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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 막걸리로부터 다당체를 분리하여 성분분석 및 각종 면역자극 활성 특히 자연면역계를 구성하고 있는 보체계 및 macrophage에 대한 영향을 평가함으로써 면역자극활성제로서의 막걸리 다당체의 가능성을 살펴보았다.
- 본 연구에서는 막걸리로부터 다당을 분리하여 자연면역계를 구성하고 있는 보체계 및 macrophage에 대한 면역자극 활성을 측정하였다. 열수추출한 뒤 ethanol 침전을 통하여 조다당을 추출한 후 특성을 검토한 결과, 막걸리 조 다당체(RWW)의 neutral sugar 함량은 87.
제안 방법
- 반응액을 4℃, 2,500 rpm에서 약 10분간 원심분리 하여 얻어진 상등 액을 412 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 용혈활성을 측정 하였다. 다당체의 항보체활성은 대조군의 총 보체용혈(50% total complement hemolysis, TCH50, %)에 대한 저지율(inhibition of 50% total complement hemolysis, ITCH50,%)로서 나타내었다.
- 막걸리 유래 다당체 RWW가 RAW 264.7 macrophage에 독성을 가지는지 확인하기 위하여, RWW를 1~100 µg/mL 의 농도로 macrophage에 처리한 후 세포의 생존율을 MTT 방법을 이용하여 측정하였다.
- , Tokyo, Japan)를 가해 2차 반응시키고 phosphate buffered saline(Sigma-Aldrich)을 넣어 반응을 정지시켰다. 반응액을 4℃, 2,500 rpm에서 약 10분간 원심분리 하여 얻어진 상등 액을 412 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 용혈활성을 측정 하였다. 다당체의 항보체활성은 대조군의 총 보체용혈(50% total complement hemolysis, TCH50, %)에 대한 저지율(inhibition of 50% total complement hemolysis, ITCH50,%)로서 나타내었다.
- 배지로 희석시킨 막걸리 다당을 농도별로 세포에 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후, 상등액으로 분비된 IL-6, IL-12, tumor necrosis factor(TNF)-α의 양을 ELISA kit(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다.
- 본 연구에 사용된 시료는 막걸리 제조용 쌀발효원액을 서울장수막걸리(Jincheon, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 쌀발효원액을 실험실용 food mixer(HMF-3300H, Hanil, Seoul, Korea)로 분쇄한 후 100℃에서 30분간 가열하여 추출하였다. 추출물을 여과지(8 µm, Whatman, Maidstone, UK)로 여과 후 상등액에 4배 부피의 95% 에탄올을 첨가하고 4℃에 16시간 정도 정치하여 생성된 침전물을 원심분리(6,000 rpm, 30 min) 하여 회수하였다.
- 여기에 진한 황산 3 mL를 가하고 85℃ water bath에서 15분간 발색시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하여 검량선으로부터 구해진 β-D-galacturonic acid(Sigma-Aldrich)를 표준물질로 하여 함량을 계산하였다.
- 45 µm 막필터로 여과하여 여액을 각각 1 mL씩 취하여 5% phenol 1 mL에 잘 혼합시켰다. 여기에 황산 5 mL를 첨가한 후 30분 반응시키고 490 nm에서 흡광도를 측정하여 검량선으로부터 구해진 glucose의 함량으로 총당 함량을 계산하였다. 산성당 함량은 carbazole-sulfuric acid법(15)으로 측정하였다.
- 추출물을 여과지(8 µm, Whatman, Maidstone, UK)로 여과 후 상등액에 4배 부피의 95% 에탄올을 첨가하고 4℃에 16시간 정도 정치하여 생성된 침전물을 원심분리(6,000 rpm, 30 min) 하여 회수하였다. 침전물을 소량의 증류수에 용해하여 Spectra/Por 투석막(MWCO: 6,000~ 8,000, Spectrum Laboratories Inc., Compton, CA, USA)을 이용하여 3일간 투석을 행하고 동결건조를 행하여 조다당 시료(RWW)를 얻었다.
대상 데이터
- 40071) 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.7 세포는 10%(v/v) fetal bovine serum(Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA)과 1%(v/v) penicillin-streptomycin(Gibco BRL Co.)을 함유한 DMEM 배지(Gibco BRL Co.)를 이용하여 37℃, 5% CO2로 조절된 incubator에서 배양하였다.
- 본 연구에 사용된 시료는 막걸리 제조용 쌀발효원액을 서울장수막걸리(Jincheon, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 쌀발효원액을 실험실용 food mixer(HMF-3300H, Hanil, Seoul, Korea)로 분쇄한 후 100℃에서 30분간 가열하여 추출하였다.
- 실험에 사용한 대식세포주인 RAW 264.7(KTCC No. 40071) 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.
데이터처리
- Different corresponding letters indicate significant differences at P<0.05 by Duncan's multiple range test.
- 실험에서 얻은 모든 data는 SAS 8.0 프로그램(SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 ANOVA 분산분석을 수행하였고, 검정방법은 Duncan의 다중범위법으로 시행하였다.
이론/모형
- 여기에 진한 황산 3 mL를 가하고 85℃ water bath에서 15분간 발색시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하여 검량선으로부터 구해진 β-D-galacturonic acid(Sigma-Aldrich)를 표준물질로 하여 함량을 계산하였다. 단백질 함량 측정은 Bradford method(16)로 측정하였으며 표준물질로는 bovine serum albumin(Sigma-Aldrich)을 사용하였다.
- 막걸리 유래 다당의 RAW 264.7 세포에 대한 독성 측정은 MTT assay로 측정하였다. RAW 264.
- 여기에 황산 5 mL를 첨가한 후 30분 반응시키고 490 nm에서 흡광도를 측정하여 검량선으로부터 구해진 glucose의 함량으로 총당 함량을 계산하였다. 산성당 함량은 carbazole-sulfuric acid법(15)으로 측정하였다. 시료분말을 1%(w/v) 농도로 증류수로 녹인 시료용액을 0.
- 총당 함량은 phenol-sulfuric acid법(14)으로 측정하였다. 즉, 시험관에 시료의 조다당체 분말을 1%(w/v)로 증류수에 녹인 시료용액을 0.
- 항보체활성은 Kabat와 Mayer 방법(17)을 이용하여 시료에 의한 보체 소비(complement consumption) 후 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈활성에 근거를 둔 complement fixation test로 측정하였다. 즉 증류수에 녹인 시료에 정상인의 혈청과 2% gelatin, 500 μM Ca2+, 2 mM Mg2+ 이 함유된 GVB++(gelatin veronal buffered saline, pH 7.
성능/효과
- Macrophage cell에 24시간 RWW를 처리했을 때 모든 농도에서 유의적인 세포사멸이 나타나지 않아 세포독성이 없음을 확인할 수 있었을 뿐만 아니라, 1 µg/mL, 100 µg/mL의 농도에서는 유의적인 세포 증식을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- RWW를 1, 10, 100 µg/mL 농도로 macrophage에 처리하여 면역자극을 유도한 결과 모든 처리 농도에서 IL-6, IL-12, TNF-α의 분비가 증가되었다.
- 막걸리 유래 다당체에 의한 보체계 활성화능을 측정한 결과, RWW는 1,000 µg/mL에서 ITCH50값이 약 36%에 이르는 보체계 활성화능을 보였다(Fig. 1).
- 막걸리 유래 활성 다당 RWW의 자극에 의한 macrophage의 cytokine 생산을 ELISA 방법으로 측정한 결과 IL-6, IL-12, TNF-α의 분비를 농도 의존적으로 증가시키는 것으로 확인 되었다(Fig. 3).
- 본 연구에서는 막걸리로부터 다당을 분리하여 자연면역계를 구성하고 있는 보체계 및 macrophage에 대한 면역자극 활성을 측정하였다. 열수추출한 뒤 ethanol 침전을 통하여 조다당을 추출한 후 특성을 검토한 결과, 막걸리 조 다당체(RWW)의 neutral sugar 함량은 87.3%, uronic acid 함량은 2.5%, protein 함량은 10.2%이었다. RWW는 인체 초기 면역반응에 있어 중요한 역할을 담당하는 보체계에 대한 활성을 나타냈으며, 마우스 RAW 264.
- RWW를 1, 10, 100 µg/mL 농도로 macrophage에 처리하여 면역자극을 유도한 결과 모든 처리 농도에서 IL-6, IL-12, TNF-α의 분비가 증가되었다. 이상의 결과를 종합해 볼때, 막걸리 유래 다당체는 자연면역계를 구성하고 있는 보체 계와 macrophage의 활성인자로 작용할 수 있음이 확인되었고, RWW를 통해 cytokine 분비를 유도, 조절함으로써 체내 면역기능을 증강시킬 가능성이 있을 것으로 사료되었다.
후속연구
- Macrophage로부터 분비되는 IL-6, IL-12, TNF-α와 같은 염증성 cytokine들은 인체에 침입한 병원체 및 종양세포 들에 대한 제거활성을 증진시킨다는 이전의 연구 결과들을 고려해 보았을 때(26), 막걸리 다당체가 macrophage의 염증성 cytokine들의 생성을 촉진하여 인체의 면역력을 증진 시킬 것으로 판단되었다. 앞으로 막걸리 유래 다당을 이용한 동물 및 임상실험을 통하여 면역증진효능, 면역억제에 대한 극복효능 및 그 기전을 입증한다면 전통발효주인 막걸리의 우수성을 알리는 기초자료로 활용할 수 있으리라 생각된다.
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