본 연구에서는 버섯추출물 (42개)의 in vitro 항알레르기 효능탐색을 위해 랫드비만세포 (RBL-2H3 cell)에서 면역글로불린 (IgE)가 매개한 탈과립에 대한 저해 효과를 실험하였다. 이를 위해 anti-DNP IgE 및 DNP-HSA에 의해 알레르기반응이 유발된 랫드비만세포에서 버섯 추출물의 IL-4과 ${\beta}$-hexosaminidase 분비량에 대한 저해활성과 세포생존에 대한 영향이 분석되었다. 실험결과, IL-4 분비에 대해서는 팽이버섯 물추출물 등 5개의 버섯 추출물이 20% 이상의 우수한 저해효과를 나타내었으며, ${\beta}$-hexosaminidase 분비에 대해서는 영지버섯의 물추출물 등 8개의 버섯 추출물이 20% 이상의 비교적 우수한 저해활성을 나타내었다. 세포증식에 대해서는 잎새버섯의 물추출물등 대부분의 버섯 추출물이 우수한 세포증식효과를 나타내었다. 팽이버섯의 물추출물과 상황버섯의 물추출물은 ${\beta}$-hexosaminidase 및 IL-4 분비에 대해 모두 비교적 우수한 저해효과를 나타내었다. 추가로 2, 10, 50 ug/ml에서 실험된 영지버섯, 편각영지버섯, 눈꽃동충하초, 상황버섯 그리고 느타리버섯의 물추출물들은 ${\beta}$-hexosaminidase의 분비량을 농도-의존적으로 감소시켰다. 이상의 결과를 살펴볼때, 이들 in vitro 항알레르기 효과를 나타낸 버섯 추출물들은 추가실험을 통해 항알레르기 소재로의 활용성 검토가 필요하다고 사료되었다.
본 연구에서는 버섯추출물 (42개)의 in vitro 항알레르기 효능탐색을 위해 랫드비만세포 (RBL-2H3 cell)에서 면역글로불린 (IgE)가 매개한 탈과립에 대한 저해 효과를 실험하였다. 이를 위해 anti-DNP IgE 및 DNP-HSA에 의해 알레르기반응이 유발된 랫드비만세포에서 버섯 추출물의 IL-4과 ${\beta}$-hexosaminidase 분비량에 대한 저해활성과 세포생존에 대한 영향이 분석되었다. 실험결과, IL-4 분비에 대해서는 팽이버섯 물추출물 등 5개의 버섯 추출물이 20% 이상의 우수한 저해효과를 나타내었으며, ${\beta}$-hexosaminidase 분비에 대해서는 영지버섯의 물추출물 등 8개의 버섯 추출물이 20% 이상의 비교적 우수한 저해활성을 나타내었다. 세포증식에 대해서는 잎새버섯의 물추출물등 대부분의 버섯 추출물이 우수한 세포증식효과를 나타내었다. 팽이버섯의 물추출물과 상황버섯의 물추출물은 ${\beta}$-hexosaminidase 및 IL-4 분비에 대해 모두 비교적 우수한 저해효과를 나타내었다. 추가로 2, 10, 50 ug/ml에서 실험된 영지버섯, 편각영지버섯, 눈꽃동충하초, 상황버섯 그리고 느타리버섯의 물추출물들은 ${\beta}$-hexosaminidase의 분비량을 농도-의존적으로 감소시켰다. 이상의 결과를 살펴볼때, 이들 in vitro 항알레르기 효과를 나타낸 버섯 추출물들은 추가실험을 통해 항알레르기 소재로의 활용성 검토가 필요하다고 사료되었다.
For evaluating the anti-allergy activity of mushrooms, forty two mushroom extracts were studied their inhibitory activities on the IgE-mediated degranulation in rat basophilic leukemia cell line (RBL-2H3 cell). Effects of mushroom extracts on the release of interleukin-4 (IL-4) and beta-hexosaminida...
For evaluating the anti-allergy activity of mushrooms, forty two mushroom extracts were studied their inhibitory activities on the IgE-mediated degranulation in rat basophilic leukemia cell line (RBL-2H3 cell). Effects of mushroom extracts on the release of interleukin-4 (IL-4) and beta-hexosaminidase, and the cell viability of the IgE-sensitized were measured. From the analysis, five mushroom extracts such as the water extract from Flammulina velutipes (Curt.:Fr.) Sing showed the suppressive activities on IL-4 release as 20%. Eight extracts including the water extract of Ganoserma lucidum showed the suppressive activities on ${\beta}$-hexosaminidase release as 20%. Almost all of the extracts stimulated the proliferation of RBL-2H3 cell. The water extracts of Flammulina velutipes and Phellinus linteus were examined against the inhibitory activity in the production of IL-4 and ${\beta}$-hexosaminidase. Additionally, the extracts from Ganoserma lucidum, Isaria japonica, Phellinus linteus and Pleurotus ostreatus inhibited dose-dependently on ${\beta}$-hexosaminidase production. In conclusion, the result suggests that the mushrooms with the potent inhibitory efficacies on the degranulation of the mast cell would be candidate resources for the anti-allergy resources, and thus need to study for their utilization.
For evaluating the anti-allergy activity of mushrooms, forty two mushroom extracts were studied their inhibitory activities on the IgE-mediated degranulation in rat basophilic leukemia cell line (RBL-2H3 cell). Effects of mushroom extracts on the release of interleukin-4 (IL-4) and beta-hexosaminidase, and the cell viability of the IgE-sensitized were measured. From the analysis, five mushroom extracts such as the water extract from Flammulina velutipes (Curt.:Fr.) Sing showed the suppressive activities on IL-4 release as 20%. Eight extracts including the water extract of Ganoserma lucidum showed the suppressive activities on ${\beta}$-hexosaminidase release as 20%. Almost all of the extracts stimulated the proliferation of RBL-2H3 cell. The water extracts of Flammulina velutipes and Phellinus linteus were examined against the inhibitory activity in the production of IL-4 and ${\beta}$-hexosaminidase. Additionally, the extracts from Ganoserma lucidum, Isaria japonica, Phellinus linteus and Pleurotus ostreatus inhibited dose-dependently on ${\beta}$-hexosaminidase production. In conclusion, the result suggests that the mushrooms with the potent inhibitory efficacies on the degranulation of the mast cell would be candidate resources for the anti-allergy resources, and thus need to study for their utilization.
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문제 정의
본 연구에서는 버섯추출물 (42개)의 in vitro 항알레르기 효능탐색을 위해 랫드비만세포 (RBL-2H3 cell)에서 면역글로불린 (IgE)가 매개한 탈과립에 대한 저해 효과를 실험하였다. 이를 위해 anti-DNP IgE 및 DNP-HSA에 의해 알레르기반응이 유발된 랫드비만세포에서 버섯 추출물의 IL-4과 β-hexosaminidase 분비량에 대한 저해활성과 세포생존에 대한 영향이 분석되었다.
연구에서는 버섯추출물이 가지는 항알레르기 활성의 평가를 위해 mast cell에서의 IL-4 생성에 대해 버섯추출물이 미치는 영향을 살펴보기 위해 42개의 버섯추출물을 탈과립을 유도한 랫드비만세포에 처리하고 IL-4의 생성에 미치는 영향을 검색하였다. 그 결과, 10 ug/ml의 처리농도에서 32개의 시료가 IL-4 방출을 저해하는 것으로 확인되었고, 나머지 10개 시료들은 효과가 확인되지 않았다.
이와 같은 취지에 따라 본 연구는 버섯추출물을 이용하여 in vitro 수준에서의 항알레르기 활성을 평가하고 유용한 후보 자원을 발굴하고자 수행하였다.
제안 방법
각 well에 chromogen TMB substrate solution을 100 ul 가한 후 실온, 암소에서 20 분간 배양하였다. 각 wells에 100 ul의 stop reagent를 가한 후 즉시 450 nm의 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였고, 표준곡선에 대비하여 결과를 산출하였다.
배양된 세포는 anti-DNP IgE로 처리한 후 100 ug/ml의 최종농도가 되도록 버섯 추출물 시료 및 음성대조군으로서 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 24시간 동안 처리하였다. 그 후 세포를 200 ug/ml의 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, USB, Cleveland, Ohio, USA)로 처리한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 3시간 동안 배양하였다.
버섯의 in vitro 항알레르기 활성을 검색하기에 앞서 버섯추출물 42개를 100 ug/ml의 농도로, anti-DNP IgE가 처리된 랫드비만세포 (RBL-2H3 cell)에 처리하여 세포에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과 Table 2에 나타낸 바와 같이 34개의 버섯추출물이 대조실험에 비하여 100%이상의 높은 세포증식율을 나타내었다.
이를 위해 anti-DNP IgE 및 DNP-HSA에 의해 알레르기반응이 유발된 랫드비만세포에서 버섯 추출물의 IL-4과 β-hexosaminidase 분비량에 대한 저해활성과 세포생존에 대한 영향이 분석되었다.
이상의 검색실험에서 저해율이 높은 시료에 대해서는 2, 10, 50 ug/ml 농도에서 β-hexosaminidase 저해활성을 추가로 분석함으로써 처리농도에 대한 버섯추출물의 β-hexosaminidase 저해능을 검정하였다.
탈과립반응으로 얻어진 대조 (blank), 각 표준물질 및 시료의 상등액 100 ul씩을 well에 가하고 50 ul의 1× biotinylated anti-IL-4를 가하였다.
대상 데이터
실험시료로 사용된 42개의 버섯 추출물 중에서 10 ug/ml의 농도에서 20% 이상의 비교적 우수한 β-hexosaminidase 저해활성을 나타낸 시료는 영지 (물추출물), 편각영지 (물추출물), 상황 (물추출물), 눈꽃동충 (물추출물), 느타리 (물추출물), 표고 (참송이, 물추출물), 팽이 (물추출물), 석이 (물추출물) 등 8개의 시료로서 각각 29.9 ± 1.9%, 28.4 ± 6.4%, 27.5 ± 4.2%, 23.6 ± 6.8%, 23.6 ± 1.3%, 23.0 ± 9.6%, 20.7 ± 5.1% 및 20.2 ± 1.0%의 값을 나타내었다.
실험에 사용된 rat mast cell인 RBL-2H3 세포주는 미국 균주보존협회 (ATCC)에서 분양받았으며, 96 well culture plate에 4×104 cells/well을 분주한 후 15% fetal bovine serum (FBS), 1% glutamax 및 antibiotics가 보충된 MEM media와 함께 37℃, 5% CO2 공기조건에서 배양하였다.
양송이 등 버섯시료는 연천군 소재 농가 (청산버섯)에서 구입하여 에탄올 및 물로서 상온에서 추출 및 여과한 후 상온에서 감압농축기를 사용하여 용매를 제거하였다. 버섯시료의 목록 및 추출조건은 Table 1에 명시하였다.
데이터처리
실험결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며 통계적 유의성은 Student’s t-test에 의해 분석하였다.
성능/효과
1). Fig 1.에 나타난 버섯 추출물들의 활성을 IC50 값으로 계산하였을 때, 편각영지버섯 (물추출물)이 18.67 ug/ml로 가장 우수하였으며, 영지버섯 (물추출물)이 20.16 ug/ml, 상황버섯 (물추출물)이 23.17 ug/ml 그리고 느타리버섯 (물추출물)이 34.04 ug/ml의 순으로 우수하였다.
버섯의 in vitro 항알레르기 활성을 검색하기에 앞서 버섯추출물 42개를 100 ug/ml의 농도로, anti-DNP IgE가 처리된 랫드비만세포 (RBL-2H3 cell)에 처리하여 세포에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과 Table 2에 나타낸 바와 같이 34개의 버섯추출물이 대조실험에 비하여 100%이상의 높은 세포증식율을 나타내었다. 특히, 잎새버섯 물추출물은 132.
연구에서는 버섯추출물이 가지는 항알레르기 활성의 평가를 위해 mast cell에서의 IL-4 생성에 대해 버섯추출물이 미치는 영향을 살펴보기 위해 42개의 버섯추출물을 탈과립을 유도한 랫드비만세포에 처리하고 IL-4의 생성에 미치는 영향을 검색하였다. 그 결과, 10 ug/ml의 처리농도에서 32개의 시료가 IL-4 방출을 저해하는 것으로 확인되었고, 나머지 10개 시료들은 효과가 확인되지 않았다. 또한, 32개의 IL-4 방출에 대한 저해효과가 있는 것으로 확인된 버섯추출물 중에서 20%이상의 비교적 높은 저해효과를 나타낸 시료에는 팽이버섯 (물추출물), 꽃송이버섯 (물추출물), 상황버섯 (물추출물), 노루궁뎅이버섯 (에탄올추출물), 분홍느타리버섯 (물추출물) 등으로서 각각 30.
그리고, 이들 버섯추출물 중 높은 저해율을 보인 상위 5개의 버섯추출물에 대해서는 2, 10, 50 ug/ml 농도에서 β-hexosaminidase 저해활성을 추가로 분석한 결과, 실험된 5개의 버섯추출물들은 모두 농도-의존적이고도 유의하게β-hexosaminidase 방출을 저해함을 확인할 수 있었다 (Fig. 1).
또한, 32개의 IL-4 방출에 대한 저해효과가 있는 것으로 확인된 버섯추출물 중에서 20%이상의 비교적 높은 저해효과를 나타낸 시료에는 팽이버섯 (물추출물), 꽃송이버섯 (물추출물), 상황버섯 (물추출물), 노루궁뎅이버섯 (에탄올추출물), 분홍느타리버섯 (물추출물) 등으로서 각각 30.7 ± 2.4%, 24.5 ± 1.6%, 22.8 ± 2.4%, 21.1 ± 6.4% 및 21.1 ± 1.6%의 저해효과를 확인할 수 있었다.
이처럼 버섯추출물이 탈과립을 유도한 RBL-2H3 세포에서 β-hexosaminidase 방출, IL-4 생성 및 세포증식에 대해 미치는 영향을 살펴본 결과 대부분의 버섯추출물이 RBL-2H3 세포의 증식을 높여주는 것을 알 수 있었다. 또한, beta-hexosaminidase 방출에 높은 저해활성을 보인 버섯 추출물들과 IL-4 생성에 대하여 저해활성이 우수한 버섯추출물과는 대체적으로 상이한 것을 알 수 있다. 이들 단일 실험항목에서 우수한 효과를 나타낸 버섯시료들에 대한 추가연구를 통해 항알레르기 효과를 보유한 보다 유용한 자원의 발굴이 필요할 것으로 사료된다.
또한, 실험된 항목들에 걸쳐 고르게 우수한 결과를 나타낸 시료에 팽이버섯의 물추출물과 상황버섯의 물추출물이 있었는데, 이들 두 버섯시료는 beta-hexosaminidase 방출 저해능 (20.7 ± 5.1% 및 27.5 ± 4.2%)과 IL-4 생성 저해능 (30.7 ± 2.4% 및 22.8 ± 2.4%)이 모두 비교적 높은 저해활성을 보이면서 세포증식율 (106.8 ± 8.6% 및 110.8 ± 8.1%)도 높아 항알레르기 소재로의 활용 가능성이 높은 버섯자원으로 사료되었다.
실험결과, IL-4 분비에 대해서는 팽이버섯 물추출물 등 5개의 버섯 추출물이 20% 이상의 우수한 저해효과를 나타내었으며, β-hexosaminidase 분비에 대해서는 영지버섯의 물추출물 등 8개의 버섯 추출물이 20% 이상의 비교적 우수한 저해활성을 나타내었다.
이처럼 버섯추출물이 탈과립을 유도한 RBL-2H3 세포에서 β-hexosaminidase 방출, IL-4 생성 및 세포증식에 대해 미치는 영향을 살펴본 결과 대부분의 버섯추출물이 RBL-2H3 세포의 증식을 높여주는 것을 알 수 있었다.
추가로 2, 10, 50 ug/ml에서 실험된 영지버섯, 편각영지버섯, 눈꽃동충하초, 상황버섯 그리고 느타리버섯의 물추출물들은 β-hexosaminidase의 분비량을 농도-의존적으로 감소시켰다.
특히, 잎새버섯 물추출물은 132.3 ± 12.9%로 가장 높은 세포증식율을 보였으며 이외에도 표고버섯 (참송이, 물추출물), 왕송이버섯 (물추출물), 양송이버섯 (물추출물), 차가버섯 (물추출물), 새송이버섯 (물추출물), 편각영지버섯 (물추출물), 눈꽃동충하초 (물추출물) 및 노랑느타리버섯 (물추출물)은 120% 이상의 높은 세포증식율을 나타내었다.
팽이버섯의 물추출물과 상황버섯의 물추출물은 β-hexosaminidase 및 IL-4 분비에 대해 모두 비교적 우수한 저해효과를 나타내었다.
한편, 느티만가닥버섯 (에탄올추출물), 눈꽃동충하초버섯 (에탄올추출물), 분홍느타리버섯 (물추출물), 표고버섯 (참송이, 에탄올추출물), 녹각영지 (물추출물), 표고버섯 (에탄올추출물), 노루궁뎅이버섯 (에탄올추출물), 영지버섯 (에탄올 추출물) 등 8개의 추출물은 81.1 ± 3.6~98.9~10.9%의 다소 낮은 세포증식율을 보였다.
후속연구
버섯은 한반도에 5,000여종이 자생하는 것으로 추정되며 1,500여종이 보고되어 있고, 식용 가능한 버섯은 350여종, 독버섯은 90여종으로 알려져 있으며, 최근 들어 버섯의 기능성식품으로서 우수한 효능이 밝혀지고 있어(Kim et al., 2008) 버섯자원의 항알레르기 소재로의 활용 가능성을 검토하기 위한 탐색 연구가 필요하다.
또한, beta-hexosaminidase 방출에 높은 저해활성을 보인 버섯 추출물들과 IL-4 생성에 대하여 저해활성이 우수한 버섯추출물과는 대체적으로 상이한 것을 알 수 있다. 이들 단일 실험항목에서 우수한 효과를 나타낸 버섯시료들에 대한 추가연구를 통해 항알레르기 효과를 보유한 보다 유용한 자원의 발굴이 필요할 것으로 사료된다.
9%의 다소 낮은 세포증식율을 보였다. 이러한 결과를 보면 실험에 사용된 버섯 중에서 낮은 세포증식율을 나타낸 것은 물추출물보다는 에탄올추출물인 경우가 좀 더 많은 것을 알 수 있었으므로 건강기능식품 등 버섯을 산업화 소재로 활용 시 이러한 추출용매의 특성을 고려할 필요가 있다고 사료되었다.
이러한 연구결과와 논문검색결과를 종합할 때, β-hexosaminidase 방출 또는 IL-4 생성에 대해 우수한 활성을 나타낸 팽이버섯 등 우수한 저해효과를 나타낸 버섯들에 대한 추가연구가 필요할 것으로 사료되었다.
추가로 2, 10, 50 ug/ml에서 실험된 영지버섯, 편각영지버섯, 눈꽃동충하초, 상황버섯 그리고 느타리버섯의 물추출물들은 β-hexosaminidase의 분비량을 농도-의존적으로 감소시켰다. 이상의 결과를 살펴볼 때, 이들 in vitro 항알레르기 효과를 나타낸 버섯 추출물들은 추가실험을 통해 항알레르기 소재로의 활용성 검토가 필요하다고 사료되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
알레르기 반응은 어떤 경우를 말하는가?
면역은 외래물질에 대해 나타내는 집합적이고 조화로운 생체의 반응을 말하며, 건강한 사람에게는 무해한 주변 환경의 일부 물질에 대해 일부 사람은 민감한 반응을 나타내는 경우 알레르기 반응이라고 한다. 알레르기 반응은 면역글로블린 E (IgE)의 생성과 관련되며 감염성 병원체를 제거하기 위해 면역기전이 발생할 때 그 시작과 진행이 비정상적이며, 면역계에는 많은 피드백 경로가 있어 일단 병리학적인 면역반응이 시작되면 조절과 종료가 어렵고 만성적이고 진행성이 되는 경향이 있다.
알레르기성 질환 중 즉시형 과민반응질환은 어떤것들이 있는가?
알레르기 반응은 면역글로블린 E (IgE)의 생성과 관련되며 감염성 병원체를 제거하기 위해 면역기전이 발생할 때 그 시작과 진행이 비정상적이며, 면역계에는 많은 피드백 경로가 있어 일단 병리학적인 면역반응이 시작되면 조절과 종료가 어렵고 만성적이고 진행성이 되는 경향이 있다. 또한, 알레르기 반응은 정상적인 항원에 대해 수 분 내에 시작되고 병리적 결과를 수반하는 즉시형 과민증과 좀 더 천천히 진행되어 염증성을 띠는 지연형 과민증이 있으며, 사람에서의 즉시형 과민반응질환에는 전신 아나필락시스, 기관지 천식, 알레르기 비염, 음식물 알레르기, 피부 알레르기 등이 있다 (Owen et al,, 2014; Abbas et al., 2012).
면역이란 무엇인가?
면역은 외래물질에 대해 나타내는 집합적이고 조화로운 생체의 반응을 말하며, 건강한 사람에게는 무해한 주변 환경의 일부 물질에 대해 일부 사람은 민감한 반응을 나타내는 경우 알레르기 반응이라고 한다. 알레르기 반응은 면역글로블린 E (IgE)의 생성과 관련되며 감염성 병원체를 제거하기 위해 면역기전이 발생할 때 그 시작과 진행이 비정상적이며, 면역계에는 많은 피드백 경로가 있어 일단 병리학적인 면역반응이 시작되면 조절과 종료가 어렵고 만성적이고 진행성이 되는 경향이 있다.
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