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문제 정의
- 또한 영양불량, 폐결핵, 강심작용, 혈압저하, 혈당저하, 말기암의 보조 치료제 등에 효능이 있다고 전래되고 있다9). 따라서 둥굴레에 내재하는 생리활성 기능이 비만을 포함한 각종 성인병에 효과를 나타낼 수 있는 가능성을 시사해준다고 생각된다. 또한 식물에 포함되어 있는 총페놀함량은 항산화 효과와 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다10).
- 본 연구에서 증자 둥굴레 추출물의 3T3-L1 지방세포에서 분화억제 및 지질강하 효과를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 2일 후 2 µg/mL insulin / 10% FBSㆍDMEM배지로 교환하며, 약물을 이틀에 한 번씩 5번 처리하여 10일 동안 지방세를 분화배양 하였다.
- POE 처리가 3T3-L1세포에서 비만관련 지표인 초기 분화 전사인자 C/EBPα , PPARγ 발현과 세포내 에너지 항상성 조절인자인 AMPK 인산화에 대한 영향을 확인하기 위해 western blot을 수행하였다.
- 단백질 전이된 membrane을 5% skim milk를 처리하여 비특이적인 단백질에 대한 blocking을 실시하고, C/EBPα , PPARγ , pAMPK/AMPK, β-actin 단백질 항체를 4℃에서 하룻밤 각각 반응 처리하였다. TBS-T로 세척한 후에 각각의 단백질 항제에 알맞은 2차 항체로 반응 하여 ECL 시약을 처리하여 X-ray film에 감광시켜 타겟 단백질 발현량을 관찰 하였다.
- 세포배양액 제거하고 D-PBS로 세척 후 10% formaldehyde 가 포함된 cacodylate buffer로 4℃ 에서 2 시간 고정하였다. 다시 증류수로 세척하여 oil-red O 염색시약으로 염색하고, 세척하여 염색된 세포를 현미경(CK2, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였으며 염색된 지방세포의 지방함량 측정을 위해 100% isopropyl alcohol 로 지방을 추출하여 분광 광도계(Lambda UV/VIS, Perkin Elmer, USA) 로 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 단백질 전이된 membrane을 5% skim milk를 처리하여 비특이적인 단백질에 대한 blocking을 실시하고, C/EBPα , PPARγ , pAMPK/AMPK, β-actin 단백질 항체를 4℃에서 하룻밤 각각 반응 처리하였다.
- 9 ml을 가하고 강하게 혼합한 후, 실온에서 60분간 반응하고 흡광도를 517 nm 파장에서 측정하였다. 대조군은 시료대신 ethanol을 동량 첨가하여 실험하였고, 라디칼 소거능은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도를 구하여 다음과 같이 백분율로 표시하였다.
- 둥굴레 추출물(POE) 처리가 3T3-L1 지방세포에 미치는 독성 영향을 알아보기 위해 3T3-L1세포에 0.05~1 mg/ml 농도의 POE를 각각 처리하고 MTT 염색법을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 지방세포에 처리농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다.
- 둥굴레 ethyl acetate 분획 추출물의 경우에도 높은 DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 양이온 소거능을 나타냈으며, FRAP 활성 측정결과 총항산화력 역시 높은 수치를 보였다. 따라서 둥글레 ethyl acetate 분획추출물의 항산화능이 확인된 둥굴레 추출물이 지방세포분화 및 지방축적 억제 효과를 나타 낼 것으로 예상되어 3T3-L1 지방세포의 세포생존율과 세포에 영향을 미치지 않는 0.2 mg/ml 농도에서 둥굴레 추출물(POE)을 처리하여 지방세포의 분화정도와 지방축적정도를 실험하였다.본 실험에서 사용한 0.
- 그 결과, 지방세포에 처리농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 따라서 본 실험에서는 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 농도인 0.2 mg/ml 농도에서 이후 실험들을 진행하였다(Fig. 2).
- 그러나 3T3-L1 지방세포에 둥굴레 추출물의 처리에 따른 항산화 효과가 지방세포분화, 지질축적 억제 및 체내 에너지 항상성 관련 단백질의 인산화에 미치는 영향에 대한 연구는 보고된 바 없다. 따라서 본 연구 에서는 둥굴레 추출물의 항산화물 함량과 항산화능을 측정하고, 3T3-L1 지방세포에서 둥굴레 추출물이 지방축적과 에너지 항상성에 미치는 영향과 항산화와 항비만 효과를 실험하였다.
- 05 수준에서 실시하였다. 밴드의 강도은 L process and multi gauge software (Version 2.01, Fujifilm)을 사용하여 분석 정량하였다.
- 생리활성 물질의 추출은 먼저 건조한 둥굴레 시료 200 g을 블랜드로 분쇄한 후, 실온에서 90% methanol(×3 용량)로 12시간 동안 진탕(120rpm)하여 추출하였으며 상기 과정을 3회 수행하여 methanol 추출액(수율 50.6%)을 모았다.
- 세포는 DMEM 배지 (10% BCS, 1% P/S 포함)를 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기(MCO-15AC, SANYO, Japan)에서 75% confluence가 되도록 배양한 후, 배양액을 분화유도 배양액(0.5 mM IBMX, 2 µΜ DEX, 2 µg/ml insulin / 10% FBS)으로 바꾸어 POE 약물을 처리하고 2일간 배양하였다.
- . 즉, 300 mM acetate 완충액(pH 3.6), 10 mM TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine)/40 mM HCl, 20 mM ferric chloride을 10: 1: 1의 비율로 혼합하여 TPTZ 시약을 제조하였다. TPTZ 시약 1.
- . 즉, 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 최종농도로 혼합하여 실온에서 24시간 동안 암소에 방치하여 ABTS 라디칼 양이온을 형성시켰다. 이를 734 nm 파장에서 흡광도 값이 0.
- 총 항산화 활성은 Fe(Ⅱ) 표준품(FeSO4ㆍ7H2O)으로 표준곡선을 작성한 후, 시료의 흡광도를 FRAP value (µM Fe(II))로 계산하였다.
- 페놀화합물의 총 항산화능은 244.8±9.0 µM Fe(II)로 나타내어 POE의 항산화력을 관찰하였다.
- 항산화 효과는 DPPH 라디칼 및 ABTS 라디칼 소거능 분석으로, 총항산화능은 FRAP분석으로 측정하였다. DPPH 분석의 경우, 추출물 10 mg/ml 농도에서 92.
대상 데이터
- AMP-activated protein kinase (AMPK), pAMPK, 항체는 cell signaling technology사(USA)에서 구입하였고, proliferater acti vated receptor-γ (PPAR γ), CCAAT/enhancer binding protein α (C/EBPα), β-actin 1차 항체 및 2차 항체는 Santa Cruz사(USA)에서 구입하였다.
- 증자 둥굴레의 ethyl acetate 분획 추출물에는 폴리페놀과 플라보노이드가 존재하는 것으로 나타났다. Gallic acid와 rutin을 각각 표준물질로 사용하였다. 폴리페놀과 플라보노이드는 식물이 갖고 있는 생리활성물질로 항산화 활성을 포함 하는 다양한 기능을 나타낸다.
- AMP-activated protein kinase (AMPK), pAMPK, 항체는 cell signaling technology사(USA)에서 구입하였고, proliferater acti vated receptor-γ (PPAR γ), CCAAT/enhancer binding protein α (C/EBPα), β-actin 1차 항체 및 2차 항체는 Santa Cruz사(USA)에서 구입하였다. polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane은 Roche (Mannheim, Germany) 에서 구입하였고, 그 외 언급하지 않은 시약들은 reagent-grade 로 구입하여 본 실험에 사용하였다.
- 김천산 둥굴레 뿌리를 세척하고 껍질을 제거한 다음, 수증기로 1시간 증자하고 55~60℃ 범위에서 열풍건조기로 6시간 건조하였다. 이 과정을 5회 반복 실시하여 추출용 시료로 사용하였다.
- 본 실험에 사용 시약으로 bovine calf serum (BCS), fetal bovine serum (FBS), high-glucose Dulbeco’ s modified Eagle’ s medium (DMEM), penicillin streptomycin (P/S), enhanced chemiluminescence (ECL)은 Thermo Scientific사 (Rockford, IL, USA)에서 구입하였으며, dexametasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 3-[4,5-dimethylthiazolyl]-2,5–di phenyltetrazolium bromide (MTT), dimethylsulfoxide (DMSO), insulin, oil-red O 시약은 Sigma Aldrich사 (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용한 세포주는 American type culture collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입한 마우스 전지방세포 3T3-L1을 사용하였다. 세포는 DMEM 배지 (10% BCS, 1% P/S 포함)를 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기(MCO-15AC, SANYO, Japan)에서 75% confluence가 되도록 배양한 후, 배양액을 분화유도 배양액(0.
데이터처리
- 통계처리(Student’ s t-test)는 GraphPad Prism 5 program (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하였고, 대조세포에 대한 유의성 검증은 p<0.05 수준에서 실시하였다.
이론/모형
- ABTS 라디칼 양이온 소거능은 Kenneth 방법에 따라 다음과 같이 실시하였다17). 즉, 7 mM ABTS와 2.
- DPPH 라디칼 소거능은 Blois 방법16)에 따라 측정하였다. 추출물 분획 100 ul에 0.
- 2 mg/ml 농도에서 둥굴레 추출물(POE)을 처리하여 지방세포의 분화정도와 지방축적정도를 실험하였다.본 실험에서 사용한 0.2 mg/ml 처리농도는 천연물 추출 효능검정 실험에서 통상적으로 처리하는 농도로 전 등 25) 의 논문을 참고하였다. 결과 3T3-L1 지방세포에서 대조세포에 비해 둥굴레 처리 지방세포에서 지방생성 및 지방축적이 억제되었다.
- 총 flavonoid 함량은 Zhishen 변형 비색법으로 다음과 같이 실시하였다15). 즉, 추출물 분획 500 ul에 증류수 2 ml과 5% 질산나트륨용액 150 ul를 혼합하고 실온에서 6분경과 후, 10% 염화알루미늄 용액 150 ul를 첨가하고, 다시 6분후, 4% NaOH 2 ml을 가한 다음, 증류수로 채워 5 ml로 희석하였다.
- 총 페놀화합물의 함량은 folin-ciocalteu 방법으로 다음과 같이 실시하였다14). 즉, 증류수 3.
- 총 항산화 활성 평가는 Benzie 등의 FRAP 방법으로 평가 하였다18). 즉, 300 mM acetate 완충액(pH 3.
성능/효과
- 1. 증자 둥굴레 추출물(POE)는 총 폴리페놀과 프라보노이드 함량이 50.83±1.52 GAE mg, 17.05±2.47 RE mg을 각각 포함하고 있었다.
- 2. 증자 둥굴레 추출물는 0.05 mg/ml~0.5 mg/ml 처리 농도에서 3T3-L1 세포에 독성을 나타내지 않았다.
- 3. POE의 Oil-red O 염색결과 0.2 mg/ml의 농도에서 지방축적 억제 정도가 대조세포에 비하여 유의적으로 지방축적 억제 효과를 보였다.
- 4. POE 처리가 3T3-L1세포에서 비만관련 지표인 초기 분화전사인자 C/EBPα, PPARγ 발현이 유의적인 수준 (p<0.05)으로 억제되었고, 세포내 에너지 항상성 조절인 자인 AMPK 인산화 수준은 POE 처리 세포에서 대조세포에 비하여 유의적인 수준(p<0.05)으로 증가하였다.
- 본 실험에서 POE 처리가 지방축적을 저해할 뿐만 아니라, 체내 에너지 항상성 조절에 대한 영향을 확인하기 위하여 지방세포인 3T3-L1 세포에서 western blot을 통해 지방세포의 분화 초기전사인자인 C/EBPα , PPARγ 의 발현 억제를 통하여 지방분화 억제에도 관여한다고 보여진다. AMPK 인산화 발현 정도를 측정한 결과, 대조세포에 비하여 POE 처리 세포 에서 AMPK 인산화 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이상의 결과를 종합하여 보면, POE 처리가 3T3-L1 지방세포에서 중성지방 생성 및 축적을 억제시키고, AMPK 인산화 수준을 증가시킴으로서 세포내 에너지 항상성을 유지 시키므로 혈액 내 포도당 이용의 증가를 통해 혈당강하 효과가 있음을 확인함으로써 POE는 비만 뿐 만 아니라 제2형 당뇨병을 효과적으로 예방하거나 개선시킬 수 있을 소재로 활용될수 있을 것으로 사료된다.
- POE 처리로 지방분화 및 지방축적에 미치는 영향을 조사하기 위해서 oil-red O 염색법으로 세포 내 지방입자의 크기를 관찰한 결과, 0.2 mg/ml의 농도에서 둥굴레 추출물의 지방축적 억제 정도는 둥굴레 추출물을 처리하지 않고 용매만 처리한 대조세포에 비하여 유의적 수준(p<0.05)의 억제효과를 나타냈다(Fig. 3).
- 2 mg/ml 처리농도는 천연물 추출 효능검정 실험에서 통상적으로 처리하는 농도로 전 등 25) 의 논문을 참고하였다. 결과 3T3-L1 지방세포에서 대조세포에 비해 둥굴레 처리 지방세포에서 지방생성 및 지방축적이 억제되었다. 중성지방은 영양상태, 또는 다양한 호르몬 (글루코콜티코이드, 에피네프린, 글루카곤 등)의 자극에 의해 지방세포 내의 HSL (hormone sensitive lipase)이 활성화되어 지방산과 글리세롤로 분해되어 분비되는데 이때 분비되는 지방산이나 글리세롤의 수준으로 지방세포내의 지방분해 정도를 알 수 있다26).
- 그 결과, 3T3-L1 지방세포가 분화하는 동안 POE 처리 세포는 둥굴레 추출물을 처리하지 않고 용매만 처리한 대조세포에 비하여 세포 내의 에너지 상태와 관련 있는 AMPK 인산화 활성 뿐 만 아니라 초기 지방세포 분화 및 지방합성 관련인자인 C/EBPα , PPARγ의 발현이 유의적인 수준(p<0.05)으로 억제되었다(Fig. 4).
- 폴리페놀과 플라보노이드는 식물이 갖고 있는 생리활성물질로 항산화 활성을 포함 하는 다양한 기능을 나타낸다. 둥굴레 ethyl acetate 분획 추출물의 경우에도 높은 DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 양이온 소거능을 나타냈으며, FRAP 활성 측정결과 총항산화력 역시 높은 수치를 보였다. 따라서 둥글레 ethyl acetate 분획추출물의 항산화능이 확인된 둥굴레 추출물이 지방세포분화 및 지방축적 억제 효과를 나타 낼 것으로 예상되어 3T3-L1 지방세포의 세포생존율과 세포에 영향을 미치지 않는 0.
- PPARγ와 C/EBPα는 인슐린 신호전달과 관련된 유전자의 발현과 성숙한 지방세포에서 포도당과 지질대사를 조절하여 분화를 더욱 촉진시켜 분화과정을 완성시킨다29). 따라서 0.2 mg/ml POE 처리한 3T3-L1 분화지방세포에서 이들 단백질 발현의 유의적 감소 결과는 둥굴레 추출물이 지방세포에서 발현을 억제 하여 지방축적 및 지방분화를 억제하는 것으로 보인다. 이전의 한약을 이용한 연구보고에서 C/EBPα , PPARγ 발현억제가 지방세포분화능을 감소시켜 비만억제에 효과적이라고 보고된바 있어 본 연구와도 일치하는 결과이다30,31).
- 본 실험에서 POE 처리가 지방축적을 저해할 뿐만 아니라, 체내 에너지 항상성 조절에 대한 영향을 확인하기 위하여 지방세포인 3T3-L1 세포에서 western blot을 통해 지방세포의 분화 초기전사인자인 C/EBPα , PPARγ 의 발현 억제를 통하여 지방분화 억제에도 관여한다고 보여진다.
- 증자 둥굴레의 ethyl acetate 분획 추출물에는 폴리페놀과 플라보노이드가 존재하는 것으로 나타났다. Gallic acid와 rutin을 각각 표준물질로 사용하였다.
- 증자 둥굴레의 ethyl acetate 추출 물의 총 폴리페놀 함량은 50.83±1.52 GAE mg/100g dry weight, 플라보노이드 함량은 17.05±2.47 RE mg/100 g dry weight 으로 각각 나타났다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합하여 보면, POE 처리가 3T3-L1 지방세포에서 중성지방 생성 및 축적을 억제시키고, AMPK 인산화 수준을 증가시킴으로서 세포내 에너지 항상성을 유지 시키므로 혈액 내 포도당 이용의 증가를 통해 혈당강하 효과가 있음을 확인함으로써 POE는 비만 뿐 만 아니라 제2형 당뇨병을 효과적으로 예방하거나 개선시킬 수 있을 소재로 활용될수 있을 것으로 사료된다. 그러나 앞으로 더 세부적인 기전 연구 및 동물실험 등의 추가연구가 뒷받침 되어야 할 것으로 생각된다.
- AMPK 인산화 발현 정도를 측정한 결과, 대조세포에 비하여 POE 처리 세포 에서 AMPK 인산화 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이상의 결과를 종합하여 보면, POE 처리가 3T3-L1 지방세포에서 중성지방 생성 및 축적을 억제시키고, AMPK 인산화 수준을 증가시킴으로서 세포내 에너지 항상성을 유지 시키므로 혈액 내 포도당 이용의 증가를 통해 혈당강하 효과가 있음을 확인함으로써 POE는 비만 뿐 만 아니라 제2형 당뇨병을 효과적으로 예방하거나 개선시킬 수 있을 소재로 활용될수 있을 것으로 사료된다. 그러나 앞으로 더 세부적인 기전 연구 및 동물실험 등의 추가연구가 뒷받침 되어야 할 것으로 생각된다.
- 이상의 결과에서 증자 둥굴레 추출물(POE)의 우수한 항산 화력을 관찰 할 수 있었을 뿐만 아니라 지방세포 3T3-L1 에서 초기 지방세포 분화 관련인자인 PPARγ과 C/EBPα의 발현억제 및 AMPK의 인산화 증가로 지방세포의 분화 억제 및 3T3-L1 세포내 지방합성 억제 효과가 관찰되어 항비만 예방 및 치료에 대한 후보 약물로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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