북방전복 (Haliotis discus hannai)의 선발육종 연구를 위한 microsatellite multiplex PCR법 개발 Microsatellite multiplex PCR method for selective breeding studies in Pacific abalone (Haliotis discus hannai)원문보기
북방전복 선발육종에 필요한 친자확인 및 가계분석을 효율적으로 실험하기 위하여 microsatellite multiplex PCR 기술을 개발하였다. 개발한 mutiplex PCR 기술은 6개 microsatellite locus Hdh145, Hdh512, Hdh1321, Awb017, Awb083 및 Awb098을 한번의 PCR 증폭으로 다중분석이 가능하다. 이 기술은 높은 친자확인 성공률과 가계분석에 있어서도 모두 멘델의 분리법칙을 따르고 있다. 더욱이 대량의 시료처리를 필요로 하는 경우에 있어서도 시간절약 및 비용 절감뿐만 아니라 샘플 처리과정의 간소화가 가능하여 handling errors를 줄일 수 있다. 따라서 본 연구에서 개발된 multiplex PCR은 친자확인, 가계분석, 집단유전학 및 계통분류학 분석에 유용하게 사용할 수 있을 것이라 생각된다.
북방전복 선발육종에 필요한 친자확인 및 가계분석을 효율적으로 실험하기 위하여 microsatellite multiplex PCR 기술을 개발하였다. 개발한 mutiplex PCR 기술은 6개 microsatellite locus Hdh145, Hdh512, Hdh1321, Awb017, Awb083 및 Awb098을 한번의 PCR 증폭으로 다중분석이 가능하다. 이 기술은 높은 친자확인 성공률과 가계분석에 있어서도 모두 멘델의 분리법칙을 따르고 있다. 더욱이 대량의 시료처리를 필요로 하는 경우에 있어서도 시간절약 및 비용 절감뿐만 아니라 샘플 처리과정의 간소화가 가능하여 handling errors를 줄일 수 있다. 따라서 본 연구에서 개발된 multiplex PCR은 친자확인, 가계분석, 집단유전학 및 계통분류학 분석에 유용하게 사용할 수 있을 것이라 생각된다.
The multiplex PCR system including six microsatellites from Haliotis discus hannai, consisting of dinucleotide and trinucleotide repeat units, is developed. The six loci were coamplified in a single reaction employing dye-labeled primers. Alleles from these loci were sized using an internal standard...
The multiplex PCR system including six microsatellites from Haliotis discus hannai, consisting of dinucleotide and trinucleotide repeat units, is developed. The six loci were coamplified in a single reaction employing dye-labeled primers. Alleles from these loci were sized using an internal standard by automated sample processing in an ABI3100 Genetic Analyser. Amplified alleles in profiles containing selected microsatellites were typed clearly, providing easily interpretable results. In this results suggest that the presented multiplex PCR system may be a useful tool in a selective breeding program of H. discus hannai in which genetic identification will allow different genotypes to be reared together from fertilization. This should have a great impact as it will make selective breeding more efficient. Moreover, it will be useful in a variety of applications, including strain and hybrid identification, parentage assignment, pedigree reconstruction, estimating genetic diversity and/or inbreeding.
The multiplex PCR system including six microsatellites from Haliotis discus hannai, consisting of dinucleotide and trinucleotide repeat units, is developed. The six loci were coamplified in a single reaction employing dye-labeled primers. Alleles from these loci were sized using an internal standard by automated sample processing in an ABI3100 Genetic Analyser. Amplified alleles in profiles containing selected microsatellites were typed clearly, providing easily interpretable results. In this results suggest that the presented multiplex PCR system may be a useful tool in a selective breeding program of H. discus hannai in which genetic identification will allow different genotypes to be reared together from fertilization. This should have a great impact as it will make selective breeding more efficient. Moreover, it will be useful in a variety of applications, including strain and hybrid identification, parentage assignment, pedigree reconstruction, estimating genetic diversity and/or inbreeding.
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문제 정의
양식생물의 사육관리 및 혈통에 대한 평가를 위하여 필요한 친자확인 및 가계추적 등에 가장 적합한 유전표식으로 microsatellite DNA가 알려져 있다 (Goldstein and Schlotterer, 1999). 본 연구에서 북방전복의 육종연구 및 유전학적 연구를 위하여 6개의 microsatellite multiplex PCR 법 개발과 그 유용성을 검토하였다. 그 결과 microsatellite multiplex PCR 기술은 시간절약 및 비용 절감뿐만 아니라 대량의 샘플을 처리할 경우 실험과정의 간소화가 가능하여 handling errors를 줄일 수 있었다.
본 연구에서는 북방전복의 유전학적 연구의 효율적인 분석을 위하여 한번의 PCR (Polymerase Chain Reaction) 증폭으로 다수의 microsatellite 유전표식에 대한 다중분석을 가능 하게 하는 multiplex PCR법을 개발하여 실험비용 절감 및 시간절약을 목적으로 하였다.
제안 방법
, 2005) 를 선택하였다. 12 microsatellite locus에 대한 PCR 증폭은 킬레이팅 수지법으로 얻어진 DNA 시료 10 ng, 10 mM Tris-Hcl (pH 8.8), 0.1% Triton X-100, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 U f-Taq DNA polymerase (Solgent), 0.5 pmol microsatellite primer pairs를 혼합하여 사용하였으며, PTC-200 Thermocylcer (MJ Research, Waltham, MA, USA) 를 이용하여 95℃에서 10분간 initial denaturation 시킨 후, 95℃에 20초, 55℃에 30초, 72℃에 1분으로 35 cycle 반응시킨 다음 72℃에 30분간 final extension시켜 PCR 반응을 마쳤다.
12개의 microsatellite locus의 증폭범위를 확인하고 증폭 범위의 중복유무에 따라 Applied Biosystems (ABI) 의 3가지 형광표식 (6-FAM, HEX and NED) 을 붙였다.
6개의 microsatellite locus를 이용한 multiplex PCR의 유용성을 검토하기 위하여 20가계를 부화유생단계부터 10개월간 혼합사육한 북방전복 치패 500마리에 대한 친자확인 및 가계분석을 실시하였다. 그 결과 Table 3에 나타낸 것과 같이각 유전표식에 따른 친자확인 성공률은 Hdh1321 25.
즉, 증폭범위가 중복되지 않는 것을 기준으로 Hdh145, Hdh074, Awb083는 HEX fluorescent dye를 붙였으며, Hdh512, Afa017, Awb017, Awb063는 6-FAM fluorescent dye를 붙였고, Hdh1321, Awb019, Awb035, Awb098, Awb101는 NED fluorescent dye를 붙였다. Multiplex PCR 조건검토는 12개 locus의 크로스체킹 방법으로 실시하였다. 그 결과 12개 후보 microsatellite locus 중 6개 locus Hdh145, Hdh512, Hdh1321, Awb017, Awb083및 Awb098의 조합이 최적 조건임을 확인하였다.
PCR에 의해 증폭된 microsatellite DNA 단편은 size standard로 GeneScan 400HD ROX (ABI, USA), HiDi formamide와 혼합한 후 유전자형 분석기 (3100 genetic analyzer; ABI, USA) 를 통하여 분석을 하였으며 분석 후에나타난 피크 정보를 GeneMapper v3.7 software를 이용하여 유전자형을 분석하여 각 microsatellite locus의 증폭범위를 확인하였다.
multiplex PCR의 유용성을 검토하기 위하여 20가계를 부 화유생단계에서 10개월간 혼합사육한 북방전복 치패 500마리를 대상으로 친자확인 및 가계분석을 실시하였다. 친자확인은 개발된 multiplex PCR을 이용하여 얻어진 유전자형을 PAPA 2.
multiplex design을 위하여 기본적으로 증폭범위가 중복되지 않은 locus는 같은 fluorescent dye를 사용하였으며, 반면에 같은 증폭범위를 나타낸 locus는 서로 다른 fluorescent dye 를 사용하여 실험하였다.
최적의 multiplex PCR 조건의 검토를 위하여 서로 다른 증폭범위의 microsatellite locus를 기준으로 8개의 primer pairs를 혼합하여 PCR 조건을 검토하였으며, 조건검토 시 증폭이 불안정하거나 증폭하지 않는 것은 제거하고 같은 증폭범위의 다른 primer pairs를 추가하여 분석하는 크로스체킹 방법으로 실험을 실시하였다. 또한 PCR 증폭온도, 각 primer pairs 간의 상호작용에 따른 정량조절을 실시하였다.
북방전복 선발육종에 필요한 친자확인 및 가계분석을 효율적으로 실험하기 위하여 microsatellite multiplex PCR 기술을 개발하였다. 개발한 mutiplex PCR 기술은 6개 microsatellite locus Hdh145, Hdh512, Hdh1321, Awb017, Awb083 및 Awb098을 한번의 PCR 증폭으로 다중분석이 가능하다.
이중 다른 locus의 증폭범위와 중복되지 않고 가장 낮은 사이즈를 나타낸 것은 Hdh512였으며 가장 큰 사이즈를 나타낸 것은 Hdh1321이었다. 이렇게 중복되지 않은 2개의 locus를 기준으로 multiplex design 작업을 수행 하였다. 우선, 12개 locus 증폭범위의 중복유무에 따라 Table 2에 나타낸 것과 같이 3가지의 fluorescent dye (HEX, 6-FAM, NED) 를 붙였다.
최적의 multiplex PCR 조건을 찾기 위하여 12개 microsatellite locus를 이용하여 각각의 증폭범위 및 유전적 특성을 확인하였다. 그 결과 Table 2에 나타낸 것과 같이 증폭 범위의 경우 Hdh145는 132-142 bp, Hdh512는 87-139 bp, Hdh1321는 261-371 bp, Afa017는 161-247 bp, Awb017는 205-249 bp, Awb019는 174-258 bp, Awb035는 153-217 bp, Awb063는 140-272 bp, Awb074는 154-260 bp, Awb083는 213-255 bp, Awb098는 167-189 bp, Awb101는 113-211 bp로 나타났으며, 대립유전자수는 Hdh1321이 35개로 가장 많았으며 Hdh145 및 Awb083이 7개로 가장 적은 것으로 나타났다.
최적의 multiplex PCR 조건의 검토를 위하여 서로 다른 증폭범위의 microsatellite locus를 기준으로 8개의 primer pairs를 혼합하여 PCR 조건을 검토하였으며, 조건검토 시 증폭이 불안정하거나 증폭하지 않는 것은 제거하고 같은 증폭범위의 다른 primer pairs를 추가하여 분석하는 크로스체킹 방법으로 실험을 실시하였다. 또한 PCR 증폭온도, 각 primer pairs 간의 상호작용에 따른 정량조절을 실시하였다.
대상 데이터
Multiplex PCR 디자인을 위하여 Table 1에 나타낸 12개 microsatellite locus (Park et al., 2003; Li et al., 2002; Sekino et al., 2005) 를 선택하였다. 12 microsatellite locus에 대한 PCR 증폭은 킬레이팅 수지법으로 얻어진 DNA 시료 10 ng, 10 mM Tris-Hcl (pH 8.
Multiplex PCR법 개발을 위하여 사용한 북방전복 시료는 2009년 9월 경남 거제도 남부면 다포리 어촌계 해녀들이 채취한 자연산 전복으로 총 77마리이며 평균 각장 88.91 mm, 평균 각폭 60.72 mm, 평균 중량 77.45 g 이다. 개발한 multiplex PCR 방법에 따른 친자확인 유용성을 확인하기 위하여 2010년 1:1 인공수정으로 20가계를 생산하여 유생단계부터 12개월간 혼합 사육관리한 북방전복 치패 500마리 (평균 각장 : 41.
45 g 이다. 개발한 multiplex PCR 방법에 따른 친자확인 유용성을 확인하기 위하여 2010년 1:1 인공수정으로 20가계를 생산하여 유생단계부터 12개월간 혼합 사육관리한 북방전복 치패 500마리 (평균 각장 : 41.5 mm) 를 무작위로 선택하여 분석에 사용하였다.
이렇게 중복되지 않은 2개의 locus를 기준으로 multiplex design 작업을 수행 하였다. 우선, 12개 locus 증폭범위의 중복유무에 따라 Table 2에 나타낸 것과 같이 3가지의 fluorescent dye (HEX, 6-FAM, NED) 를 붙였다. 즉, 증폭범위가 중복되지 않는 것을 기준으로 Hdh145, Hdh074, Awb083는 HEX fluorescent dye를 붙였으며, Hdh512, Afa017, Awb017, Awb063는 6-FAM fluorescent dye를 붙였고, Hdh1321, Awb019, Awb035, Awb098, Awb101는 NED fluorescent dye를 붙였다.
데이터처리
친자확인은 개발된 multiplex PCR을 이용하여 얻어진 유전자형을 PAPA 2.0 (Package for the Analysis of Parental Allocation) 프로그램을 이용하여 결과를 얻었으며, 가계분석은 멘델의 분리비에 따른 관찰치와 기대치 간에 χ2-test에 의한 유의차의 유무로 검토하였다.
이론/모형
시료의 total genomic DNA는 전복 외투막의 조직 일부를 절제하여 킬레이팅 수지법 (chelating resin method; Walsh et al., 1991; Suenaga and Nakamura, 2005) 을 이용하여 추출하였다.
성능/효과
그 결과 Table 2에 나타낸 것과 같이 증폭 범위의 경우 Hdh145는 132-142 bp, Hdh512는 87-139 bp, Hdh1321는 261-371 bp, Afa017는 161-247 bp, Awb017는 205-249 bp, Awb019는 174-258 bp, Awb035는 153-217 bp, Awb063는 140-272 bp, Awb074는 154-260 bp, Awb083는 213-255 bp, Awb098는 167-189 bp, Awb101는 113-211 bp로 나타났으며, 대립유전자수는 Hdh1321이 35개로 가장 많았으며 Hdh145 및 Awb083이 7개로 가장 적은 것으로 나타났다. 12개 locus에 대한 관찰치이형접합율 (observed heterozygosity) 의 범위는 0.219-0.915이며, 기대치 이형접합율 (expected heterozygosity) 의 범위는 0.696-0.961로 높게 나타났다.
북방전복 선발육종에 필요한 친자확인 및 가계분석을 효율적으로 실험하기 위하여 microsatellite multiplex PCR 기술을 개발하였다. 개발한 mutiplex PCR 기술은 6개 microsatellite locus Hdh145, Hdh512, Hdh1321, Awb017, Awb083 및 Awb098을 한번의 PCR 증폭으로 다중분석이 가능하다. 이 기술은 높은 친자확인 성공률과 가계분석에 있어서도 모두 멘델의 분리법칙을 따르고 있다.
Multiplex PCR 조건검토는 12개 locus의 크로스체킹 방법으로 실시하였다. 그 결과 12개 후보 microsatellite locus 중 6개 locus Hdh145, Hdh512, Hdh1321, Awb017, Awb083및 Awb098의 조합이 최적 조건임을 확인하였다. 나머지 6개 locus Afa017, Awb019, Awb035, Awb063, Awb074 및 Awb101은 증폭이 불안정하거나 다른 locus의 증폭에 상호간섭 등의 영향으로 제외하였다.
최적의 multiplex PCR 조건을 찾기 위하여 12개 microsatellite locus를 이용하여 각각의 증폭범위 및 유전적 특성을 확인하였다. 그 결과 Table 2에 나타낸 것과 같이 증폭 범위의 경우 Hdh145는 132-142 bp, Hdh512는 87-139 bp, Hdh1321는 261-371 bp, Afa017는 161-247 bp, Awb017는 205-249 bp, Awb019는 174-258 bp, Awb035는 153-217 bp, Awb063는 140-272 bp, Awb074는 154-260 bp, Awb083는 213-255 bp, Awb098는 167-189 bp, Awb101는 113-211 bp로 나타났으며, 대립유전자수는 Hdh1321이 35개로 가장 많았으며 Hdh145 및 Awb083이 7개로 가장 적은 것으로 나타났다. 12개 locus에 대한 관찰치이형접합율 (observed heterozygosity) 의 범위는 0.
6개의 microsatellite locus를 이용한 multiplex PCR의 유용성을 검토하기 위하여 20가계를 부화유생단계부터 10개월간 혼합사육한 북방전복 치패 500마리에 대한 친자확인 및 가계분석을 실시하였다. 그 결과 Table 3에 나타낸 것과 같이각 유전표식에 따른 친자확인 성공률은 Hdh1321 25.7%, Hdh512 19.4%, Awb017 11.4%, Hdh145 5.5%, Awb0986.3%, Awb083의 2.5% 순으로 나타났다. 또한 높은 친자확인 성공률 순으로 유전표식을 조합하여 분석한 결과 Hdh1321와 Hdh512의 2개조합은 45.
본 연구에서 북방전복의 육종연구 및 유전학적 연구를 위하여 6개의 microsatellite multiplex PCR 법 개발과 그 유용성을 검토하였다. 그 결과 microsatellite multiplex PCR 기술은 시간절약 및 비용 절감뿐만 아니라 대량의 샘플을 처리할 경우 실험과정의 간소화가 가능하여 handling errors를 줄일 수 있었다. 또한, 선택된 6개의 microsatellite locus는 multiplex PCR로 genotyping 분석 시에 명확한 대립유전자 pattern을 나타내고 있어 친자확인 분석시 높은 성공률을 나타내었으며, 가계분석에 있어서도 6개 locus 모두 멘델의 분리법칙을 따르고 있었다.
4%, 6개조합 (Hdh1321, Hdh512, Awb017, Hdh145, Awb098, Awb083) 의 경우 100%의 친자확인 성공률을 나타내었다. 또한 20가계에 대한 가계분석을 위하여 6개의 microsatellite locus에 대한 멘델의 분리비를 분석한 결과, 대부분의 가계는 어미의 유전자형에 대한 관찰치와 기대치가 일치하였다 (Appendix I). 일부 χ2-test에 의한 유의차를 나타내는 가계가 존재하였으나 가계당 분석개체수가 50개체 미만으로 분석개체 수에 따른 유출오차로 추정된다.
5% 순으로 나타났다. 또한 높은 친자확인 성공률 순으로 유전표식을 조합하여 분석한 결과 Hdh1321와 Hdh512의 2개조합은 45.5%, 3개 조합 (Hdh1321, Hdh512, Awb017) 의 경우 78.2%, 4개조합 (Hdh1321, Hdh512, Awb017, Hdh145) 의 경우 88.9%, 5개조합 (Hdh1321, Hdh512, Awb017, Hdh145, Awb098) 의 경우 99.4%, 6개조합 (Hdh1321, Hdh512, Awb017, Hdh145, Awb098, Awb083) 의 경우 100%의 친자확인 성공률을 나타내었다. 또한 20가계에 대한 가계분석을 위하여 6개의 microsatellite locus에 대한 멘델의 분리비를 분석한 결과, 대부분의 가계는 어미의 유전자형에 대한 관찰치와 기대치가 일치하였다 (Appendix I).
그 결과 microsatellite multiplex PCR 기술은 시간절약 및 비용 절감뿐만 아니라 대량의 샘플을 처리할 경우 실험과정의 간소화가 가능하여 handling errors를 줄일 수 있었다. 또한, 선택된 6개의 microsatellite locus는 multiplex PCR로 genotyping 분석 시에 명확한 대립유전자 pattern을 나타내고 있어 친자확인 분석시 높은 성공률을 나타내었으며, 가계분석에 있어서도 6개 locus 모두 멘델의 분리법칙을 따르고 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 multiplex PCR법은 북방전복의 선발육종을 위한 친자확인 및 가계 분석에 매우 유용한 기술이며, 더욱이 집단유전학 및 계통분류학 분석에도 유용하게 사용할 수 있을 것이라 생각된다.
그러므로 최근 선발 육종 연구에서는 가능한 생물 초기단계인 수정난 또는 유생단계부터 혼합사육하여 환경적 효과를 최소화 하고 있으며, DNA를 이용한 친자확인기술을 통하여 가계 및 개체를 식별하여 유전능력평가를 실시하고 있다. 이러한 선발육종 방법은 개체 및 가계 식별이 불가능하여 가계 분리사육을 통해 유전능력평가를 실시했던 기존의 결과보다 정확하여 높은 육종효율의 결과를 얻을 수 있으며 높은 선발강도를 제공할 수 있다.
후속연구
또한, 선택된 6개의 microsatellite locus는 multiplex PCR로 genotyping 분석 시에 명확한 대립유전자 pattern을 나타내고 있어 친자확인 분석시 높은 성공률을 나타내었으며, 가계분석에 있어서도 6개 locus 모두 멘델의 분리법칙을 따르고 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 multiplex PCR법은 북방전복의 선발육종을 위한 친자확인 및 가계 분석에 매우 유용한 기술이며, 더욱이 집단유전학 및 계통분류학 분석에도 유용하게 사용할 수 있을 것이라 생각된다.
더욱이 대량의 시료처리를 필요로 하는 경우에 있어서도 시간절약 및 비용 절감뿐만 아니라 샘플 처리과정의 간소화가 가능하여 handling errors를 줄일 수 있다. 따라서 본 연구에서 개발된 multiplex PCR은 친자확인, 가계분석, 집단유전학 및 계통분류학 분석에 유용하게 사용할 수 있을 것이라 생각된다.
Hara (1990) 는 북방전복 (Haliotis discus hannai) 의 선발육종을 위한 기초연구를 통하여 전복의 성장형질은 모패의 유전형질과 깊은 관계를 가지고 있다고 보고하였으며, Hara and Kikuchi (1992) 는 선발 2세대 18개월째 성장의 경우 대조구와 비교하여 2배 이상으로 성장이 향상되었다고 보고하였다. 이와 같이 북방전복은 선발을 통한 성장개선 효과가 높은 것으로 나타나 선발육종을 통하여 유전적으로 개량된 양식품종개발을 기대할 수 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
선발육종 기술이란 무엇인가?
선발육종 기술은 양식생물의 생산성 향상을 위한 가장 일반 적이고 효과적인 접근 방법으로써 이 기술을 이용하여 생산성을 향상시킨 많은 연구 사례가 보고되고 있다 (Gjedrem, 1983, 1997, 2000; Argue et al., 2002; Gjerde et al.
전복 양식산업 발전을 위해 육종연구가 필수인 이유는?
, 2006). 특히, 전복류는 성장속도가 느려 출하 상품 크기까지 장기간의 양성 기간을 필요로 하는 생물로써 전복 양식산업 발전을 위해서는 전복의 성장률 향상을 위한 육종연구가 필수적이다. 이에 전복의 성장률 향상을 위한 다양한 육종연구가 국내외적으로 수행되고 있다 (Hara and Kikuchi, 1992; Vinna, 2002; Park et al.
최적의 multiplex PCR 조건찾기 위하여 12개 microsatellite locus를 이용하여 각각의 증폭범위 및 유전적 특성을 확인한 결과는?
최적의 multiplex PCR 조건을 찾기 위하여 12개 microsatellite locus를 이용하여 각각의 증폭범위 및 유전적 특성을 확인하였다. 그 결과 Table 2에 나타낸 것과 같이 증폭 범위의 경우 Hdh145는 132-142 bp, Hdh512는 87-139 bp, Hdh1321는 261-371 bp, Afa017는 161-247 bp, Awb017는 205-249 bp, Awb019는 174-258 bp, Awb035는 153-217 bp, Awb063는 140-272 bp, Awb074는 154-260 bp, Awb083는 213-255 bp, Awb098는 167-189 bp, Awb101는 113-211 bp로 나타났으며, 대립유전자수는 Hdh1321이 35개로 가장 많았으며 Hdh145 및 Awb083이 7개로 가장 적은 것으로 나타났다. 12개 locus에 대한 관찰치이형접합율 (observed heterozygosity) 의 범위는 0.219-0.915이며, 기대치 이형접합율 (expected heterozygosity) 의 범위는 0.696-0.961로 높게 나타났다.
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