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문제 정의
- 특히, 와송열수추출물을 사전에 섭취한 실험동물에게 피하로 대장암세포를 주입하였을 때 종양 형성이 억제되는지 살펴봄으로써, 와송의 종양형성 억제효과를 검증하고자 하였다. 본 연구의 결과를 통해 효과적인 항암제로서 재배 와송의 이용 가능성을 검토하고, 암 예방을 위한 기능성 식품 개발에 활용할 기초자료를 제공하고자 한다.
- 따라서 근래에는 대량으로 와송을 재배하여 제공하는 추세에 있지만, 재배 와송이 야생 와송과 같은 항암 및 생리활성작용을 가지는지에 대한 연구가 더욱 필요한 실정이다. 이에 본 연구에서는 인체대장암세포주 중의 하나인 SW480에서 재배 와송 열수추출물이 암세포 성장과 전이 억제에 어떠한 효능을 가지는지 알아보고자 하였다. 특히, 와송열수추출물을 사전에 섭취한 실험동물에게 피하로 대장암세포를 주입하였을 때 종양 형성이 억제되는지 살펴봄으로써, 와송의 종양형성 억제효과를 검증하고자 하였다.
- 이에 본 연구에서는 인체대장암세포주 중의 하나인 SW480에서 재배 와송 열수추출물이 암세포 성장과 전이 억제에 어떠한 효능을 가지는지 알아보고자 하였다. 특히, 와송열수추출물을 사전에 섭취한 실험동물에게 피하로 대장암세포를 주입하였을 때 종양 형성이 억제되는지 살펴봄으로써, 와송의 종양형성 억제효과를 검증하고자 하였다. 본 연구의 결과를 통해 효과적인 항암제로서 재배 와송의 이용 가능성을 검토하고, 암 예방을 위한 기능성 식품 개발에 활용할 기초자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- 1×, 2×의 와송열수추출물을 24시간 간격으로 누적 처리하여 72시간까지 반응시켰고, 대조군에는 같은 양의 PBS를 첨가하였다.
- 본 실험에서는 4주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 구입하여(효창, 대구, 한국), 12시간 간격의 빛 주기(12 hr/12 hr, Light/Dark), 온도 및 습도가 조절되는 동물장에서 사육 및 관리하였다. In vivo에서 인체대장암세포주 SW480 증식에 대한 와송의 예방효과를 알아보기 위하여, SW480 세포 주사 전에 실험동물에게 와송열수추출물을 31일 동안 경구로 자유 섭취하게 하였다. 와송열수추출물은 체중 60 kg 성인에게 권장하는 하루 섭취량을 마우스의 체중에 대비하여 환산한 다음, 이를 마우스가 하루 평균 섭취하는 물의 양에 희석하여 제공하였다.
- Isoflurane을 이용한 흡입 마취 하에서 양쪽 옆구리의 털을 제거하고 SW480 세포(1×107개/100 μl)를 1cc 주사기(26-gage needle)에 넣은 다음, 피하로 주사하여 종양의 크기를 육안으로 확인할 수 있게 하였다.
- 개/100 μl)를 1cc 주사기(26-gage needle)에 넣은 다음, 피하로 주사하여 종양의 크기를 육안으로 확인할 수 있게 하였다. SW480 세포를 양쪽 옆구리에 주입하고 난 이후, 28일까지 종양의 형성과정을 관찰하였다. 미리 섭취한 와송이 종양의 유발을 억제하는 예방효과가 있는지 알아보기 위하여, 피하에 형성된 종양의 무게 및 부피를 SW 480 세포 주입 후 7, 14, 28일에서 실험동물을 희생하여 측정 및 분석하였다.
- 미리 섭취한 와송이 종양의 유발을 억제하는 예방효과가 있는지 알아보기 위하여, 피하에 형성된 종양의 무게 및 부피를 SW 480 세포 주입 후 7, 14, 28일에서 실험동물을 희생하여 측정 및 분석하였다. 각 실험군에서 분리한 종양조직의 장축(Major axis), 단축(Minor axis) 및 높이를 microcalipus를 이용하여 측정하고 아래의 식에 따라 종양의 부피를 계산하였다[9, 37].
- 2A). 또한, 와송에 의한 SW 480 세포의 형태학적 변화를 알아보기 위해, 와송열수추출물을 SW480 세포에 처리한 후 72시간 동안 24시간 간격으로 관찰 및 분석하였다. PBS를 처리한 대조군에서는 세포가 안정적으로 부착되어 정상적인 증식이 이루어진 모습을 보였으나, 와송 혼합물을 72시간까지 처리한 실험군 I과 II에서는 부착되지 않고 부유하는 세포가 확인되었다(Fig.
- SW480 세포를 양쪽 옆구리에 주입하고 난 이후, 28일까지 종양의 형성과정을 관찰하였다. 미리 섭취한 와송이 종양의 유발을 억제하는 예방효과가 있는지 알아보기 위하여, 피하에 형성된 종양의 무게 및 부피를 SW 480 세포 주입 후 7, 14, 28일에서 실험동물을 희생하여 측정 및 분석하였다. 각 실험군에서 분리한 종양조직의 장축(Major axis), 단축(Minor axis) 및 높이를 microcalipus를 이용하여 측정하고 아래의 식에 따라 종양의 부피를 계산하였다[9, 37].
- 1×, 2×의 와송열수추출물을 24시간 간격으로 누적 처리하여 72시간까지 반응시켰고, 대조군에는 같은 양의 PBS를 첨가하였다. 반응 종료 후 세포를 수거하여 원심분리한 다음, 0.4% Trypan blue (NanoEnTek, Seoul, Korea)로 염색하고 EVETM Automatic Cell Counter (NanoEnTek, Seoul, Korea)에서 세포수를 측정하여 사멸능을 분석하였다. 와송에 의한 SW480 세포의 형태학적 변화는 0, 24, 48, 72시간에서 100×, 200× 배율의 광학현미경(CK2, Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하고 촬영하였다.
- incubator에서 배양하여 사용하였다. 세포배양을 위해 Phosphate Buffered Saline (Lonza, MD, USA)을 이용하여 2일 간격으로 수세하였고, 세포의 Confluency가 80-90%에 도달하였을 때 Trypsin mixture (0.25% Trypsin, 0.53mM EDTA) (Lonza, MD, USA)을 이용하여 계대 배양하여 사용하였다. 인체대장암세포주 SW480에 대한 와송의 효과를 알아보기 위하여, 와송열수추출물을 Whatman filter paper(GE Healthcare, PA, USA)로 1차 여과한 다음, 0.
- 스크래치 gap의 변화를 0, 24, 48, 72시간에서 40× 배율의 광학현미경로 관찰 및 촬영한 다음, Image J program ver. 1.6 (NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 gap의 넓이 변화를 분석하였다.
- 실험군 I은 하루 권장량(1×)을, 실험군 II는 하루 권장량의 두 배(2×)를 섭취하게 하였고, 대조군은 동량의 물을 제공하였다.
- 와송이 종양의 유발과 형성을 억제하는지 알아보기 위해, SW480 세포 주입 후 7일, 14일, 28일에서 실험동물을 희생시켜 종양 조직을 확인하고 분리하였다. 실험동물의 피하에서 분리한 좌우 종양 조직의 무게를 평균하여 실험군 간의 차이를 비교 분석하였고, 좌우 종양 조직의 부피를 계산한 다음 평균하여 실험군 간의 차이를 비교 분석하였다.
- 여과된 와송열수추출물을 1×, 2×의 농도로 SW480 세포에 24시간 간격으로 72시간까지 처리하였다(Fig. 1A).
- 와송에 의한 SW480 세포의 형태학적 변화는 0, 24, 48, 72시간에서 100×, 200× 배율의 광학현미경(CK2, Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하고 촬영하였다.
- 이후 PBS로 세포를 수세한 다음, 1×, 2×의 와송열수추출물을 첨가한 DMEM에서 세포를 배양하였다. 와송열수추출물은 24시간 간격으로 누적 처리하여 72시간 동안 반응시켰고, 대조군에는 같은 양의 PBS를 첨가하였다. 스크래치 gap의 변화를 0, 24, 48, 72시간에서 40× 배율의 광학현미경로 관찰 및 촬영한 다음, Image J program ver.
- In vivo에서 인체대장암세포주 SW480 증식에 대한 와송의 예방효과를 알아보기 위하여, SW480 세포 주사 전에 실험동물에게 와송열수추출물을 31일 동안 경구로 자유 섭취하게 하였다. 와송열수추출물은 체중 60 kg 성인에게 권장하는 하루 섭취량을 마우스의 체중에 대비하여 환산한 다음, 이를 마우스가 하루 평균 섭취하는 물의 양에 희석하여 제공하였다. 실험군 I은 하루 권장량(1×)을, 실험군 II는 하루 권장량의 두 배(2×)를 섭취하게 하였고, 대조군은 동량의 물을 제공하였다.
- 실험군 I은 하루 권장량(1×)을, 실험군 II는 하루 권장량의 두 배(2×)를 섭취하게 하였고, 대조군은 동량의 물을 제공하였다. 와송열수추출물을 섭취하는 31일 동안 2일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 비교 분석하였다. 이후 생체 내 종양 유발을 위하여 인체대장암세포주 SW480을 피하로 주입하였고, 체중의 변화와 종양의 형성과정을 세포 주입 후 7일, 14일, 그리고 28일에서 확인 및 측정하였다(Fig.
- 와송의 SW480 세포 사멸 효과를 알아보기 위하여, SW480 세포에 와송열수추출물을 농도별로 처리하여 72시간까지 반응시킨 다음, 세포를 수거하여 trypan blue로 염색하고 세포수를 분석하였다. 와송열수추출물은 처리 농도에 비례하여 SW480 세포의 생존율을 유의하게 억제하였다(p=0.
- 와송이 종양의 유발과 형성을 억제하는지 알아보기 위해, SW480 세포 주입 후 7일, 14일, 28일에서 실험동물을 희생시켜 종양 조직을 확인하고 분리하였다. 실험동물의 피하에서 분리한 좌우 종양 조직의 무게를 평균하여 실험군 간의 차이를 비교 분석하였고, 좌우 종양 조직의 부피를 계산한 다음 평균하여 실험군 간의 차이를 비교 분석하였다.
- 와송열수추출물을 섭취하는 31일 동안 2일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 비교 분석하였다. 이후 생체 내 종양 유발을 위하여 인체대장암세포주 SW480을 피하로 주입하였고, 체중의 변화와 종양의 형성과정을 세포 주입 후 7일, 14일, 그리고 28일에서 확인 및 측정하였다(Fig. 1B). 본 연구의 계획과 방법은 인제대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 제공하는 심의규정(승인번호 2016-22)에 준하여 진행되었다.
- 인체대장암세포주 SW480에 대한 와송의 세포사멸능 효과를 알아보기 위해 6-well plate에 3×105개의 SW480 세포를 분주한 다음, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다.
- 인체대장암세포주 SW480에 대한 와송의 효과를 알아보기 위하여, 와송열수추출물을 Whatman filter paper(GE Healthcare, PA, USA)로 1차 여과한 다음, 0.45 μm pore의 Minisart® high flow syringe filters (Sartorius stedim, Germany)로 2차 여과 처리하였다.
- 인체대장암세포주 SW480의 증식 억제능에 대한 와송의 효과를 알아보기 위해 6-well plate에 3×105개의 SW480 세포를 분주하고, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 다음, 0.5 mm tip size의 6-well plate Scratcher (Cat. No. 201906, SPL ScarTM Scratcher, Seoul, Korea)를 이용하여 직선의 스크래치를 만들었다.
- 따라서 장기간 와송을 섭취하는 동안 체중의 변화를 모니터링 하는 것은 와송이 생리학적으로 생체에 미치는 영향을 이해하는 것을 의미하며, 인체대장암세포주 SW480 세포 주입 후 체중의 변화를 모니터링 하는 것은 와송이 부작용 없는 안전한 천연 항암제인지를 확인하는데 있어 꼭 필요한 과정 중 하나라고 할 수 있다. 종양형성에 대한 와송의 예방적 효과를 알아보기 위해, SW480을 실험동물에게 주입하기 전, 와송열수추출물을 경구로 자유 섭취하게 하고, 섭취 기간 동안 실험군 I과 II의 체중을 측정하여 대조군과 비교하였다. 1일에서 측정한 각 군의 체중은 대조군(27.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 와송(Orostachys japonicus A. Berher)은 충청남도 논산에서 노지 재배한 것으로, 건조된 와송을 파쇄한 후, 90~100℃에서 3시간 동안 2회 반복하여 열수추출을 시행하였다. 상층의 추출물을 여과 및 농축 시킨 다음 동결건조하였고, 본 실험에서는 이상과 같이 정제수를 이용하여 추출한 와송열수추출물(갈마산 와송농장, 논산, 한국)을 구입하여 In vitro 실험과 In vivo 실험에 각각 시료로 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 인체대장암세포주 SW480은 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, KCLB)으로부터 분양받아 1% Penicillin/Streptomycin (Lonza, MD, USA)과 10% Fetal Bovine Serum (Hyclone, UT, USA)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (Lonza, MD, USA)을 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하여 사용하였다.
- 본 실험에서는 4주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 구입하여(효창, 대구, 한국), 12시간 간격의 빛 주기(12 hr/12 hr, Light/Dark), 온도 및 습도가 조절되는 동물장에서 사육 및 관리하였다. In vivo에서 인체대장암세포주 SW480 증식에 대한 와송의 예방효과를 알아보기 위하여, SW480 세포 주사 전에 실험동물에게 와송열수추출물을 31일 동안 경구로 자유 섭취하게 하였다.
- Berher)은 충청남도 논산에서 노지 재배한 것으로, 건조된 와송을 파쇄한 후, 90~100℃에서 3시간 동안 2회 반복하여 열수추출을 시행하였다. 상층의 추출물을 여과 및 농축 시킨 다음 동결건조하였고, 본 실험에서는 이상과 같이 정제수를 이용하여 추출한 와송열수추출물(갈마산 와송농장, 논산, 한국)을 구입하여 In vitro 실험과 In vivo 실험에 각각 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 반복실험을 통해 얻어진 실험결과는 SPSS Version 20.0(IBM SPSS Inc, Armonk, NY, USA)을 사용하여 분석하였고, One-way ANOVA와 Repeated two-way ANOVA를 통해 통계적 유의성을 p<0.05 수준에서 검증하였다.
- 실험군 간의 차이를 비교하기 위해, Duncan’s multiple range test를 실시하였고, 모든 결과는 평균 및 표준편차로 표시하였다.
이론/모형
- 와송에 의한 SW480 세포의 증식과 이주 억제 효과를 알아보기 위하여 Scratch assay를 실시하였다(Fig. 3A). 스크래치를 만든 직후(0시간)에는 대조군과 실험군 I, II 모두 gap의 넓이가 일정하고 깨끗하게 관찰되었지만, 대조군에서는 24시간부터 세포의 이주(migration)가 나타나기 시작하여, 48시간과 72시간에서 gap의 넓이가 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(p<0.
성능/효과
- 또한, 와송에 의한 SW 480 세포의 형태학적 변화를 알아보기 위해, 와송열수추출물을 SW480 세포에 처리한 후 72시간 동안 24시간 간격으로 관찰 및 분석하였다. PBS를 처리한 대조군에서는 세포가 안정적으로 부착되어 정상적인 증식이 이루어진 모습을 보였으나, 와송 혼합물을 72시간까지 처리한 실험군 I과 II에서는 부착되지 않고 부유하는 세포가 확인되었다(Fig. 2B). 이러한 결과는 인체 전립선암 세포에 대한 재배 와송의 암세포 성장억제효과와 유사하게 나타났으며[39], 와송열수추출물과 메탄올 추출물이 NDMA 생성을 억제하고, 아질산염 소거작용에 관여함을 보고한 Choi 등(2008)의 연구와 유사하였다[5].
- SW480 세포 주입에 의한 체중의 변화를 관찰한 결과, 31일 동안 와송을 섭취했던 실험군 I, II의 체중은 대조군에 비해 크게 나타났다(p<0.05).
- SW480 세포를 주입한 이후 대조군과 실험군 I, II 모두 체중이 감소하였으나, 14일부터 실험군 I과 II의 체중은 대조군에 비해 다시 유의하게 증가하였고(p<0.05), 특히 28일에서 실험군 I의 체중은 대조군 보다 유의하게 높게 나타났다(p<0.05)(Fig. 4B).
- 각 실험군에서 측정한 종양조직의 부피를 비교 분석한 결과, 대조군에서는 종양 조직의 부피가 지속적으로 유의하게 증가하는 반면(p<0.05), 와송을 섭취한 실험군에서는 종양 조직의 부피가 커지는 것이 억제되거나, 감소하였다(p<0.05).
- 대조군의 생존율과 비교하였을 때, 실험군 I의 생존율은 86.8%로 유의하게 낮았고(p<0.05), 실험군 II의 생존율은 82.7%로 더욱 유의하게 나타났다(p<0.05)(Fig. 2A).
- 반면, 와송을 처리한 실험군 I과 II에서는 스크래치 gap으로 이동하는 세포가 대조군에 비해 적게 관찰되었으며, 24시간, 48시간, 그리고 72시간 모두에서 대조군에 비해 gap이 유의하게 넓게 나타났다(p<0.01).
- 본 연구에서 천연 항암후보물질로서 사용한 와송은 많은 생리활성성분을 함유하고 있고, 이로 인해 다양한 약리적 효과를 가진다. 따라서 장기간 와송을 섭취하는 동안 체중의 변화를 모니터링 하는 것은 와송이 생리학적으로 생체에 미치는 영향을 이해하는 것을 의미하며, 인체대장암세포주 SW480 세포 주입 후 체중의 변화를 모니터링 하는 것은 와송이 부작용 없는 안전한 천연 항암제인지를 확인하는데 있어 꼭 필요한 과정 중 하나라고 할 수 있다.
- 와송추출물 성분 중 Flavonoid는 생체 내에서 human hepatocellular carcinoma의 종양형성을 효과적으로 억제하는데, 저농도(125 mg/kg) 보다는 고농도(500 mg/kg)에서 보다 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다[24]. 본연구에서도 고농도의 와송을 섭취한 마우스에서 종양의 형성이 유의하게 억제되었다. 고농도의 Flavonoid를 주입한 마우스에서 형성된 종양조직을 분석한 결과, HIF-1α, VEGF 발현이 유의하게 감소되었는데[24], hypoxia는 solid tumor microenvironment로 알려져 있다[43].
- 스크래치를 만든 직후(0시간)에는 대조군과 실험군 I, II 모두 gap의 넓이가 일정하고 깨끗하게 관찰되었지만, 대조군에서는 24시간부터 세포의 이주(migration)가 나타나기 시작하여, 48시간과 72시간에서 gap의 넓이가 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(p<0.05).
- 와송열수추출물은 처리 농도에 비례하여 SW480 세포의 생존율을 유의하게 억제하였다(p=0.006, p<0.01).
- 3B). 와송열수추출물을 처리한 실험군에서 스크래치 gap 간격이 좁아지지 않고, 대조군에 비해 넓게 확인되는 결과를 통해 와송이 인체대장암 세포주 SW480의 증식을 억제하는 효과를 가지는 것으로 생각된다. 이러한 결과는 Flavonoid 계열의 isoquercitrin이 SW480 cells과 같은 colon cancer cells의 성장과 이주를 억제한다고 보고한 Amado 등(2014)의 결과와 일치하였다[2].
- 또한 Flavonoid류의 하나인 quercetin은 혈당강하에 효과적이며, 혈중 콜레스테롤 및 중성지방의 감소, 췌장으로부터 인슐린 분비를 촉진시키는 것으로 알려져 있다[25, 38]. 이와 같은 Flavonoid가 와송에 얼마나 함유되어 있는지 알아보기 위해, 와송을 용매별로 추출한 후 Flavonoid의 함량을 비교한 결과, 70% ethanol 추출물, 70% methanol 추출물, CM (Chloroform:Methanol, 2:1, v/v) 추출물, DW 추출물 순으로 높게 나타났으며, 와송추출물의 농도가 올라갈수록(0.2~0.6 mg/ml) 항산화 기능 역시 증가하였다[8]. Flavonoid는 Flavonol (quercetin, fisetin, kaempferol), Flavone, Isoflavone (daidzein, biochanin A), Flavanol (epicatechin 3-gallate) 등 여러 형태의 생리활성물질이 있어 용매에 따라 추출되는 정도가 다르다고 알려져 있지만[34], 물을 이용한 와송열수추출물 역시 Flavonoid 성분을 함유하고 있으며, 이는 식품 내 대표적인 발암물질로 알려진 NDMA 생성 억제 작용 및 전구물질인 아질산염 소거 작용을 나타내는 것으로 확인되었다[5].
- 고농도의 Flavonoid를 주입한 마우스에서 형성된 종양조직을 분석한 결과, HIF-1α, VEGF 발현이 유의하게 감소되었는데[24], hypoxia는 solid tumor microenvironment로 알려져 있다[43]. 이와 같은 결과를 통해 Flavonoid가 종양세포의 사멸을 유도하고, 종양조직의 혈관 생성을 억제함으로써 강한 항암 효과를 가짐을 알 수 있다.
- 특히 실험군 I은 실험군 II보다도 gap 쪽으로 이주해오는 세포군이 적게 나타나 gap의 간격이 유의하게 크게 나타났으며, 실험군 간의 이러한 차이는 72시간까지 지속되었다(p<0.05)(Fig. 3B).
- 특히 와송열수추출물을 섭취하고 25일 이후부터, 실험군 I, II의 체중은 대조군보다 유의하게 증가하는 것으로 확인되었다(p<0.05)(Fig. 4A).
후속연구
- 고지방식이를 통해 비만이 유도된 실험동물에서 와송추출물은 혈청 내 지질성분 수준과 지방축적을 감소시키며, 체중증가를 억제하는 것으로 보고되고 있지만[20], 비만이나 당뇨 등이 유도되지 않은 일반적 상태에서 와송추출물은 체중에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다[16]. 하지만, 종양세포를 이용한 Xenograft model에서 와송의 효능 및 생리학적 효과를 검증하기 위해서는 보다 자세한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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