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문제 정의
- 특히 대부분의 연구결과가 β-gulcan을 위주로 한 친수성 성분에 집중되어 있고 소수성 성분에 대한 활성연구는 거의 전무하다고 할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 한국인의 주요 3대 암으로 분류되는 위암(AGS), 폐암(A529), 간암(HepG2) 세포주를 이용하여 꽃송이버섯 추출물의 소수성 분획물의 항암 활성을 평가하였다.
- 본 실험에서는 기존에 연구되어 있지 않은 꽃송이버섯 추출물의 지용성 물질에 대한 항산화 활성을 확인하고자 하였으며, 기준물질로 토코페롤(α-tocopherol)을 이용하여 보정곡선을 만들고 항산화 활성을 측정 하였다.
제안 방법
- 11%로 EtOAc가 물에 녹는 물질이 어느 정도 섞여있는 것으로 추측할 수 있다. Fig. 1과 같이 SOCC를 통해 12개의 분획물을 용출하였고, 각각 1 L 씩 용출하였다.
- MTT assay를 통하여 꽃송이버섯 추출물의 세포 독성을 측정하였다. 96 well plate의 각 well에 세포를 분주하고 37℃ humidified air/CO2 incubator에서 사전 배양하였다.
- crispa) 에탄올 추출물의 소수성 분획을 분리하고 각 분획의 DPPH 항산화 활성과 위암 (AGS), 폐암 (A529), 간암 (HepG2) 세포주를 이용한 항암 활성을 MTT assay를 통해 확인하였다. SOCC를 사용하여 총 18개의 fraction으로 분획하였고 TLC와 세포주를 이용한 항암 활성 확인을 통하여 5개의 fraction으로 압축하였다. 항암 활성이 높은 5개의 fraction은 HPLC-MS를 통해 각 분획물을 분석한 결과 항산화 활성을 보이지 않았으며 약 181.
- 7 cell을 사용하지 않고 한국인의 3대암으로 알려져 있는 위암 (AGS), 폐암 (A529), 간암 (HepG2) 세포주의 항암 활성을 MTT assay를 통해 확인 하였다. 꽃송이버섯 추출물을 컬럼 분획한 분획 (A1~A12까지 12개 분획물)을 이용하여 꽃송이버섯 추출물의 암세포성장 억제를 측정하였다. 위암 (AGS), 폐암 (A529), 간암 (HepG2) 등 3대암 세포에 대한 세포독성 여부를 % inhibition 또는 IC50값으로 확인 하였는데 1차 screening 시에는 0.
- 80% 정도의 confluence에 도달한 후 배지를 serum이 고갈된 배지로 교체하였고 overnight하여 안정화시켰다. 꽃송이버섯 추출물의 분획물을 가하고 24시간 동안 배양 후 배양액을 MTT 용 배지로 교체하였다. 2시간 동안 배양 후 MTT 용 배지를 제거하고 DMSO로 다시 용해 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 꽃송이버섯 추출물이 암세포의 성장을 억제 하는지 확인하기 위해 in vivo에서 암을 잘 유발한다고 알려진 murine B16F10 melanoma 세포를 C57BL/6J mouse의 복강에 주사하여 암을 발생시켜 꽃송이버섯 추출물을 21동안 식이 하였을 때 꽃송이버섯 추출물을 먹인 mouse의 경우 tumor의 volume이 증가하지 않음을 통해 항암 활성을 확인 하였으며(Kim et al., 2013), 꽃송이버섯 열수 추출물을 mouse 육종암 세포인 sarcoma 180 세포주에 처리하여 세포독성 을 확인하였고 BALB/c mouse 암컷 생쥐에게 복강 내에 이식하여 항암 활성을 조사 하였는데 in vitro에서는 1000 µg/ml의 농도에서 현저한 세포 독성을 발휘하였으며, In vivo에서는 400 mg/kg 투여군에서 유의성이 관찰 되었다(Chung et al., 2005).
- 또한 분리 후 성분의 검출 방법이 잘 알려져 있고 회수가 쉬워 각 성분의 정성 또는 정량분석이 가능하다. 본 실험에서는 SOCC를 이용하여 분리된 분획물을 TLC를 통해 확인하였다. TLC plate로는 silica 60(Merck)이 코팅된 aluminium sheets, 발색시약으로는 5% H2SO4 in ρ-anisaldehyde solution(Sigma)를 사용하였다.
- 본 실험에서는 기존의 연구에서 항암 활성이 밝혀져 있는 Raw 264.7 cell을 사용하지 않고 한국인의 3대암으로 알려져 있는 위암 (AGS), 폐암 (A529), 간암 (HepG2) 세포주의 항암 활성을 MTT assay를 통해 확인 하였다. 꽃송이버섯 추출물을 컬럼 분획한 분획 (A1~A12까지 12개 분획물)을 이용하여 꽃송이버섯 추출물의 암세포성장 억제를 측정하였다.
- 본 실험에서는 꽃송이버섯 (Sparassis crispa, formerly S. crispa) 에탄올 추출물의 소수성 분획을 분리하고 각 분획의 DPPH 항산화 활성과 위암 (AGS), 폐암 (A529), 간암 (HepG2) 세포주를 이용한 항암 활성을 MTT assay를 통해 확인하였다. SOCC를 사용하여 총 18개의 fraction으로 분획하였고 TLC와 세포주를 이용한 항암 활성 확인을 통하여 5개의 fraction으로 압축하였다.
- 본 연구에서의 지표물 질이 지용성 물질이라는 가정 하에 EtOAc 상분리 시 물층에 녹는 화합물이 섞일 것을 대비하여 비극성이 약한 n-BuOH를 사용하여 지용성 물질을 분획하였다(Kawagishi et al., 2007).
- 2 ml/min이었고, MS scan은 Positive ion mode로 하였다. 분자량 측정 범위는 150-1000 m/z이고, 각 분획물은 50% acetonitrile in water로 100배, 200배 희석하여 blank와 비교하였다.
- 25 mg/mL 농도에서 % inhibition을 측정하였고 2차 screening에서는 1차에서 선별된 시료에 대해 IC50값을 측정하였다. 세포주당 배양시간은 시료 처리 후 72시간이었으며 양성대조군으로는 대표적인 항암제로 알려져 있는 paclitaxel, 음성대조군은 증류수를 사용하였다.
- 연구에서는 꽃송이버섯 에탄올 추출물에 존재하는 다양한 지용성 화합물을 얻기 위해서 n-BuOH 층까지 상 분리 후 SOCC 분획을 실시하였다. 본 연구에서의 지표물 질이 지용성 물질이라는 가정 하에 EtOAc 상분리 시 물층에 녹는 화합물이 섞일 것을 대비하여 비극성이 약한 n-BuOH를 사용하여 지용성 물질을 분획하였다(Kawagishi et al.
- 위암 (AGS), 폐암 (A529), 간암 (HepG2) 등 3대암 세포에 대한 세포독성 여부를 % inhibition 또는 IC50값으로 확인 하였는데 1차 screening 시에는 0.25 mg/mL 농도에서 % inhibition을 측정하였고 2차 screening에서는 1차에서 선별된 시료에 대해 IC50값을 측정하였다.
- 꽃송이버섯 건조물 200 g을 80% 에탄올로 추출 하여 67 g의 추출물을 얻었다. 이 추출물을 다시 물층과 ethylacetate(EtOAc) 층으로 나누어 EtOAc 층을 12 g 회수하였으며 이를 다시 물층과 butanol 층으로 나누었고 이 butanol 층을 silica open comn chromatograpy(SOCC)를 이용하여 분획하였다. 초기에는 Fig.
- 1과 같이 12개의 fraction으로 분리하였으며 TLC 및 MTT assay를 사용하 여 5개의 fraction으로 조합하였다. 조합된 5개의 fraction을 감압농축기로 농축한 후 5개의 fraction을 High performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)를 통하여 분석하였다.
대상 데이터
- HPLC-MS는 Shimadzu(Japan)사의 LSMS-2020을 사용하였으며, formic acid, acetonitrile, water는 HPLC grade로 대정화금 (Korea)에서 구입하였다. 질량분석기의 조건은 Atlantis C18(2.
- TLC plate로는 silica 60(Merck)이 코팅된 aluminium sheets, 발색시약으로는 5% H2SO4 in ρ-anisaldehyde solution(Sigma)를 사용하였다.
- 세포 배양 배지로는 10% fetal bovine serum, 100 units/ml penicillin과 100 mg/ml streptomycin을 함유하는 Dulbeccos Modified Eagles Medium(DMEM) 배지를 사용하였고 37℃ humidified air/CO2 조건하의 incubator에서 배양하였다.
- 실험에 사용한 꽃송이버섯은 화순군 소재 백아산 꽃송이 농장에서 제공 받았으며, 자연건조 후 분말 형태로 만들어서 사용하였다. 실험에 사용한 ethanol과 ethylacetate, buthanol, hexane, methanol은 Sigma(USA) 사에서 구입하였고 Silica gel(230~400 mesh)은 Oci(Korea)에서 구입하였다. 꽃송이버섯 건조물 200 g을 80% 에탄올로 추출 하여 67 g의 추출물을 얻었다.
- 실험에 사용한 꽃송이버섯은 화순군 소재 백아산 꽃송이 농장에서 제공 받았으며, 자연건조 후 분말 형태로 만들어서 사용하였다. 실험에 사용한 ethanol과 ethylacetate, buthanol, hexane, methanol은 Sigma(USA) 사에서 구입하였고 Silica gel(230~400 mesh)은 Oci(Korea)에서 구입하였다.
- TLC plate로는 silica 60(Merck)이 코팅된 aluminium sheets, 발색시약으로는 5% H2SO4 in ρ-anisaldehyde solution(Sigma)를 사용하였다. 전개 용매는 hexane:ethyl acetate(5:5, v/v), methanol:water(5:5, v/v) 비율로 사용하였다. 전체 전개 길이는 7 cm이었고, 전개가 완료되면 실온에서 건조 후 5% H2SO4 in ρ-anisaldehyde solution(Sigma)으로 발색시키고 100℃에서 건조하였다.
- 질량분석기의 조건은 Atlantis C18(2.1×150 mm, 3 µm particle size) 컬럼을 사용하였고, 이동상으로 0.05% formic acid in water:acetonitrile(6:4, v/v)을 사용하였다.
- 항암 활성 측정을 위하여 AGS, A529, HepG2 세포주를 사용하였다. 세포 배양 배지로는 10% fetal bovine serum, 100 units/ml penicillin과 100 mg/ml streptomycin을 함유하는 Dulbeccos Modified Eagles Medium(DMEM) 배지를 사용하였고 37℃ humidified air/CO2 조건하의 incubator에서 배양하였다.
이론/모형
- 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylradical(DPPH, Sigma)과 양성대조군으로 토코페롤(αtocopherol, Sigma)을 사용하였으며, UV-spectrophotometer는 Sinco사의 S-3100 모델을 사용하였다.
- 꽃송이버섯 컬럼 분획물 5종의 항산화 활성을 DPPH 방법으로 측정하였으며, 토코페롤(α-tocopherol)을 이용하여 보정곡선을 만들고 측정하였다.
성능/효과
- 12개의 분획물에서의 TLC 결과 및 MTT assay 결과를 토대로 조합한 Fraction 5개의 샘플 중에서 유일하게 분석 할 수 있는 조건이 나타난 것은 Fraction 3번(Fr.3, 0.0804 g) 시료였다. Fr.
- 7분에 minor peak가 검출되었다. 7분에 검출된 major peak로 분자량 측정 결과 181.0 m/z ratio가 특징적으로 관찰되었고, 분자량 180.0인 물질이 존재할 것으로 사료된다. 10.
- 본 실험에서는 기존에 연구되어 있지 않은 꽃송이버섯 추출물의 지용성 물질에 대한 항산화 활성을 확인하고자 하였으며, 기준물질로 토코페롤(α-tocopherol)을 이용하여 보정곡선을 만들고 항산화 활성을 측정 하였다. TLC 결과에 의해 선택된 꽃송이버섯 컬럼 분획물 5종의 항산화 활성을 DPPH 방법으로 측정하였는데 지용성 물질 5개의 분획물 모두에서 DPPH 활성을 보이지 않는 것으로 보아 본 실험에서 사용한 꽃송이버섯 추출물의 지용성 물질은 폴리페놀성 화합물 및 항산화 활성을 갖지 않는 것으로 판단된다.
- , 2000). 이 같은 선행결과들은 본 실험 결과와 일치하였으며, 꽃송이버섯이 식용버섯뿐만 아니라 약용버섯으로서 암의 예방과 치료에 널리 사용될 수 있음을 시사한다.
- in ρanisaldehyde solution으로 발색하였다. 이 결과로 소수성 성분에 포함된 물질은 분자량 180 정도 크기의 small molecule일 가능성이 있을 것으로 판단되었다. 기존 연구에서는 꽃송이버섯 수용액 층에서 수용성인 benzoic acid(분자량 122.
- 값이 낮았으며, 간암의 경우는 A7이, 위암의 경우에는 A7, A8, A11의 수치가 낮았다. 전체적으로 보았을 때, 꽃송이버섯 추출물은 양성대조군인 paclitaxel보다 낮은 세포 생존율을 보였다. 꽃송이버섯 추출물이 암세포의 성장을 억제 하는지 확인하기 위해 in vivo에서 암을 잘 유발한다고 알려진 murine B16F10 melanoma 세포를 C57BL/6J mouse의 복강에 주사하여 암을 발생시켜 꽃송이버섯 추출물을 21동안 식이 하였을 때 꽃송이버섯 추출물을 먹인 mouse의 경우 tumor의 volume이 증가하지 않음을 통해 항암 활성을 확인 하였으며(Kim et al.
- 폐암 세포주인 A529 cell 의 세포독성 평가에서는 꽃송이버섯 추출물 12가지 분획물중 A2, A3, A4, A6, A7, A8, A9, A10의 경우가 IC50값이 낮았으며, 간암의 경우는 A7이, 위암의 경우에는 A7, A8, A11의 수치가 낮았다. 전체적으로 보았을 때, 꽃송이버섯 추출물은 양성대조군인 paclitaxel보다 낮은 세포 생존율을 보였다.
후속연구
- 본 연구에서 발견된 분자량 181의 물질은 항산화활성이 발견되지 않는 것으로 보았을 때 기존에 알려진 benzoic acid 유도체와는 다른 물질일 것으로 예측되며, 좀 더 자세한 MS/MS 분석과 IR, NMR 분석을 통해 구조식을 밝혀야 할 것으로 판단된다.
- 0의 분자량을 가진 물질이 지표물질로 확인되었으므로 이 물질의 화학식 동정을 위하여 추가실험이 필요하다. 세포주를 이용한 항암실험 결과 꽃송이버섯 추출물은 위암 (AGS), 폐암 (A529), 간암 (HepG2) 세포주 모두에서 양성대조군인 paclitaxel보다 낮은 세포 생존율을 보여 주었으며(IC50 value), 이것은 추후 꽃송이버섯 추출물에 포함된 항암 물질 분리 연구를 위한 기초연구 결과로서 무척 의미가 크다고 할 수 있다.
- SOCC를 사용하여 총 18개의 fraction으로 분획하였고 TLC와 세포주를 이용한 항암 활성 확인을 통하여 5개의 fraction으로 압축하였다. 항암 활성이 높은 5개의 fraction은 HPLC-MS를 통해 각 분획물을 분석한 결과 항산화 활성을 보이지 않았으며 약 181.0의 분자량을 가진 물질이 지표물질로 확인되었으므로 이 물질의 화학식 동정을 위하여 추가실험이 필요하다. 세포주를 이용한 항암실험 결과 꽃송이버섯 추출물은 위암 (AGS), 폐암 (A529), 간암 (HepG2) 세포주 모두에서 양성대조군인 paclitaxel보다 낮은 세포 생존율을 보여 주었으며(IC50 value), 이것은 추후 꽃송이버섯 추출물에 포함된 항암 물질 분리 연구를 위한 기초연구 결과로서 무척 의미가 크다고 할 수 있다.
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