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문제 정의
- 본 연구는 반추위 메탄저감용 약용식물 첨가제 개발을 위해 유산균을 이용하여 발효한 두충 및 감초 추출물의 항균활성, 항산화활성 및 in vitro 반추위 발효시험을 실시하였다. 발효 약용식물 추출물 제조를 위해 접종된 종균의 성장효율을 조사하기 위해 실시한 생균수 측정 결과 L.
- 이에 본 연구는 다양한 유산균을 이용하여 두충 및 감초를 발효시키고, 그 추출물을 이용하여 항산화활성, 항균활성 및 반추위 메탄저감효과를 조사함으로써, 이를 친환경약용식물 반추가축사료첨가제로 개발하기 위하여 수행되었다.
제안 방법
- 전라북도 진안 소재의 전북 축산 위생 연구소 한우 시험장에서 반추위 캐뉼라 장착 한우 거세우(체중 400 kg ± 30 kg) 2두를 이용하였다. 공시축은 하루에 2회 오전(08:00)과 오후(17:30)에 볏짚 4 kg과 비육전기 배합사료 4 kg을 급여하였다.
- 8%(w/v) NaCl을 이용하여 희석하였으며, MRS 평판 배지를 이용하여 평판 도말 하였다. 균주 희석액을 도말한 MRS 평판 배지는 30℃에서 20시간 이상 배양하였고, 배양 후 배지에 형성된 colony 개수를 계수하였다. 생균수 농도는 Log10 (CFU/mL)로 환산하여 표기하였다.
- plantarum NJ45로 발효한 두충을 이용한 추출물을 첨가한 처리구를 처리구 2(ENJ40) 및 처리구 3(ENJ45)로 설정하였다. 또한 발효하지 않은 감초를 이용한 추출물을 처리구 4(GN, G. uralensis)로 하였으며, 각각 L. curvatus NJ40과 L. plantarum NJ45로 발효한 감초를 이용한 처리구를 처리구 5(GNJ40) 및 처리구 6(GNJ45)로 명명하였다. 배양시간 동안 반추위 발효 pH는 통계적 유의차가 나타나지 않았다.
- 생균수 측정은 연속 희석법과 평판 도말법을 이용하였다. 멸균된 0.8%(w/v) NaCl을 이용하여 희석하였으며, MRS 평판 배지를 이용하여 평판 도말 하였다. 균주 희석액을 도말한 MRS 평판 배지는 30℃에서 20시간 이상 배양하였고, 배양 후 배지에 형성된 colony 개수를 계수하였다.
- 두충과 감초 추출물이 in vitro 반추위 발효 성상에 미치는 효과는 Table 2와 같다. 반추위 in vitro 발효는 총 7개 시험구로 진행하였다. 아무것도 첨가하지 않은 시험구를 대조구(NC, negative control)로 하였고, 발효하지 않은 두충을 이용한 추출물을 처리구 1(EN, E.
- ✕ 30 m length, SUPELCO, USA)이 장착된 gas chromatograph(HP7890, Agilant, CA, USA)로 분석하였고, oven, inlet 및 TCD 온도는 각 100℃, 150℃ 및 150℃였다. 반추위 발효 pH는 발효가 종료된 배양병을 개봉하여 pH meter(S20 Seven EasyTM, Mettler-Toledo)로 측정하였다. Chaney와 Marbach(1962)의 방법에 따라 반추위액의 암모니아태 질소 함량을 평가하였다.
- 이후 paper disk를 준비된 병원균 함유 중층배지에 올려놓고, 37℃ 항온항습기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 중층배지에 형성된 생육저지환의 지름을 측정하여 항균활성을 평가하였다.
- 3과 같다. 본 실험에 사용된 3가지 수준의 전개용매를 이용하여 각 감초추출물의 반응 생성물을 분리하고, DPPH 용액을 이용하여 항산화 활성을 띄는 물질을 확인하였다. Ethyl acetate/methanol/water 수준의 용매에서 감초추출물 중 L.
- 총 가스 생성량은 실험용 유리주사기를 이용하여 배양병 내 가스 생성량을 측정하였다. 수소 및 메탄 생성량은 미리 포집해 둔 가스를 이용하여 CarboxenTM, fused silica capillary column(0.53 mm i.d. ✕ 30 m length, SUPELCO, USA)이 장착된 gas chromatograph(HP7890, Agilant, CA, USA)로 분석하였고, oven, inlet 및 TCD 온도는 각 100℃, 150℃ 및 150℃였다. 반추위 발효 pH는 발효가 종료된 배양병을 개봉하여 pH meter(S20 Seven EasyTM, Mettler-Toledo)로 측정하였다.
- 반추위 in vitro 발효는 총 7개 시험구로 진행하였다. 아무것도 첨가하지 않은 시험구를 대조구(NC, negative control)로 하였고, 발효하지 않은 두충을 이용한 추출물을 처리구 1(EN, E. ulmoides), 각각 L. curvatus NJ40과 L. plantarum NJ45로 발효한 두충을 이용한 추출물을 첨가한 처리구를 처리구 2(ENJ40) 및 처리구 3(ENJ45)로 설정하였다. 또한 발효하지 않은 감초를 이용한 추출물을 처리구 4(GN, G.
- 휘발성지방산은 Erwin 등(1961)의 방법에 준하여, 사료 입자가 제거된 반추위액의 상등액 1 mL에 metaphosphoric acid 200 uL를 첨가하고 30분 동안 정치하여 13,000 rpm에서 원심분리하고 2 mL syringe filter를 이용하여 여과한다. 전 처리과정을 거친 시료를 NukolTM, fused silica capillary column(0.25 mm i.d. ✕ 0.25 um film ✕ 30 m length, SUPELCO, USA)이 장착된 gas chromatograph(HP7890, Agilant, CA, USA)로 분석하였고, oven, injector 및 detector 온도는 각 180℃, 220℃ 및 200℃였다.
- 4:5, for polar/neutral), chloroform/ethyl acetate/formic acid(CEF, 5:4:1, for intermediate polarity/acidic) 및 benzene/ethanol/ammonium hydroxide(BEA, 90:10:1, for non-polar/basic)를 사용하였다. 전개 완료 후 TLC plate를 충분히 건조하고, 0.2% DPPH 용액(w/v, in methanol)을 고르게 분사하여 각각의 분획을 관찰하였다.
- 접종된 균주들의 성장효율 평가를 위해 발효 종료 후 생균수측정을 실시하였다. 생균수 측정은 연속 희석법과 평판 도말법을 이용하였다.
- 총 가스 생성량은 실험용 유리주사기를 이용하여 배양병 내 가스 생성량을 측정하였다. 수소 및 메탄 생성량은 미리 포집해 둔 가스를 이용하여 CarboxenTM, fused silica capillary column(0.
- 항균활성은 준비된 약용식물 추출물을 이용하여 평가하였다. 실험에 사용한 병원균은 Staphylococcus aureus(wild type), Listeria monocytogenes KACC0550, Salmonella gallinarum ATCC9184 및 Mannheimia haemolytica(wild type)로 구성하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 젖산균 6종으로는 Weissella confusa NJ28(Genbank accession number KJ914897), Weissella cibaria NJ33(Genbank accession number KJ914898), Lactobacillus curvatus NJ40(Genbank accession number KJ914899), Lactobacillus brevis NJ42(Genbank accession number KJ914900), Lactobacillus plantarum NJ45(Genbank accession number KJ914901) 및 Lactobacillus sakei NJ48(Genbank accession number KJ914902)을 사용하였다. Man, Rogosa, and Sharpe broth(MRS, Difco Laboratories, USA)를 균주배양을 위한 배지로 사용하였다.
- 기질로 사용된 오차드그라스는 2 mm sieve가 장착된 실험실용 분쇄기(Cutter mill, IKA MF10.1, Staufen, Germany)를 이용하여 분쇄하였다. 시험 설계는 대조구와 두충 및 감초추출물을 첨가한 처리구로 구성하고 24시간 동안 각각 3반복하였으며, Tilley와 Terry(1963)의 방법에 따라 수행하였다.
- 실험에 사용된 약용식물인 두충(Eucommia ulmoides Oliv.) 및 감초(Glycyrrhiza uralensis)는 전라북도 전주시 소재의 대형마트에서 구입하였다. 구입한 약용식물 2종은 열풍건조기를 이용하여 24시간 동안 60℃에서 건조하고, cutter miller(Philips, HR2860, Netherlands)를 이용하여 곱게 분쇄한 후에 사용하였다.
- 실험에 사용된 젖산균 6종으로는 Weissella confusa NJ28(Genbank accession number KJ914897), Weissella cibaria NJ33(Genbank accession number KJ914898), Lactobacillus curvatus NJ40(Genbank accession number KJ914899), Lactobacillus brevis NJ42(Genbank accession number KJ914900), Lactobacillus plantarum NJ45(Genbank accession number KJ914901) 및 Lactobacillus sakei NJ48(Genbank accession number KJ914902)을 사용하였다. Man, Rogosa, and Sharpe broth(MRS, Difco Laboratories, USA)를 균주배양을 위한 배지로 사용하였다.
- 항균활성은 준비된 약용식물 추출물을 이용하여 평가하였다. 실험에 사용한 병원균은 Staphylococcus aureus(wild type), Listeria monocytogenes KACC0550, Salmonella gallinarum ATCC9184 및 Mannheimia haemolytica(wild type)로 구성하였다. 항균활성은 중층배지를 이용한 생육저지환 측정법을 이용하였으며, 실험 방법은 다음과 같다.
- 약용식물 추출물의 TLC-DPPH screening assay는 Masoko와 Eloff(2008)에 준하여 수행하였으며, TLC silica gel F254(Silica gel 60 F254, Merck)를 이용하였다. 전개용매는 3가지 수준의 ethyl acetate/methanol/water(EMW, 40:5.4:5, for polar/neutral), chloroform/ethyl acetate/formic acid(CEF, 5:4:1, for intermediate polarity/acidic) 및 benzene/ethanol/ammonium hydroxide(BEA, 90:10:1, for non-polar/basic)를 사용하였다. 전개 완료 후 TLC plate를 충분히 건조하고, 0.
- 전라북도 진안 소재의 전북 축산 위생 연구소 한우 시험장에서 반추위 캐뉼라 장착 한우 거세우(체중 400 kg ± 30 kg) 2두를 이용하였다.
데이터처리
- 각 시험구간 유의성검증은 일반선형모형으로 분산분석을 실시한 후, 사후분석으로 Duncan’s multiple range test를 하였다.
- 각 시험구간 유의성검증은 일반선형모형으로 분산분석을 실시한 후, 사후분석으로 Duncan’s multiple range test를 하였다. 통계적 유의성은 5%의 유의수준으로 평가하였다.
이론/모형
- 반추위 발효 pH는 발효가 종료된 배양병을 개봉하여 pH meter(S20 Seven EasyTM, Mettler-Toledo)로 측정하였다. Chaney와 Marbach(1962)의 방법에 따라 반추위액의 암모니아태 질소 함량을 평가하였다. 반추위액 배양액을 4,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 사료입자가 제거된 상등액 20 uL에 phenol color reagent 1 mL와 alkali-hypochlorite reagent 1 mL을 완전히 혼합하고, 50℃에서 7분간 반응 후 분광광도계(Optizen UV2120, Mecasis, Korea)를 이용하여 630 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 접종된 균주들의 성장효율 평가를 위해 발효 종료 후 생균수측정을 실시하였다. 생균수 측정은 연속 희석법과 평판 도말법을 이용하였다. 멸균된 0.
- 1, Staufen, Germany)를 이용하여 분쇄하였다. 시험 설계는 대조구와 두충 및 감초추출물을 첨가한 처리구로 구성하고 24시간 동안 각각 3반복하였으며, Tilley와 Terry(1963)의 방법에 따라 수행하였다.
- 약용식물 추출물의 TLC-DPPH screening assay는 Masoko와 Eloff(2008)에 준하여 수행하였으며, TLC silica gel F254(Silica gel 60 F254, Merck)를 이용하였다. 전개용매는 3가지 수준의 ethyl acetate/methanol/water(EMW, 40:5.
- 약용식물 추출물의 항산화활성은 Juan과 Chou(2010)에 준하여 수행하였으며, DPPH(2, 2-di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl, Sigma, USA)를 이용하여 자유기 소거능을 평가하였다.
- 실험에 사용한 병원균은 Staphylococcus aureus(wild type), Listeria monocytogenes KACC0550, Salmonella gallinarum ATCC9184 및 Mannheimia haemolytica(wild type)로 구성하였다. 항균활성은 중층배지를 이용한 생육저지환 측정법을 이용하였으며, 실험 방법은 다음과 같다. 4종의 병원균들은 LB(Difco, USA) 액체배지를 이용하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
- 반추위액 배양액을 4,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 사료입자가 제거된 상등액 20 uL에 phenol color reagent 1 mL와 alkali-hypochlorite reagent 1 mL을 완전히 혼합하고, 50℃에서 7분간 반응 후 분광광도계(Optizen UV2120, Mecasis, Korea)를 이용하여 630 nm에서 흡광도를 측정하였다. 휘발성지방산은 Erwin 등(1961)의 방법에 준하여, 사료 입자가 제거된 반추위액의 상등액 1 mL에 metaphosphoric acid 200 uL를 첨가하고 30분 동안 정치하여 13,000 rpm에서 원심분리하고 2 mL syringe filter를 이용하여 여과한다. 전 처리과정을 거친 시료를 NukolTM, fused silica capillary column(0.
성능/효과
- Fig. 2B의 감초 추출물 첨가 시 항산화활성 결과로 보아 감초는 전체 처리구가 유의적으로 높은 항산화활성을 나타내는 것으로 조사되었다(p<0.05).
- plantarum NJ45 로 발효한 추출물이 일부 병원균에 대한 항균효과를 나타내는 것으로 조사되었다. In vitro 반추위 발효시험에서 두충 및 감초 발효 추출물을 적용한 결과, 감초 추출물에서 메탄 저감효과가 나타났다. 특히 반추위내 미생물 발효 특성을 대표할 수 있는 휘발성지방산 생성효율을 향상 시키면서, 전반적 반추위 발효에 부정적 영향이 없는 것으로 나타났다.
- 1A, 1B에서 보는 바와 같다. W. confusa NJ28, W. cibaria NJ33 및 L. sakei NJ48을 제외한 나머지 젖산균들은두충과 감초를 포함한 배지에서 안정적인 성장을 보이는 것으로 조사되었다. 두충이 포함된 배지에서는 W.
- 대조구와 처리구의 항산화활성 측정 결과는 Figure 2A, 2B에서 보는 바와 같다. 각 추출물들의 두충 추출물 첨가 시 항산화활성은 수치적으로 19%에서 30%로 다양하게 조사되었으나, 각 처리구들간의 차이에 대한 통계적 유의성은 나타나지 않았다. 이에 따라 종균을 이용한 두충의 식물 발효 시 항산화활성의 변화는 나타나지 않는 것으로 판단된다.
- 두충이 포함된 배지에서는 W. confusa NJ28 및 L. curvatus NJ40에서 유의적으로 높은 균주 성장률을 나타내었다(p<0.05).
- 로 판단되었다. 또한 총 휘발성지방산은 반추위내 발효를 평가하는 주된 지표로서, 안정적인 발효가 이루어졌을 때 높은 생성량을 나타내는데, 본 실험결과 두충과 감초 추출물의 첨가가 안정적인 반추위 발효에 기여한 것으로 판단된다. 섬유질 사료의 분해에 의해 생성 되는 acetate는 총 휘발성지방산과 비슷한 수준으로 나타났으며, NC에 비해 식물추출물 첨가구들에서 높았고 특히 GN에서 유의적으로 가장 높게 조사되었다(p<0.
- 메탄 생성량은 감초 추출물 첨가구에서 전반적으로 낮았으며, 두충 추출물 첨가구가 유의적으로 높은 생성량을 나타내었다(p<0.05).
- 메탄 생성량을총 휘발성지방산 생성량 대비 환산하여 비교한 결과, NC와 두충 추출물 첨가구는 비슷한 수준으로 나타났으며, 감초 추출물 첨가구 중 GN 및 GNJ40에서 유의적으로 낮은 메탄 생성 효율을 나타내는 것으로 조사되었다(p<0.05).
- 미생물 발효에 의해 생성되는 총 가스 생성량은 NC 및 두충 추출물 첨가구에서 유의적으로 높았으며, 전반적으로 감초 추출물 첨가구에서 유의적으로 낮게 나타났다(p<0.05).
- 발효 약용식물 추출물 제조를 위해 접종된 종균의 성장효율을 조사하기 위해 실시한 생균수 측정 결과 L. curvatus NJ40, L. brevis NJ42 및 L. plantarum NJ45가 두충과 감초 모두에서 유의적으로 높은 균주 성장을 나타냈다(p<0.05).
- 섬유질 사료의 분해에 의해 생성 되는 acetate는 총 휘발성지방산과 비슷한 수준으로 나타났으며, NC에 비해 식물추출물 첨가구들에서 높았고 특히 GN에서 유의적으로 가장 높게 조사되었다(p<0.05).
- 암모니아태 질소 생성량은 감초 추출물 첨가구에서 유의적으로 높게 나타났으며, 전반적으로 두충 추출물 첨가구에서 유의성 있게 낮았다 (p<0.05).
- 05). 특히 대조구 대비 종균 발효가 된 전체 처리구가 높았으며, 이는 감초 발효 시 식물의 항산화활성이 개선된 것으로 예측해 볼 수 있다.
- In vitro 반추위 발효시험에서 두충 및 감초 발효 추출물을 적용한 결과, 감초 추출물에서 메탄 저감효과가 나타났다. 특히 반추위내 미생물 발효 특성을 대표할 수 있는 휘발성지방산 생성효율을 향상 시키면서, 전반적 반추위 발효에 부정적 영향이 없는 것으로 나타났다.
- 05). 항균활성측정 결과는 두충과 감초 추출물에서 공통적으로 L. curvatus NJ40 및 L. plantarum NJ45 로 발효한 추출물이 일부 병원균에 대한 항균효과를 나타내는 것으로 조사되었다. In vitro 반추위 발효시험에서 두충 및 감초 발효 추출물을 적용한 결과, 감초 추출물에서 메탄 저감효과가 나타났다.
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