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문제 정의
- 생성에 미치는 영향에 대한 연구가 전무하다. 이러한 이유로 본 연구에서 엄나무 줄기로부터 saponin과 같은 유효성분을 추출하기 위해 추출 방법을 달리하여 그 추출물을 알팔파를 사료원으로 하는 in vitro 반추위 발효실험에 첨가하여 반추위 발효특성 및 CH4 생성에 미치는 영향을 조사하였다.
- -N의 발생량을 감소시켜 단백질 이용효율을 증가시켰다. 특히 이들 추출물의 첨가로 CH4 생성량이 감소되어 축산업 분야에서 주요 온실가스 배출원인 반추동물의 장내로부터 배출되는 CH4의 저감을 위한 하나의 방법으로써 본 연구결과가 큰 의미를 가진다. 그러나, 본 실험은 분획배양실험으로 연속발효시험과 동물실험을 통한 엄나무 알코올 추출물의 CH4 저감효과에 대한 추가연구가 필요하다.
제안 방법
- 반추위액은 반추위 캐뉼라 (cannula)가 시술된 홀스타인 (체중 500 kg)로부터 채취하였다. 공시동물은 조사료와 농후사료를 6:4의 비율로 일 2회 급여하였다. 그리고 물과 미네랄 블록은 자유로이 섭취하도록 하였다.
- 공시동물은 조사료와 농후사료를 6:4의 비율로 일 2회 급여하였다. 그리고 물과 미네랄 블록은 자유로이 섭취하도록 하였다. 반추위액은 오전 사료 급여 1시간 전에 4겹의 cheese cloth로 여과 후 채취하였고, head space가 없도록 하여 배양병 (serum bottle)내 산소의 침입을 차단하였다.
- 메탄의 농도는 각 배양시간대별로 배양이 끝난 후 120 ml의 배양병의 마개에 주사바늘을 주입하여 주사기에 5 ml의 가스를 채집하였다. 메탄 농도의 분석은 TCD (Thermal Conductivity Detector)와 Hayesep-Q packed column (직경 3 mm, 길이 3 m, 80/100 mesh size)을 장착한 가스크로마토그래피(gas chromatography) (GC-14A, Shimadzu, Japan)를 이용하여 분석하였으며, 6:4 비율의 CH4과 CO2를 표준가스로 사용하였다. 총운전시간은 3분이었고, 수송가스로는 argon을 이용하였다.
- 엄나무 추출물은 생즙, 70% 에탄올, 70% 메탄올을 추출용매로 이용하였고 각각의 추출물은 다음과 같이 추출하였다. 믹서기로 분쇄한 엄나무를 cheese cloth를 이용하여 생즙을 추출하였고, 용매추출은 1 cm 내외로 조각 낸 엄나무 100 g에 추출용매 400 ml을 투입하였고, 38℃ 진탕배양기 (HBS-201SL, Hanbaek, Korea)를 이용하여 100 rpm에서 48시간동안 추출한 후 여과지 (Whatman filter paper No. 1, Whatman, England)에 여과하였고, 다시 감압농축기 (R-205 Professional/V-501, Buchi, Switzerland) 에서 10 ml가 남을 때까지 감압농축 하였다.
- 발효가스 발생량 측정은 각 시간대별 모든 배양병을 꺼내어 약 5분간 실온에서 방치시킨 후 분리형 압력 변환기 및 디지털 판독의 전압계 (Laurel Electronics, Inc., CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 배양시간이 완료된 후 배양병을 진탕배양기에서 꺼낸 후, 온도에 따른 변화를 감안하여 실온에서 5분간 방치시킨 후 배양병의 headspace내 총 가스 발생량, CH4 농도와 배양액내 pH를 즉시 조사하였고 휘발성지방산 (VFA) 및 암모니아태질소 (NH3-N) 농도의 분석은 배양액에서 시료 채취 후 조사하였다.
- 배양액의 pH는 각 발효시간대별 (24, 48시간)로 pH meter (Gmbh8603, Mettler-Toledo, Switzerland)를 이용하여 측정하였다.
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3. 시험방법
시험구는 추출물을 첨가하지 않은 처리구를 대조구로 하고, T1은 엄나무 생즙 추출물을 첨가하였고, T2는 엄나무 70% 에탄올 추출물을 첨가하였고, T3는 엄나무 70% 메탄올 추출물을 첨가하였다.
- 시험방법은 기질인 분쇄된 알팔파 건초 0.3 g을 120 ml의 배양병에 투입하였다. 배양개시한 시간 전 McDougall’s buffer (McDougall, 1948) 용액 (pH 6.
- 각 처리구별 배양병은 38℃ 진턍배양기에서 24 및 48시간동안 배양하였다. 시험은 각 처리 별 및 각 배양시간대별 3반복으로 진행되었다.
- 2 ml를 첨가하여 혼합한 후 실온에서 30분간 정치시켰다. 실온에서 정치시킨 배양액은 분석 전까지 －20℃의 냉동고에 보관하였다가 마이크로원심분리기 (microcentrifuge) (5415R, Eppendorf, Germany) 를 이용하여 13,000 rpm에서 10분간 원심분리를 하여 얻어진 상층액을 가스크로마토그래피 (GC-14A, Shimadzu, Japan)를 이용하여 표준용액을 기준으로 분석하였다.
- -N 농도의 분석은 Chaney and Marbach (1962)의 방법으로 수행되었다. 암모니아 분석을 위한 전처리 과정은 우선 배양액에서 채취한 시료를 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 하여 얻어진 상층액과 NH3-N 표준용액 (5, 10, 25 NH3-N/100 ㎖)을 각각 시험관에 주입 후, phenol color reagent 와 alkali-hypochlorite를 1 ml씩 첨가하였다. 발색반응을 위해 37℃ 항온 수조에서 15분간 배양하여 반응을 시킨 후, 증류수를 8 ml 추가하여 희석하였다.
- 0 mm로 분쇄한 알팔파 건초를 기질로 이용하였고, 시험구에 사용된 엄나무는 경기도 안성시 인근에서 채취하였다. 엄나무 추출물은 생즙, 70% 에탄올, 70% 메탄올을 추출용매로 이용하였고 각각의 추출물은 다음과 같이 추출하였다. 믹서기로 분쇄한 엄나무를 cheese cloth를 이용하여 생즙을 추출하였고, 용매추출은 1 cm 내외로 조각 낸 엄나무 100 g에 추출용매 400 ml을 투입하였고, 38℃ 진탕배양기 (HBS-201SL, Hanbaek, Korea)를 이용하여 100 rpm에서 48시간동안 추출한 후 여과지 (Whatman filter paper No.
- 발색반응을 위해 37℃ 항온 수조에서 15분간 배양하여 반응을 시킨 후, 증류수를 8 ml 추가하여 희석하였다. 이후 분광광도계 (spectrophotometer) (V-530, Jasco, Japan)를 이용하여 640 nm에서 흡광도 (optical density)를 측정하여 NH3-N 농도를 계산하였다.
대상 데이터
- 공시시료는 분쇄기 (hammer mill)에서 1.0 mm로 분쇄한 알팔파 건초를 기질로 이용하였고, 시험구에 사용된 엄나무는 경기도 안성시 인근에서 채취하였다. 엄나무 추출물은 생즙, 70% 에탄올, 70% 메탄올을 추출용매로 이용하였고 각각의 추출물은 다음과 같이 추출하였다.
- 반추위액은 반추위 캐뉼라 (cannula)가 시술된 홀스타인 (체중 500 kg)로부터 채취하였다. 공시동물은 조사료와 농후사료를 6:4의 비율로 일 2회 급여하였다.
데이터처리
- 시간대별 (24, 48시간) 배양액을 이용한 처리간 3반복을 통해 얻어진 모든 결과들은 SAS (Statistical Analysis System, 2003) package 의 GLM (General Linear Model) procedure을 이용하여 분산분석을 하였고, Duncan의 다중 검정방법 (Duncan, 1995)으로 평균 간의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 배양액 내 NH3-N 농도의 분석은 Chaney and Marbach (1962)의 방법으로 수행되었다. 암모니아 분석을 위한 전처리 과정은 우선 배양액에서 채취한 시료를 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 하여 얻어진 상층액과 NH3-N 표준용액 (5, 10, 25 NH3-N/100 ㎖)을 각각 시험관에 주입 후, phenol color reagent 와 alkali-hypochlorite를 1 ml씩 첨가하였다.
- 휘발성지방산의 농도는 Erwin et al. (1961) 의 방법으로 다음과 같이 분석을 실시하였다. 각 배양시간대별 pH 측정 후 배양액 1.
성능/효과
- Acetate : Propionate (A:P)의 비율은 대조구와 비교하여 처리구에서 모두 유의적으로 낮았다 (p<0.05).
- Iso-butyrate는 전 배양시간 동안 대조구에 비해 모든 처리구에서 유의적으로 낮았으며 (p<0.05), valerate 경우는 배양 24시간에는 T2를 제외한 전 처리구에서 대조구와 유의적인 차이를 보이지 않았고, 배양 48시간에는 대조 구에 비해 T2와 T3가 높았으며, T1은 유의적으로 감소하였다 (p<0.05).
- 그러나 배양 48시간에서는 대조구보다 T2와 T3가 유의적으로 높은 발생량을 나타내었고 (p<0.05), 배양 전시간 동안 에탄올을 이용하여 추출한 추출액을 첨가하였을 때 총 VFA 발생량이 가장 높았다.
- 모든 처리구에서의 pH값은 배양시간 동안 처리에 관계없이 5.75~6.44범위로 배양시간이 경과함에 따라 낮아졌으며, 처리구에 비해 대조구가 유의적 (p<0.05) 으로 높았다.
- 반추위 in vitro 배양액 내 개별 VFA 농도 변화에서 acetate의 농도는 배양 24시간에는 대조구에 비해 모든 처리구가 유의적인 차이가 없었으나, T2가 T1 보다 높았으며 (p<0.05), 배양 48시간에는 대조구에 비해 T2와 T3가 높았으며 (p<0.05), T1은 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 배양 48시간에는 대조구와 비교하여 T2와 T3가 유의적으로 높은 가스 발생량을 나타내었으며 (p<0.05), T1은 유의적인 차이가 없었다.
- 미생물 발효에 있어서 가스 발생량은 기질의 발효의 정도와 VFA 발생 정도를 나타내는 중요한 지표로서 간주되고 있다 (Beuvink and Spoelstra, 1992; Rymer and Givens, 2002). 본 시험에서 T2와 T3가 대조구에 비해 전 배양 시간 동안 가스 발생량이 유의적으로 높고, 총 VFA 생성량도 유의적으로 높은 것으로 보아 첨가된 엄나무 추출물 특히 알코올 추출물들이 반추위 미생물에 의한 발효를 증진시키는 효과가 있다고 생각이 된다.
- 알팔파 건초를 기질로 한 in vitro 반추위 내 미생물발효 특성 실험에 엄나무 알코올 추출물을 첨가하였을 때 반추위내 protozoa를 억제하고 bacteria의 활성을 증가시킴으로써 기질의 발효속도, 총 VFA 발생량과 총 가스 발생량을 촉진시키고, NH3-N의 발생량을 감소시켜 단백질 이용효율을 증가시켰다. 특히 이들 추출물의 첨가로 CH4 생성량이 감소되어 축산업 분야에서 주요 온실가스 배출원인 반추동물의 장내로부터 배출되는 CH4의 저감을 위한 하나의 방법으로써 본 연구결과가 큰 의미를 가진다.
- 하지만, 배양 48시간에는 대조구와 전 처리구에서 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과 엄나무에 대한 두 가지 알코올추출방법으로 추출된 추출물이 반추위내 protozoa의 수를 감소시켜 protozoa 에 공생하는 methanogen의 수를 억제하고, VFA 중 propionate를 증가시켜 반추위 내 methanogen의 수소이용을 감소시켜 CH4 생성이 감소된 것으로 생각된다. 특히 알코올 추출법에 의해 엄나무 내의 saponin과 유효한 물질들이 추출물에 더 많이 포함됨으로써 엄나무 즙에 비해 CH4 저감의 효과가 더욱 더 높았다고 생각된다.
- 총 가스 발생량의 경우, 배양 24시간부터 대조구에 비해 처리구에서 유의적으로 높았으며, 다른 처리구에 비해 T2의 가스 발생량이 가장 높았다 (p<0.05).
- 총 가스내 CH4의 농도는 배양 24시간에서는 T2와 T3가 대조구에 비해 낮았고 (p<0.05), T1의 경우, 대조구와 유의적인 차이를 보이지 않았다.
후속연구
- 특히 이들 추출물의 첨가로 CH4 생성량이 감소되어 축산업 분야에서 주요 온실가스 배출원인 반추동물의 장내로부터 배출되는 CH4의 저감을 위한 하나의 방법으로써 본 연구결과가 큰 의미를 가진다. 그러나, 본 실험은 분획배양실험으로 연속발효시험과 동물실험을 통한 엄나무 알코올 추출물의 CH4 저감효과에 대한 추가연구가 필요하다.
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