[논문]N,N-Dimethylformamide와 Dimethylsulfoxide를 이용한 감귤 잎의 엽록소 측정방법 확립

한승갑; 강석범; 문영일; 박재호; 박경진; 최영훈

doi:10.5338/kjea.2014.33.4.344

N,N-Dimethylformamide와 Dimethylsulfoxide를 이용한 감귤 잎의 엽록소 측정방법 확립
Establishment of Analytical Method for Chlorophyll Using the N,N-Dimethylformamide and Dimethylsulfoxide in Citrus Leaves 원문보기

한국환경농학회지 = Korean journal of environmental agriculture, v.33 no.4, 2014년, pp.344 - 349

한승갑 (국립원예특작과학원 감귤시험장) , 강석범 (국립원예특작과학원 감귤시험장) , 문영일 (국립원예특작과학원 감귤시험장) , 박재호 (국립원예특작과학원 감귤시험장) , 박경진 (국립원예특작과학원 감귤시험장) , 최영훈 (국립원예특작과학원 감귤시험장)

Abstract ▼ AI-Helper

BACKGROUND: Purpose of the study was to establish the extinction coefficients of chlorophyll a and b in N,N-dimethylformamide(DMF) and Dimethylsulfoxide(DMSO) solvents and to find out the conditions of optimal extraction temperature and time in citrus leaves. METHODS AND RESULTS: Chlorophyll a and b standards were dissolved in DMF and DMSO. Extinction coefficients of chlorophyll pigments were determined and their contents were quantified using spectrophotometer. Chlorophyllous pigments of citrus(Citrus unshiu Marc. cv. Okitsu wase) leaves were extracted at 25, 40, 60 and $80^{\circ}C$ for 4, 6, 8, 24 and 48 hours to determine the optimal extraction condition. CONCLUSION: The extinction coefficients of chlorophyll a(Chl a) and chlorophyll b(Chl b) of DMF extracts for high extinction wavelength were 663.8 and 647.2 nm. Similarly, the high extinction wavelength of DMSO extracts were 665.8 and 649.0 nm for chl a and b respectively. Chl a, Chl b and total chlorophyll content of DMF extracts were Chl a = $12.10A_{663.8}-2.74A_{647.2}$, Chl b = $21.94A_{647.2}-5.06A_{663.8}$ and total $Chl=19.193A_{647.2}+7.04A_{663.8}$. Similarly, Chl a, Chl b and total Chl of DMSO extracts were Chl a = $14.53A_{665.8}-5.40A_{649.0}$, Chl b = $26.98A_{649.0}-7.11A_{665.8}$ and total $Chl=21.58A_{649.0}+7.43A_{665.8}$. The chlorophyll extracts of DMF and DMSO were very stable in dark. High chlorophyll contents of citrus leaves were found at $80^{\circ}C$ extraction for 6 hours in DMF and at $80^{\circ}C$ extraction for 24 hours in DMSO. However, the chlorophyll content was decreased significantly after 8 hours in DMF extraction while it was remained up to 30 hours in DMSO extraction.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

그러나 DMSO로 추출할 경우에는 80% acetone 추출 방법과 같은 환산식을 이용하고 있으므로 이에 대한 검토가 필요하다. 또한 낙엽과수(Park et al., 1996), 솔잎(Hiscox and Israelstam, 1979), 잣나무(Seo et al., 2005) 등 작물 잎의 특성에 따라 적정한 추출 온도와 시간이 달라지므로 큐티클층이 매우 발달된 감귤 잎의 효율적인 추출 조건과 용매별 환산식을 설정하고자 수행하였다.

제안 방법

그리고 계산된 흡광계수를 이용하여 엽록소 a와 b 그리고 총 함량을 계산하였고, 엽록소 a를 측정할 경우 단파장의 흡광계수를 e1, 장파장은 e2그리고 엽록소 b인 경우는 각각 e1′, e2′라 하였으며, 단파장의 흡광도는 A1,장파장은 A2로 하여 다음 과정에 따라 산출하였다.
본 연구는 DMF와 DMSO를 이용하여 chlorophyll을 추출 시 흡광계수와 환산식를 구하였고, 이들 용매를 이용하여 감귤 잎의 chlorophyll을 추출할 경우의 적정 온도 조건과 추출시간을 구명하였다. DMF 용매를 이용할 경우 chlorophyll a와 b의 최고 흡광 파장은 663.
283㎠/disk)을 도려내어 용매 2종류, 온도 4처리를 위해 8개의 100 mL volumetric flask에 한 개씩 나눠 넣었으며, flask당 20개의 잎 disk가 들어가도록 하였다. 여기에 DMSO와 DMF를 각각 50 mL씩 채워 넣었고, 20반복을 실시하였다. 엽록소 추출 중 공기 차단을 위해 마개로 잘 밀봉한 후 각각 25, 40, 60, 80℃로 설정된 암조건의 항온기에 분리하여 넣고 4, 6, 8, 24, 48시간 후에 흡광도를 측정하였다.
엽록소 a와 b의 표준시료(Sigma Aldrich Co.)를 DMF와 DMSO에 녹인 후 직경 1 cm의 석영 셀에 넣고 자외선-가시광선 분광광도계(Cary 100, Varian, Australia)로 600∼700 nm 범위에서 0.2 nm 간격으로 측정하였다.
여기에 DMSO와 DMF를 각각 50 mL씩 채워 넣었고, 20반복을 실시하였다. 엽록소 추출 중 공기 차단을 위해 마개로 잘 밀봉한 후 각각 25, 40, 60, 80℃로 설정된 암조건의 항온기에 분리하여 넣고 4, 6, 8, 24, 48시간 후에 흡광도를 측정하였다.
엽록소는 빛에 쉽게 파괴되는 특성이 있어 DMF, DMSO 용매별 실온에서 명조건과 암조건을 달리하여 안정성을 조사 하였다(Table 3, 4). 명조건에서의 흡광도는 한 시간 경과까지 두 용매 모두에서 추출 직후 보다 약 10% 가량 낮아졌으며 시간이 경과될수록 감소폭은 증가하였다(Table 3).
엽록소는 빛에 의해 쉽게 분해되는 특성이 있기 때문에 미리 조제된 표준 용액 엽록소 a와 b를 DMSO와 DMF 용매로 흡광도가 0.1∼1.0 범위 내 저, 중, 고농도의 시료를 준비한 후 명조건에서 1, 2, 3, 24시간 후, 그리고 빛이 차단된 갈색 volumetric flask의 암조건에서 24시간 후에 흡광도 변화를 조사하였다.
Okitsu Wase) 감귤나무의 봄 잎을 채취하였다. 한 잎 당 사무용 펀치로 8개의 원형조각(0.283㎠/disk)을 도려내어 용매 2종류, 온도 4처리를 위해 8개의 100 mL volumetric flask에 한 개씩 나눠 넣었으며, flask당 20개의 잎 disk가 들어가도록 하였다. 여기에 DMSO와 DMF를 각각 50 mL씩 채워 넣었고, 20반복을 실시하였다.
흡광계수(e)를 측정하기 위해 엽록소 a와 b의 흡광도가 0.1∼1.0 범위에 포함되도록 각각 10∼20 mg/L을 DMSO와 DMF 용매에 녹이고, 빛에 의해 분해되는 것을 방지하기 위하여 갈색의 50 mL volumetric flask에 보관하여 사용하였다.

대상 데이터

감귤 잎의 엽록소 추출 조건을 설정하기 위하여 20년생 조생온주(Citrus unshiu Marc. cv. Okitsu Wase) 감귤나무의 봄 잎을 채취하였다. 한 잎 당 사무용 펀치로 8개의 원형조각(0.

성능/효과

DMF와 DMSO에 녹인 Chl a, b의 변화는 암조건에서 매우 안정적인 것으로 조사되었다. 감귤 잎의 chlorophyll을 신속히 추출하기 위해서 80℃ 조건하에서 DMF 용매로는 6시간, DMSO는 24시간 후 측정하는 것이 최대의 흡광도를 나타내었다.
또한 흡광도가 약 0.2∼0.6로 사용하는 시료량은 온도가 낮은 조건에서는 시간이 경과하더라도 추출 효율이 떨어졌다.
엽록소는 빛에 쉽게 파괴되는 특성이 있어 DMF, DMSO 용매별 실온에서 명조건과 암조건을 달리하여 안정성을 조사 하였다(Table 3, 4). 명조건에서의 흡광도는 한 시간 경과까지 두 용매 모두에서 추출 직후 보다 약 10% 가량 낮아졌으며 시간이 경과될수록 감소폭은 증가하였다(Table 3). 반면 실온의 암조건에서는 두 용매 모두 24 시간이 경과해도 흡광도의 변화가 약 5% 미만으로 매우 안정적이었다.
명조건에서의 흡광도는 한 시간 경과까지 두 용매 모두에서 추출 직후 보다 약 10% 가량 낮아졌으며 시간이 경과될수록 감소폭은 증가하였다(Table 3). 반면 실온의 암조건에서는 두 용매 모두 24 시간이 경과해도 흡광도의 변화가 약 5% 미만으로 매우 안정적이었다. 따라서 정확한 chlorophyll 을 측정하기 위해 우선적으로 빛을 차단시킬 필요가 있었다(Table 4).
큐티클 층이 잘 발달된 감귤 잎의 용매별 추출 온도를 달리하여 시간대별 흡광도를 조사한 결과(Fig. 2) 두 용매 모두 80℃에서 추출량이 많았으며 DMF 용에서는 6시간, DMSO 에서는 24시간 후 추출이 잘 되는 것으로 나타났다. 이는 채소, 낙엽과수(Park et al.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	엽록소의 비파괴적 추출방법에 사용되는 유기용매는 무엇이 있고, 이를 이용하면 어떤 좋은 점이 있는가?	, 1977) 신속하고 간편한 비파괴적 추출방법이 개발되었다. 주로 유기용매인 Dimethylsulfoxide(DMSO, Shoaf and Lium, 1976)와 N,N-dimethylformamide (DMF, Moran and Porath, 1980)를 이용하였으며, 이들 용매로 추출한 엽록소는 빛에도 안정적인 특성을 보였다 (Inskeep and Bloom, 1985; Barnes et al., 1992).
	엽록소 추출에 사용하던 80% acetone 용액의 문제점은?	엽록체의 그라나 속에서 빛에너지와 이산화탄소를 이용하여 탄수화물을 합성하는데 중요한 역할을 하는 엽록소의 추출은 80% acetone 용액을 이용하였으나(Mackinney, 1941), 과도한 시료 전처리 노력과 추출된 엽록소의 안정성의 문제로(Knudson et al., 1977) 신속하고 간편한 비파괴적 추출방법이 개발되었다.
	chlorophyll a와 b의 최고 흡광 파장은 DMF, DMSO 용매에서 각각 얼마로 측정되었는가?	본 연구는 DMF와 DMSO를 이용하여 chlorophyll을 추출 시 흡광계수와 환산식를 구하였고, 이들 용매를 이용하여 감귤 잎의 chlorophyll을 추출할 경우의 적정 온도 조건과 추출시간을 구명하였다. DMF 용매를 이용할 경우 chlorophyll a와 b의 최고 흡광 파장은 663.8과 647.2 nm, DMSO는 665.8과 649.0 nm로 나타났다. 이 파장을 기준으로 흡광 상수를 구하고 DMF와 DMSO 용매를 사용할 경우 chlorophyll 함량식은 각각 Total Chl = 19.

참고문헌 (10)

Arnon, D.I., 1949. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxides in Beta vulgaris, Plant Physiol. 24, 1-15.

상세보기
Barnes, J.D., Balaguer, L., Manrique, E., Elivira, S., Davision, A.W., 1992. A reappraisal of the use of DMSO for the extraction and determination of chlorophyll a and b in lichens and higher plants, Environ. Exp. Bot. 32, 85-100.

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Hiscox, J.D., Israelstam, G.F., 1979. A method for the extraction of chlorophyll from leaf tissue without maceration, Can. J. Bot. 57, 1332-1334.

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Inskeep, W.P., Bloom, P.R., 1985. Extinction coefficients of chlorophyll a and b in N,N -dimethylformamide and 80% acetone, Plant physiol. 77, 483-485.

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Knudson, L.L., Tibbitts, T.W., Edwards, G.E., 1977. Measurement of ozone injury by determination of leaf chlorophyll concentration, Plant Physiol. 60, 606-608.

상세보기
Mackinney, G., 1941. Absorption of light by chlorophyll solutions, J. Biol. Chem. 140, 315-322.
Moran, R., Porath, D., 1980. Chlorophyll determination in intact tissues using N, N -dimethylformamide, Plant Physiol. 65, 478-479.

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Park, J.M., Ro, H.M., Kim, Y.M., Seong, K.C., 1996. Chlorophyll determination in horticultural crops using dimethyl sulphoxide, RDA. J. Agri. Sci. 38, 552-557.
Seo, K.Y., Yi, M.J., Son, Y.H., Koo, J.W., Noh, N.J., Yi, M.J., 2005. Extraction and Determination of Chlorophyll Contents of Korean Pine Needles Using Acetone and DMSO(Dimethylsulfoxide), J. Korean For. Soc. 94, 264-268.
Shoaf, T.W.T., Lium, B.W., 1976. Improved extraction of chlorophyll a and b from algae using demethylsulfoxide, Limnol. Oceanogr. 21, 926-928.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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