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문제 정의
- 따라서 위와 같은 효과를 가진 천연 식물 인삼(Ginseng), 도라지(Balloon flower), 유카식물(Yucca plant), 동백나무(Camellia), 차나무(Tea plant) 및 오갈피(Ogapi) 추출물의 첨가가 in vitro 메탄 발생 및 반추위 발효 성상에 미치는 영향에 대해 구명 하고자 연구를 실시하게 되었다.
제안 방법
- 50 ml serum bottle에 timothy 0.3 g, 반추위액 5 ml, McDougall’sbuffer 10 ml를 각각 넣고 인삼, 도라지, 유카식물, 동백나무, 차나무, 오갈피 추출물을 기질의 5%를 첨가한 뒤 발효시간대별(3, 6, 9, 12, 24, 48, 및 72시간) 7처리 3반복 수행하였다.
- 6가지 천연 식물 추출물 인삼(Ginseng), 도라지(Balloon flower), 유카식물(Yucca plant), 동백나무(Camellia), 차나무(Tea plant) 및 오갈피(Ogapi)는 한국식물추출물은행에서 분양받았으며(Table 2), dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Mo, USA) 1 ml에 희석한 후 15 µl 분주 후 39℃ shaking incubator (Jeio Tech, SI-900R; 120 rpm)에서 발효시간별(3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72시간)로 식물 추출물을 분주하지 않은 timothy를 포함한 7처리 3반복 147개의 serum bottle로 in vitro 시험을 수행하였다.
- 6가지 천연 식물 추출물의 첨가가 반추동물의 메탄 감소에 대한 연구를 수행하였다. 반추위액은 cannula가 장착된 한우에서 채취하였으며, 공시축의 사양관리는 timothy와 농후사료 6:4 비율로 급여하였다.
- pH는 가스 발생량 측정 후 serum bottle의 aluminum cap 및 butyl rubber를 weaton decapper(Weaton co., USA)를 이용하여 제거하여 건물소화율 실험을 위한 nylon bag을 수거 후 각 발효시간대별(3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72시간) serum bottle 내 배양액을 pH meter (MettlerToledo, MP230)를 이용하여 측정하였다.
- 6가지 천연 식물 추출물의 첨가가 반추동물의 메탄 감소에 대한 연구를 수행하였다. 반추위액은 cannula가 장착된 한우에서 채취하였으며, 공시축의 사양관리는 timothy와 농후사료 6:4 비율로 급여하였다. 50 ml serum bottle에 timothy 0.
- 배양액 채취 후 nylon bag을 수거하여 물을 채운 수조에 넣고 heidolphs rotamax 120(Heidolph Instrument, Germany)를 이용하여 100 rpm 으로 20분씩 3회 씻은 후 65℃의 dry oven (Jeio tech, Korea)에서 약 24시간 건조시켜 건물 잔량을 측정하였다. 건물 소화율 공식은 아래와 같다.
- 배양액을 1.5 ml eppendorf tube에 1 ml 채취하여 12,000 rpm에서 3분간 원심 분리하여 사료 입자를 제거하고, 상등액을 0.20 µm syringe filter를 이용하여 2 ml serum bottle에 여과 후 -80℃ deep freezer에 보관하였고, 분석은 HPLC (High performance liquid chromatography, Agilent-1200, Germany)를 이용하였다.
- 배양액을 1.5 ml eppendorf tube에 1 ml 채취하여 사료입자를 제거하기 위해 3,000 rpm에서 3분간 원심 분리하여 새로운 eppendorf tube에 상등액을 채취 후, 14,000 rpm에서 3분간 원심 분리하여 미생물 pellet을 침전시켜 상등액을 제거하고 pellet에 sodium phosphate buffer(pH 6.5)를 1 ml 첨가하는 세척 과정을 3회 반복 후 spectrophotometer (BIO-RAD, Model 680)를 이용하여 550 nm에서 O.D. (optical density) 값을 구하여 미생물 성장량을 측정하였다.
- Serum bottle을 shaking incubator에서 꺼낸 후, Theodorou 등(1994)의 방법으로 serum bottle의 head space에 있는 가스 발생량을 detachable pressure transducer 및 digital read-out voltmeter (Laurel Electronics, Inc, CA, USA)를 사용하여 측정하였고, 10 ml profi syringe 주사기를 이용하여 가스 포집 후 9 ml 진공시험관(vacutainer)에 옮겨 담았다. 총 가스, 이산화탄소 및 메탄 발생량은 1 ml profi syringe 주사기로 이용하여 포집 후 GC (HP5890 Gas Chromatography, USA)를 사용하여 분석하였다.
대상 데이터
- Column은 300 mm × 7.8 mm I.d MetaCarb87H (Varian, USA)를 사용하였으며, 온도는 35℃에서 사용하였다.
- 경상남도 진주시 경상대학교 야생동물보호센터에서 반추위에 cannula가 장착된 한우 암소 1두(체중 450±30 kg)로부터 in vitro 반추위 발효 시험을 위한 시험용 위액을 채취하였고, 사료는 timothy와 농후사료 비율을 6:4로 하여 체중의 2%를 1일 2회(09:00 및 17:00) 분할 급여하였고, 물과 미네랄 블록은 자유섭취토록 하였다.
데이터처리
- 본 시험에서 얻은 결과들은 SAS package program (1996)의 general linear model (GLM) procedure를 이용하여 분산분석을 하였고, Duncan’s multiple range test (Duncan, 1995)의 다중검정방법으로 평균 간의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- Serum bottle을 shaking incubator에서 꺼낸 후, Theodorou 등(1994)의 방법으로 serum bottle의 head space에 있는 가스 발생량을 detachable pressure transducer 및 digital read-out voltmeter (Laurel Electronics, Inc, CA, USA)를 사용하여 측정하였고, 10 ml profi syringe 주사기를 이용하여 가스 포집 후 9 ml 진공시험관(vacutainer)에 옮겨 담았다. 총 가스, 이산화탄소 및 메탄 발생량은 1 ml profi syringe 주사기로 이용하여 포집 후 GC (HP5890 Gas Chromatography, USA)를 사용하여 분석하였다.
성능/효과
- Acetate 농도는 발효 24시간 인삼, 도라지 첨가 구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 감소하였고, propionate 농도는 발효 48시간 인삼, 도라지 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였다.
- Acetate 농도는 발효 3시간대 유카식물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮았고, 발효 24시간대 인삼, 도라지, 오갈피 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮았으며, 발효 48, 72시간대 모든 첨가구에서 대조구와 차이를 보이지 않았다.
- Propionate 농도는 발효 3시간대 유카식물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았고, 발효 12시간대 차나무, 오갈피 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 발효 48시간대 인삼, 도라지 첨가구, 발효 72시간대 인삼 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다.
- Total VFA 농도는 발효 12시간 차나무, 오갈피 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였고, 발효 48시간 인삼, 도라지 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였다.
- 05)으로 증가하였다. 결과적으로 6가지 천연식물 추출물의 첨가는 in vitro 반추위 발효성상에는 이상이 없었으나 메탄 감소의 효과는 나타나지 않았다. 추후 6가지 천연 식물 추출물의 농도를 달리하여 추가적인 시험이 필요할 것으로 사료 된다.
- 식물추출물을 첨가한 메탄발생량 저감 선행연구는 pen 등(2006)과 Gel 등(2012)이 있으며, Kim 등(2015)의 실험에서 9시간대 동백나무 추출물에서도 감소하는 효과를 보였다. 그러나 본 실험에서 이용된 유카식물, 동백나무 추출물의 첨가는 메탄 감소에 효과가 없었으며, 뿐만 아니라 나머지 식물 추출물에서도 감소 효과는 나타나지 않았다. Ok 등(2011)의 in vitro 실험 오갈피 첨가구에서도 메탄 발생량 감소에 영향을 미치지 않는 결과와 일치 하였다.
- 미생물성장량은 발효 12시간대 인삼, 도라지 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였고, 발효 24시간대 인삼, 유카식물, 차나무, 오갈피 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였다.
- 발효 12시간대 차나무, 오갈피 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았는데 acetate 농도, propionate 농도가 증가하여 total VFA 농도가 높아 위와 같은 결과가 나타났다고 사료된다.
- 발효 12시간대 총 가스 발생량이 가장 높았던 인삼, 도라지 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 발효 24시간대 인삼, 유카식물, 차나무, 오갈피 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다.
- 발효 24, 48시간대 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)인 차이가 나타나지 않았으며, 발효 72시간대 동백나무 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다.
- 발효 24시간대 인삼, 차나무 첨가구를 제외한 나머지 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮았다.
- 발효 48시간대 동백나무 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮았고, 오갈피 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 발효 72시간대 인삼 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다.
- 발효 48시간대에 인삼, 도라지 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 발효 72시간대 인삼, 도라지, 유카식물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다.
- 발효 6, 9, 12시간대 차나무첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았고, 발효 72시간대 유카식물, 차나무, 오갈피 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 이를 제외한 발효시간대에는 대조구와 첨가구에 유의적(P<0.05) 차이가 없었다.
- 이산화탄소 발생량은 발효 6시간대 유카식물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮았고, 발효 12시간대 유카식물, 동백나무, 차나무 첨가 구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다.
- 총 가스 발생량은 발효 24시간대 인삼, 도라지 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았고, 발효 72시간대 동백나무 첨가구를 제외한 나머지 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다.
- 총 가스 발생량은 발효 24시간대 인삼, 도라지 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였다.
- 05)으로 높았다. 총 가스 발생량이 줄어들지 않는 것으로 보아 6가지 천연 식물 추출물은 반추위 내 미생물뿐만 아니라 발효성상에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있다. 이산화탄소 발생량은 발효 6시간대 유카식물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.
- 특히 발효 3시간대의 유카식물첨가구의 acetate 농도는 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮았고, propionate 농도는 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다.
후속연구
- 결과적으로 6가지 천연식물 추출물의 첨가는 in vitro 반추위 발효성상에는 이상이 없었으나 메탄 감소의 효과는 나타나지 않았다. 추후 6가지 천연 식물 추출물의 농도를 달리하여 추가적인 시험이 필요할 것으로 사료 된다.
- 특히 발효 24시간대 인삼, 유카식물, 차나무, 오갈피, 발효 48시간대 오갈피, 발효 72시간대 인삼 첨가구는 대조구에 비해 총 가스 발생량 및 메탄 발생량의 감소가 일어나지 않는 것을 보아 protozoa의 감소는 일어나지 않았으나, bacteria의 수가 증가 하여 미생물 성장량이 높게 측정된 것으로 사료되며, sliwinski 등(2010) 유카식물 추출물 첨가 실험에서의 protozoa 감소가 일어나지 않은 선행 연구 결과와 일치하였다. 추후 Real-Time PCR을 통해 미생물의 군집 변화에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
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