시분석법을 확립하였다. 희석 및 여과의 간편하고 효율적인 전처리 후 HPLC/MS/MS를 이용하여 5종 인공감미료 동시분석 조건을 검토하였다.
- 본 연구에서는 HPLC/MS/MS를 이용하여 음료류 중 인공감미료 (아세설팜칼륨, 삭카린나트륨, 싸이클라메이트, 수크랄로스 및 아스파탐)의 함유현황을 파악하기 위해 간단한 전처리 과정의 동시분석법을 확립하고 시중 유통 중인 음료류를 대상으로 그 함유실태를 조사하였다.
제안 방법
- 수크랄로스 분석시 noise가 발생하여 이를 제거하고 싸이클라메이트, 아세설팜칼륨, 삭카린나트륨의 머무름과 분리도 향상을 위해 첨가제로 acetic acid, formic acid, ammonium acetate, ammonium formate에 대해 검토하였다. noise 제거와 머무름, 분리도, 감도를 고려하여 ammonium acetate를 선택하였다. 순차적으로 농도를 변화시키면서 적정 농도를 확인한 결과 1 mM이 가장 적합한 것으로 판단되어 1 mM ammonium acetate를 첨가한 물과 메탄올을 이동상으로 결정하고 농도구배 조건을 설정하였다.
- 각 인공감미료를 selected reaction monitorning (SRM) 방식으로 정량 분석하기 위한 product ion을 선정하기 위하여 collision energy (CE)를 검토한 결과는 Table 2와 같다. 감도가 좋은 product ion을 quantitation ion으로 정량 분석하였으며 나머지 이온은 confirmation ion으로 정성 확인하였다. MS/MS parameter 조건은 FIA (flow injection analysis) 방식으로 최적화하였다.
- 정확도 및 정밀도는 인공감미료가 함유되어 있지 않은 혼합음료 시료에 표준물질을 녹여 각 표준물질의 농도가 10 mg/L, 50 mg/L, 250 mg/L이 되도록 한 시료를 이용하였다. 동일한 날에 6회 반복 분석하여 일내 정밀도(intra-day precision) 및 회수율(Recovery)을 확인하였고 3일간 반복 분석하여 일간 정밀도(inter-day precision) 및 회수율을 확인하였다(Table 4). 회수율은 삭카린나트륨 92.
- 본 연구의 용매 검토 과정에서도 싸이클라메이트, 아세설팜칼륨, 삭카린나트륨이 주입 후 컬럼에서 머무름 없이 용리되었다. 수크랄로스 분석시 noise가 발생하여 이를 제거하고 싸이클라메이트, 아세설팜칼륨, 삭카린나트륨의 머무름과 분리도 향상을 위해 첨가제로 acetic acid, formic acid, ammonium acetate, ammonium formate에 대해 검토하였다. noise 제거와 머무름, 분리도, 감도를 고려하여 ammonium acetate를 선택하였다.
- 김20) 등, Loos28) 등의 연구결과에서는 수크랄로스를 negative mode, Ferrer2) 등은 positive mode에서 이온화하였다. 수크랄로스의 경우 negative mode에서는 다양한 fragment ion이 발생하지 않기 때문에2) 본 연구에서는 수크랄로스의 fragment ion 정보를 다양하게 검토할 수 있고 감도가 좋은 positive ion mode로 이온화하였다. 각 인공감미료를 selected reaction monitorning (SRM) 방식으로 정량 분석하기 위한 product ion을 선정하기 위하여 collision energy (CE)를 검토한 결과는 Table 2와 같다.
- noise 제거와 머무름, 분리도, 감도를 고려하여 ammonium acetate를 선택하였다. 순차적으로 농도를 변화시키면서 적정 농도를 확인한 결과 1 mM이 가장 적합한 것으로 판단되어 1 mM ammonium acetate를 첨가한 물과 메탄올을 이동상으로 결정하고 농도구배 조건을 설정하였다.
- 인공감미료 분석 조건을 검토하기 위해 표준용액(1 mg/L)을 개별적으로 질량분석기에 직접 주입하여 electrospray ionization (ESI) positive & negative mode에서의 이온화 조건을 비교하였다.
- 9943 이상으로 좋은 직선성을 나타내었다. 정확도 및 정밀도는 인공감미료가 함유되어 있지 않은 혼합음료 시료에 표준물질을 녹여 각 표준물질의 농도가 10 mg/L, 50 mg/L, 250 mg/L이 되도록 한 시료를 이용하였다. 동일한 날에 6회 반복 분석하여 일내 정밀도(intra-day precision) 및 회수율(Recovery)을 확인하였고 3일간 반복 분석하여 일간 정밀도(inter-day precision) 및 회수율을 확인하였다(Table 4).
- 즉 이동상을 유속 200 μL/min의 조건으로 흘려주고 인공감미료 표준용액 (1 mg/L)을 소량씩 질량분석기에 주입하면서 각 parameter의 변화에 따른 반응 강도를 확인하여 최적의 조건을 검토하였으며 Table 3에 나타내었다.
- 컬럼은 C18(2.1 mm × 150 mm, 3.5 um), 이동상은 2% methanol (1 mM ammonium acetate)과 95% methanol (1 mM ammonium acetate)을 사용하여 농도구배 조건으로 각 성분을 분리하였으며 ESI/SRM 방식으로 정량 분석하였다.
- 표준용액은 삭카린나트륨 등 5가지 인공감미료 표준품을 1 mM ammonium acetate 용액에 녹여 1000 mg/L 농도로 되도록 하여 표준원액을 제조한 후, 각각의 표준원액을 1 mM ammonium acetate 용액으로 혼합 및 희석하여 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 mg/L가 되도록 하여 검량선 작성용 표준용액으로 사용하였다.
- 본 연구는 식품산업에서 큰 비중을 차지하고 있는 음료류에 대한 인공감미료 (삭카린나트륨, 아스파탐, 아세설팜칼륨, 수크랄로스, 싸이클라메이트)의 함유현황 파악을 위한 동시분석법을 확립하였다. 희석 및 여과의 간편하고 효율적인 전처리 후 HPLC/MS/MS를 이용하여 5종 인공감미료 동시분석 조건을 검토하였다. 컬럼은 C18(2.
대상 데이터
- 물은 Thermo Scientific사(Dubuque, Iowa, USA)의 초순수 제조장치 (Barnstead Nanopure)를 이용하여 3차 증류수(> 18.2 MΩ/cm resistivity)를 사용하였다.
- 분석장비는 Shiseido사(Tokyo, Japan)의 SP LC (5100 Autosampler NASCA, 3301 Dual pump MS1, 3014 Oven)와 ThermoScientific사(San Jose, CA, USA)의 triple quadrupole mass spectrometry TSQ Quantum Ultra를 사용하였으며 컬럼, 이동상의 농도구배 조건 등은 Table 1에 나타냈다.
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시료 및 시약
시료는 경기도내 대형 할인마트 및 일반 슈퍼마켓에서 유통 중인 음료류 102건 (과채주스 6건, 과채음료 26건, 탄산음료 29건, 혼합음료 35건, 홍삼음료 6건)을 수집하여 시료로 하였다. 인공감미료 표준품 sodium saccharin (SAC), aspartame (ASP), sucralose (SCL)은 Sigma사 (St.
- 시료는 경기도내 대형 할인마트 및 일반 슈퍼마켓에서 유통 중인 음료류 102건 (과채주스 6건, 과채음료 26건, 탄산음료 29건, 혼합음료 35건, 홍삼음료 6건)을 수집하여 시료로 하였다. 인공감미료 표준품 sodium saccharin (SAC), aspartame (ASP), sucralose (SCL)은 Sigma사 (St. Louis, MO, USA), acesulfame K (ACS-K), sodium cyclamate (CYC)는 Wako사 (Osaka, Japan) 제품을 사용하였으며, 이동상 제조를 위한 methanol, ammomium acetate는 Wako사(Osaka, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 물은 Thermo Scientific사(Dubuque, Iowa, USA)의 초순수 제조장치 (Barnstead Nanopure)를 이용하여 3차 증류수(> 18.
데이터처리
- 검출한계(limit of detection, LOD)는 signal/noise (S/N)비 3 이상, 정량한계(limit of quantitation, LOQ)는 S/N비 10 이상되는 농도로 단계적으로 희석한 표준용액을 6회 반복 분석하여 얻은 검량선의 기울기(S)와 y-절편의 표준편차(σ)를 이용하여 아래 식으로 검출한계, 정량한계 값을 구하였다.
이론/모형
- 감도가 좋은 product ion을 quantitation ion으로 정량 분석하였으며 나머지 이온은 confirmation ion으로 정성 확인하였다. MS/MS parameter 조건은 FIA (flow injection analysis) 방식으로 최적화하였다. 즉 이동상을 유속 200 μL/min의 조건으로 흘려주고 인공감미료 표준용액 (1 mg/L)을 소량씩 질량분석기에 주입하면서 각 parameter의 변화에 따른 반응 강도를 확인하여 최적의 조건을 검토하였으며 Table 3에 나타내었다.
성능/효과
- 본 연구결과와 비교해보면 아스파탐의 사용은 감소된 반면 수크랄로스의 사용 비율이 높아지고 있는 것으로 판단된다. 검출된 시료 중 인공감미료가 2종씩 사용된 시료가 20건으로 혼합사용의 비율이 높게 나타났다. 아세설팜칼륨과 수크랄로스의 조합이 16건으로 가장 많았으며 아스파탐과 아세설팜칼륨의 혼합사용 3건은 탄산음료에만 사용되었다.
- 확립된 분석법으로 시중 유통 중인 음료 102건 분석한 결과 42건에서 아스파탐, 아세설팜칼륨, 수크랄로스가 검출되었으며 삭카린나트륨과 싸이클라메이트는 검출되지 않았다. 검출된 인공감미료는 표시사항과 일치하였으며 사용대상과 사용량의 기준에 적합하였다.
- 0 mg/L의 농도범위에서 각 인공감미료 검량선은 1에 가까운 높은 직선성을 나타냈다. 검출한계, 정량한계는 각각 0.001~0.022 mg/L, 0.004~0.073 mg/L로 저농도의 감미료 분석이 가능함을 확인하였다. 회수율은 92.
- 과채주스, 홍삼음료에서는 분석대상 감미료가 검출되지 않았고 과채음료, 탄산음료, 혼합음료에서 아스파탐, 아세설팜칼륨, 수크랄로스가 검출되었다. 아스파탐은 5건, 아세설팜칼륨은 19건, 수크랄로스는 28건 검출되었다.
- 한3) 등의 연구 결과에서는 인공감미료가 검출된 시료 모두에서 아스파탐이 검출되었다고 보고되었다. 본 연구결과와 비교해보면 아스파탐의 사용은 감소된 반면 수크랄로스의 사용 비율이 높아지고 있는 것으로 판단된다. 검출된 시료 중 인공감미료가 2종씩 사용된 시료가 20건으로 혼합사용의 비율이 높게 나타났다.
- Huang29) 등의 연구결과를 보면 싸이클라메이트는 C8, C18 등의 역상계 컬럼 사용 시 머무름(retention)이 극히 어려우며 100% 물을 용매로 사용하여도 retention time이 대략 3분으로 이러한 결과는 -CN, -NH2 컬럼에서도 동일하다. 본 연구의 용매 검토 과정에서도 싸이클라메이트, 아세설팜칼륨, 삭카린나트륨이 주입 후 컬럼에서 머무름 없이 용리되었다. 수크랄로스 분석시 noise가 발생하여 이를 제거하고 싸이클라메이트, 아세설팜칼륨, 삭카린나트륨의 머무름과 분리도 향상을 위해 첨가제로 acetic acid, formic acid, ammonium acetate, ammonium formate에 대해 검토하였다.
- 인공감미료 분석 조건을 검토하기 위해 표준용액(1 mg/L)을 개별적으로 질량분석기에 직접 주입하여 electrospray ionization (ESI) positive & negative mode에서의 이온화 조건을 비교하였다. 삭카린나트륨, 아세설팜칼륨, 싸이클라메이트는 negative mode, 수크랄로스, 아스파탐은 positive mode에서 좋은 감도를 나타내었다. 김20) 등, Loos28) 등의 연구결과에서는 수크랄로스를 negative mode, Ferrer2) 등은 positive mode에서 이온화하였다.
- 아세설팜칼륨과 수크랄로스의 조합이 16건으로 가장 많았으며 아스파탐과 아세설팜칼륨의 혼합사용 3건은 탄산음료에만 사용되었다. 수크랄로스 또는 아스파탐이 단독으로 사용된 경우에도 본 연구에서 제외된 효소처리스테비아 또는 스테비올배당체 등의 사용을 고려하면 음료 중 2종 이상의 감미료를 혼합사용하는 비율은 상승할 것으로 판단된다. 아스파탐은 42건 중 5건으로 검출율은 낮지만 최고 농도 470.
- 수크랄로스 또는 아스파탐이 단독으로 사용된 경우에도 본 연구에서 제외된 효소처리스테비아 또는 스테비올배당체 등의 사용을 고려하면 음료 중 2종 이상의 감미료를 혼합사용하는 비율은 상승할 것으로 판단된다. 아스파탐은 42건 중 5건으로 검출율은 낮지만 최고 농도 470.0 mg/kg으로 아세설팜칼륨과 수크랄로스에 비해 높은 농도로 검출되었다. 이는 음료에 대한 사용제한이 없기 때문인 것으로 판단된다.
- 즉 이동상을 유속 200 μL/min의 조건으로 흘려주고 인공감미료 표준용액 (1 mg/L)을 소량씩 질량분석기에 주입하면서 각 parameter의 변화에 따른 반응 강도를 확인하여 최적의 조건을 검토하였으며 Table 3에 나타내었다. 이동상을 결정하기 위하여 메탄올과 아세토니트릴을 비교한 결과 메탄올 사용시 더 좋은 감도를 나타내었다. Huang29) 등의 연구결과를 보면 싸이클라메이트는 C8, C18 등의 역상계 컬럼 사용 시 머무름(retention)이 극히 어려우며 100% 물을 용매로 사용하여도 retention time이 대략 3분으로 이러한 결과는 -CN, -NH2 컬럼에서도 동일하다.
- 91% 이하로 양호하였다. 이상의 결과로 본 분석법은 음료 중 인공감미료 분석에 적합하다고 판단되었다. 확립된 분석법으로 시중 유통 중인 음료 102건 분석한 결과 42건에서 아스파탐, 아세설팜칼륨, 수크랄로스가 검출되었으며 삭카린나트륨과 싸이클라메이트는 검출되지 않았다.
- 2 mg/kg으로 사용기준을 초과한 시료는 없었다. 인공감미료가 검출된 시료 42건 중 수크랄로스 38건, 아세설팜칼륨 19건, 아스파탐 5건으로 수크랄로스가 가장 많은 검출빈도를 나타내었다. 한3) 등의 연구 결과에서는 인공감미료가 검출된 시료 모두에서 아스파탐이 검출되었다고 보고되었다.
- 이상의 결과로 본 분석법은 음료 중 인공감미료 분석에 적합하다고 판단되었다. 확립된 분석법으로 시중 유통 중인 음료 102건 분석한 결과 42건에서 아스파탐, 아세설팜칼륨, 수크랄로스가 검출되었으며 삭카린나트륨과 싸이클라메이트는 검출되지 않았다. 검출된 인공감미료는 표시사항과 일치하였으며 사용대상과 사용량의 기준에 적합하였다.
- 동일한 날에 6회 반복 분석하여 일내 정밀도(intra-day precision) 및 회수율(Recovery)을 확인하였고 3일간 반복 분석하여 일간 정밀도(inter-day precision) 및 회수율을 확인하였다(Table 4). 회수율은 삭카린나트륨 92.76~108.14%, 아스파탐 99.89~113.50%, 아세설팜칼륨 98.93~106.17%, 수크랄로스 97.70~112.56%, 싸이클라메이트 94.71~104.97%, 일내 정밀도는 4.94% 이하, 일간 정밀도는 10.91% 이하로 양호한 결과를 확인하였다. 검출한계(limit of detection, LOD)는 signal/noise (S/N)비 3 이상, 정량한계(limit of quantitation, LOQ)는 S/N비 10 이상되는 농도로 단계적으로 희석한 표준용액을 6회 반복 분석하여 얻은 검량선의 기울기(S)와 y-절편의 표준편차(σ)를 이용하여 아래 식으로 검출한계, 정량한계 값을 구하였다.
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