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문제 정의
- delemar는 낮은 빈도로 발생하였다. P. expansum과 R. delamar는 국내의 감에서 아직 보고되지 않은 종이기에 본고에서 보고하고자 한다.
- 본 실험은 감 와인 제조에 사용되는 국내 재배 품종 반시의 냉장저장 중에 발생하는 곰팡이를 동정함으로써 반시 저장 중의 곰팡이 오염 대책을 마련하고 한편으로는 이들이 감 와인의 발효에 사용이 될 수 있는 지에 대한 기초자료로 활용하고자 하였다.
제안 방법
- β-tubulin영역을 증폭하기 위하여 bt2a (5’ GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC 3’)와 bt2b (5’ ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC 3’) 프라이머[7]를 사용하였고, RPB2 영역을 증폭하기 위하여 fRPB2-5F (5‘ GAY GAY MGW GAT CAY TTY GG 3’)와 RPB2-7R (5’ CCC ATW GCY TGC TTM CCC AT 3’) 프라이머[8]를 사용하였으며, rDNA-LSU 영역을 증폭하기 위하여 NL1 (5’ GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG 3’)과 NL4 (5’ GGT CCG TGT TTC AAG ACG G 3’) 프라이머[9]를 사용하였다.
- rDNA-LSUPCR은 55℃에서 1분간 annealing의 조건으로 denaturation, annealing, extension의 과정을 35회 반복한 것 외에는 β-tubulin PCR과 같은 조건으로 수행하였다[9]. PCR증폭 산물은 1.2% agarose gel에서 전기영동하여 확인한 후에 PCR96 Cleanup Plate (Millipore Corp., Bedford., MA01730)로 정제한 뒤, Genotech (GENOTECH, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 분석한 염기서열은 DNASTAR의 seqman 프로그램을 이용하여 편집한 후에 NCBI (National Center for Biotechnology Information) GeneBank의 염기서열을 획득하여 MEGA version5.
- rDNA-LSUPCR은 55℃에서 1분간 annealing의 조건으로 denaturation, annealing, extension의 과정을 35회 반복한 것 외에는 β-tubulin PCR과 같은 조건으로 수행하였다[9].
- 각 유전자 영역의 증폭을 위해서는 genomic DNA 1µL, 10X buffer 5 µL, 2.5 mM dNTP 3 µL, 각각의 100 pM primer 0.4 µL, 1.5 unit/µL Taq polymerase (SolGent Co.,Ltd.) 0.3 µL를 넣고 증류수로 최종량을 50 µL로 하였다.
- 분리된 균주는 형태적 특성과 분자적 특성을 함께 조사하여 동정하였다. 분리 균주의 형태적 특성을 관찰하기 위해 포자현탁액을 Penicillium속의 균주는 MEA, Czapek Yeast Extract Agar (CYA), Creatine Sucrose Agar (CREA)[20]배지에, Botrytis속의 균주는 MEA, Oatmeal Agar(OA), Dichloran Glycerol 18 % Agar (DG18) [20]배지에, Rhizopus속의 균주는 MEA, OA, DG18배지에 접종하여 25℃ 항온기에서 7일간 배양한 뒤에 배지상에서의 균주 생장 모습과 MEA 배지에서 자란 균주의 광학현미경에 의한 구조를 관찰하였다.
- 분리된 균주는 형태적 특성과 분자적 특성을 함께 조사하여 동정하였다. 분리 균주의 형태적 특성을 관찰하기 위해 포자현탁액을 Penicillium속의 균주는 MEA, Czapek Yeast Extract Agar (CYA), Creatine Sucrose Agar (CREA)[20]배지에, Botrytis속의 균주는 MEA, Oatmeal Agar(OA), Dichloran Glycerol 18 % Agar (DG18) [20]배지에, Rhizopus속의 균주는 MEA, OA, DG18배지에 접종하여 25℃ 항온기에서 7일간 배양한 뒤에 배지상에서의 균주 생장 모습과 MEA 배지에서 자란 균주의 광학현미경에 의한 구조를 관찰하였다.
- , MA01730)로 정제한 뒤, Genotech (GENOTECH, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 분석한 염기서열은 DNASTAR의 seqman 프로그램을 이용하여 편집한 후에 NCBI (National Center for Biotechnology Information) GeneBank의 염기서열을 획득하여 MEGA version5.2.2의 Neighbor-Joining [11] 계통도를 작성하였다. 균주간 거리는 Tamura-Nei 상수 거리계산 모델을 사용하였고 1,000회의 bootstrap 분석을 통해 신뢰도를 평가하였다.
- 분자적 동정을 위하여 분리된 균주를 Malt Extract Broth(MEB)에 접종하고 25℃에서 5일간 진탕배양하여 균사체를 수확하였다. 수확한 균사체는 동결건조 후에 마쇄하고 Dneasy Plant Mini Kit (QIAgen, Hilden, Germany; 69106)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다.
- 분자적 동정을 위하여 분리된 균주를 Malt Extract Broth(MEB)에 접종하고 25℃에서 5일간 진탕배양하여 균사체를 수확하였다. 수확한 균사체는 동결건조 후에 마쇄하고 Dneasy Plant Mini Kit (QIAgen, Hilden, Germany; 69106)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. Penicillium속의 균주는 β-tubulin영역을, Botrytis속의 균주는 RPB2 영역을, Rhizopus속의 균주는 rDNA-LSU영역을 증폭하였다.
데이터처리
- 2의 Neighbor-Joining [11] 계통도를 작성하였다. 균주간 거리는 Tamura-Nei 상수 거리계산 모델을 사용하였고 1,000회의 bootstrap 분석을 통해 신뢰도를 평가하였다.
이론/모형
- 경북 청도감와인(주)으로부터 의뢰 받은 냉장저장 중인 청도 반시에 발생한 곰팡이를 핀셋으로 집어서 배지에 치상하는 직접분리법에 의하여 분리하였다. 직접분리법에는 Malt Extract Agar (MEA) [20]배지를 사용하였다[7].
- 직접분리법에는 Malt Extract Agar (MEA) [20]배지를 사용하였다[7]. 분리된 균주는 단포자 분리법으로 순수 분리하였으며, MEA 사면배지에 배양하여 4℃에 보존하면서 실험에 사용하였다.
- 경북 청도감와인(주)으로부터 의뢰 받은 냉장저장 중인 청도 반시에 발생한 곰팡이를 핀셋으로 집어서 배지에 치상하는 직접분리법에 의하여 분리하였다. 직접분리법에는 Malt Extract Agar (MEA) [20]배지를 사용하였다[7]. 분리된 균주는 단포자 분리법으로 순수 분리하였으며, MEA 사면배지에 배양하여 4℃에 보존하면서 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 분리한 곰팡이를 형태적 특성과 분자적 특성에 근거하여 동정한 결과 이들은 Botrytis cinerea Pers. (4 균주), Penicillium expansum Link (2 균주), Rhizopus delemar (Boidin) Wehmer & Han zawa (1 균주)로 동정되었다. 이들 중에서는 B.
- KACC 47368은 MEA배지에서 0, 4, 10, 15, 25℃에서 배양한 결과 0, 0.7 cm, 1.7 cm, 3 cm, 3.4 cm로 25℃에서 가장 잘 자랐으며, 4℃에서도 생육이 가능한 것을 확인하였다. 7일간 배양했을 때 CYA배지에서의 집락의 색깔은 cream yellow에서 배양시간이 경과됨에 따라 약간의 blue green을 나타냈으며, MEA배지에서는 blue green을 많이 나타내고 균사 끝부분은 white를 나타내었다.
- rDNA-LSU 유전자 분석 결과 R. delemar CBS 278.38 균주와 염기서열이 100% 일치(Fig. 4C)하고 R. oryzae와는 다소 차이를 보임으로써 KACC 47370 균주는 Rhizopus delemar (Boidin) Wehmer & Hanzawa로 최종 동정되었다.
- 광학현미경을 통한 관찰 결과 Conidia는 크기가 3.4-4.1 × 3.1-3.4 µm로 타원형이었으며, Conidiophore는terverticillate이었고 균사표면으로부터 대부분 형성되었다.
- 이상의 결과로 볼 때에 냉장 저장중인 감에서 분리된 곰팡이는 기회와 주의사항을 동시에 제공하는 것으로 생각된다. Botrytis cinerea와 Rhizopus delemar는 산업적으로 활용이 가능한 균주를 선발하여 제어된 환경에서 이 균주를 활용할 수 있는 방안을 강구할 필요성이 있는 것으로 사료되는 반면에, patulin, citrinin 등의 독소를 생산할 가능성이 있는 Penicillium expansum는 이들의 발생 억제를 위한 주의와 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 포자낭포자는 7.1-7.8 × 5.4-5.6 µm의 크기로 표면에 세로로 길게 줄이 그어져 있는 주름이 진 형태(Fig. 3)로 Rhizopus oryzae, Rhizopus delemar 균주와 유사한 형태적 특징을 보였다.
후속연구
- 이상의 결과로 볼 때에 냉장 저장중인 감에서 분리된 곰팡이는 기회와 주의사항을 동시에 제공하는 것으로 생각된다. Botrytis cinerea와 Rhizopus delemar는 산업적으로 활용이 가능한 균주를 선발하여 제어된 환경에서 이 균주를 활용할 수 있는 방안을 강구할 필요성이 있는 것으로 사료되는 반면에, patulin, citrinin 등의 독소를 생산할 가능성이 있는 Penicillium expansum는 이들의 발생 억제를 위한 주의와 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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