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문제 정의
- 본 연구는 배암차즈기 에탄올 추출물(SPE)을 유효성분으로 함유하는 지방 생성 및 축적 저해 효능을 조사하였다.
- 본 연구는 배암차즈기 에탄올 추출물이 지방의 축적 억제 및 지방합성 관련 유전자의 mRNA, DNA 발현을 조절하여 비만 예방, 개선 또는 치료용 천연물을 발굴하기 위해 3T3- L1 전지방세포에서 지방세포로 성숙되는 과정에서 지방세포의 분화와 성숙단계에서 분화를 조절하는 유전자 CCAAT/ enhancer-binding protein-alpha(C/EBPα), peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ), sterol regulatory element-binding protein(SREBP-1c)과 지방세포의 성숙단계에서 지방합성 및 억제에 관여하는 유전자 phosphorylation of AMP-activated protein kinase (pAMPK), phosphorylation of acetyl CoA carboxylase (pACC), carnitine palmitoyltransferase-1 activity(CPT- 1), hormone-sensitive lipase(HSL), fatty acid synthase (FAS)의 전사유전자 발현과 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 3T3-L1 세포를 96-well plate에 2×106 cells/mL로 분주하여 안정화한 후 SPE를 농도별로 처리하여 24시간 배양한 다음 배지를 제거하고 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)- 2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT) 시약을 0.5 mg/mL 농도로 첨가하여 37°C, 5% CO2 항온기에서 2시간 반응시킨 후 배지는 제거하고 DMSO로 불용성 결정을 용해시킨 다음 ELISA reader(TECAN Austria GmbH, Grödig, Austria)로 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 8일 동안 배양한 다음에 전지방세포(preadipocyte)를 분화유도 배양액인 10% fetal bovine serum(FBS, Sigma- Aldrich Co.)을 함유한 DMEM 배지(2 μg/mL insulin, 0.5 mM isobutylmethylxanthine, 2 μM dexamethasone 첨가)로 옮겨 SPE를 처리하여 48시간 배양하였다.
- Densitometry was performed using L Process and Multi Gauge software (Version 2.01, Fujifilm), and repre-sent the average densitometric analyses as compared with β-actin.
- SPE 처리 3T3-L1 세포에서 단백질을 분리하여 지방세포 분화 및 지방 생성 관련 단백질의 발현 변화를 western blot으로 분석하기 위해 시료처리가 끝난 배양세포에 차가운 단백질 lysis RIPA buffer를 첨가하여 균질화시켜 4°C에서 30분간 반응시킨 후 원심분리 하여 그 상층액의 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 정량하여 단백질 시료를 만든 다음, 8~10% SDS-PAGE를 분리한 후 PVDF membrane으로 transfer 시켰다. Membrane을 상온에서 5%(w/v) nonfat dry milk를 함유한 TBS-T(0.1% Tween 20 in TBS)에서 1시간 in-cubation 하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 TBS-T로 15분 세척하였다. 준비된 막에 1차 대상 단백질[pAMPK, pACC, SREBP-1c, C/EBPα, PPARγ, CPT-1, FAS, HSL(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), Table 2]의 1차 항체와 horseradish perox-idase가 부착된 2차 항체로 각각 처리한 다음 membrane 수세 후 ECL(Amersham Life Science Corp.
- PCR 반응은 94°C에서 1분간 1 cycle 반응 후 94°C 45초, 58°C 45초간, 72°C 1분간 40회 반복 반응시켰으며, 72°C에서 10분간 extension을 시행한 후 반응을 완료하여 증폭된 산물은 1.5% agarose gel에 전기영동하고 ethidium bromide(Et-Br, Sigma-Al-drich Co.)로 염색한 후, Gel Doc(Vilber Lourmet, Marne- la-Vallaee Cedex, France)을 이용하여 DNA band를 확인하였다.
- SPE 30 μg/mL 농도로 처리된 3T3-L1 분화세포를 D-PBS(DPBS, SH30028.03)로 세척한 후 mRNA 양을 측정하기 위해 RNeasy(Qiagen Sciences Inc., Gaithers-burg, MD, USA) 시약으로 총 RNA를 추출하고 정량하여 SuperScriptTM First-Stand Synthesis system(Invitro-gen Life Technologies, Rockville, MD, USA)을 이용하여 2 μg RNA로 역전사(reverse transcription, RT)를 수행하였다.
- )로 염색한 후, Gel Doc(Vilber Lourmet, Marne- la-Vallaee Cedex, France)을 이용하여 DNA band를 확인하였다. mRNA 발현량은 L Process(Version 2.01, Fuji-film, Stamford, CT, USA)와 Multi Gaugesoftware(Ver-sion 2.01, Fujifilm)를 이용하여 정량하였다.
- 따라서 세포생존율 91%로 세포독성을 유발하지 않는 농도인 30 μg/mL의 농도에서 이후 실험을 수행하였다.
- 배암차즈기 에탄올 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 24시간 동안 SPE를 각각 농도별(0.1, 1, 10, 25, 50, 100, 200, 500 μg/mL)로 처리한 후 MTT assay를 실시하여 세포생존도 변화를 측정하였다.
- 열풍건조 한 시료는 분쇄기(SMX-4OOODY, Shinil, Seoul, Korea)로 분쇄하여 -80°C deep freezer (MDF-U53V, Sanyo, Osaka, Japan)에 동결 보관하면서 추출물 제조에 사용하였다. 분쇄한 시료를 각각 20 g씩 정량하고 400 mL의 70% 에탄올로 heating mentles(WHM 12295, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Korea)을 이용하여 에탄올 추출물을 제조하였다. 추출은 70°C에서 3시간 동안 1시간씩 3회 반복 추출하여, filter paper로 여과한 후 감압농축(H-1000VW, NVC-2100, SB-1000, Eyela, Tokyo, Japan) 하여 농축된 시료를 -80°C에서 동결건조(FDU-2100, Eyela) 하여 배암차즈기 에탄올 추출물(SPE)을 제조하였다.
- 비대지방세포로 유도된 3T3-L1에 SPE가 지방 축적에 미치는 효과를 Oil Red O 용액으로 염색하여 지방세포의 염색 정도로 확인하였으며, 그 결과는 Fig. 2에 나타내었다. Oil Red O 염색은 지방 세포 내 축적된 지방구의 중성지방을 붉은색으로 염색하여 세포의 붉은색 정도를 통해 분화 정도를 시각화할 수 있다.
- )로 염색하였다. 세포 염색이 끝난 후 40% isopropyl alcohol(2-propanol, 67-63-0)로 3번 세척한 다음 건조하여 세포 내 염색된 지방구의 크기를 광학현미경(Motic AE 31, Viking Way Richmond, British Columbia, Canada)으로 관찰하였으며, 염색된 지방세포의 지방 함량을 측정하기 위하여 100% isopropyl alcohol로 지방을 추출하여 분광광도계(Lambda 45, Perkin Elmer UV/VIS, Shelton, CT, USA)로 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 01, Fujifilm)를 이용하여 정량 분석하였다. 이때 양성대조물질로 라스베라톨(Sigma-Aldrich Co.)을 같은 조건으로 처리하여 비교하였다.
- 이틀 후 30 μg SPE/2 μg 인슐린/mL 10% FBS･DMEM 배지에서 48시간 더 배양한 다음에 10% FBS･DMEM 배지에서 96시간 동안 배양하여 성숙한 지방세포(adipocytes)에서 RNA와 단백질을 분리하여 유전자의 발현 변화를 측정하였다.
- 준비된 막에 1차 대상 단백질[pAMPK, pACC, SREBP-1c, C/EBPα, PPARγ, CPT-1, FAS, HSL(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), Table 2]의 1차 항체와 horseradish perox-idase가 부착된 2차 항체로 각각 처리한 다음 membrane 수세 후 ECL(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA) detection 시약으로 각각 단백질 발현량은 L Process(Version 2.01, Fujifilm)와 Multi Gauge software(Version 2.01, Fujifilm)를 이용하여 정량 분석하였다.
- 지상부는 이물질 제거 및 수세 후 열풍건조기(SH-FDO 150, Samheung, Sejong, Korea)로 45°C에서 12시간 동안 열풍건조 하였다.
- 추출은 70°C에서 3시간 동안 1시간씩 3회 반복 추출하여, filter paper로 여과한 후 감압농축(H-1000VW, NVC-2100, SB-1000, Eyela, Tokyo, Japan) 하여 농축된 시료를 -80°C에서 동결건조(FDU-2100, Eyela) 하여 배암차즈기 에탄올 추출물(SPE)을 제조하였다.
- 합성된 RT product(template cDNA)에 2.5 mM dNTP, 10× buffer, DEPC water, premixed primer(Geno-Tech, Daejeon, Korea) 및 Taq DNA polymerase를 넣고 Mastercycler gradient(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였다.
대상 데이터
- 3T3-L1 마우스 유래 배아섬유아세포(mouse embryo fibroblast)는 미국세포주은행(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 먼저 10% bovine calf serum(BCS, Sigma- Aldrich Co.
- 본 실험에 사용된 배암차즈기(Salvia plebeia R. Br.)는 전라남도 구례군농업기술센터 친환경시험장(위도 127°26′30″, 경도 35°14′25″) 노지에서 재배된 것으로 3월 중순에 길이 10~20 cm의 것을 채취하여 지상부를 사용하였다.
- 열풍건조 한 시료는 분쇄기(SMX-4OOODY, Shinil, Seoul, Korea)로 분쇄하여 -80°C deep freezer (MDF-U53V, Sanyo, Osaka, Japan)에 동결 보관하면서 추출물 제조에 사용하였다.
데이터처리
- Student’s t-test was performed using GraphPad Prism 5 program.
- 실험 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었고, 통계적 유의성은 GraphPad Prism 5 program(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)의 Student’s t-test를 이용하여 P 값이 0.05 미만(P<0.05)인 경우에 유의한 것으로 인정하였으며, 대조군과의 통계학적 유의성(*)을 각각 표기하였다.
성능/효과
- 또한, PPARγ, C/EBPα, SREBP-1c, pACC, pAMPK, CPT-1, 지방산 합성효소(FAS, fatty acid synthase) 발현 억제, 호르몬자극지방분해효소(HSL, hormone sensitivity lipa-se) 활성화 등 지방합성 관련인자들의 발현을 조절하는 효능을 보유하고 있는 것으로 확인되었다.
- 반대로 호르몬자극지방분해효소(HSL) 유전자 발현과 활성은 SPE의 처리 세포에서 유의적 증가를 보여 지방분해 효과를 나타내었다. AMPK와 ACC 유전자 전사량과 인산화 단백질 활성은 대조세포와 비교해서 유의적으로 증가를 나타내었다. AMPK는 세포 내 항상성 유지역할을 하는 효소(26)로 이것의 활성화는 포도당 및 지방산 산화 증가와 간에서 지방합성과 포도당 신생억제, 췌장에서 인슐린 분비조절을 하는 중요한 매개인자로 작용한다.
- 현미경을 통한 관찰을 통해 대조군의 세포에 비해서 SPE 처리군에서 30%로 유의적으로 세포 분화 억제와 지방 축적 감소 효과를 확인할 수 있으며, 양성대조군인 35 μM fenofibrate 처리세포 35%와도 비슷한 수준을 나타내었다. Isopropyl alcohol로 염색된 지방구의 중성지방량 측정 결과에서도 대조군에 비해 SPE 처리군에서 지방축적 감소가 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 따라서 SPE는 지방세포의 분화 억제와 지방세포의 중성지방 축적을 감소시키는 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.
- SPE의 PPARγ, C/EBPα 유전자 전사량과 단백질 발현 억제활성을 확인한 결과, SPE 처리 세포에서 대조세포에 비해 PPARγ, C/EBPα 발현이 유의적으로 감소를 나타내어 SPE가 지방세포에서 지방분화 및 지방축적을 억제하는 것으로 보인다.
- 경엽 30, 50, 70%와 전초의 모든 추출물 200 μg/mL 처리 농도에서 세포독성을 나타내지 않는 것으로 보고되어, 추출부위와 추출온도, 추출시간 등에 따라 세포독성을 나타내는 추출물의 농도가 달라지는 것을 확인할 수 있었다.
- 구절초 메탄올 추출물(18)을 50~500 μg/mL의 시료 처리 범위에서 농도 의존적으로 지방세포 형성을 감소하였으며, 300, 400, 500 μg/mL의 처리군에서 각각 35, 61, 68%의 억제능을, 비타민나무 잎(19)은 25, 50, 100 μg/mL 처리군이 각각 20.76, 45.29, 82.25%로 중성지방 축적을 억제하는 것으로 나타나 SPE가 구절초 메탄올 추출물과 비타민나무 잎보다 지방 생성 억제능이 높은 것을 확인할 수 있었다.
- 그 결과 Fig. 1과 같이 대조군(Control)보다 SPE 처리 농도에 의존적으로 지방세포의 생존율이 감소하였으며, 50 μg/mL 이상의 농도에서는 통계적으로 유의한 세포독성이 나타나는 것을 확인하였다.
- ACC 인산화 증가는 지방산 베타산화를 활성화시키는 CPT-1의 발현을 증가시키므로 포화지방산의 미토콘트리아 안으로 유입이 증가하고 일련의 지방산 산화가 일어나므로 지방축적은 감소하고 인슐린 민감도는 증가한다(28,29). 따라서 SPE 처리 시 CPT-1의 유의적 증가는 SPE가 지방세포에서의 지방합성 억제효과가 있음을 알 수 있었다. 식방풍 추출물 처리 시 C/EBPα, FABP4, FAS 등 모든 유전자에서 농도 의존적으로 발현이 감소하였으며, PPARγ는 250 μg/mL 농도에서부터 유의적으로 유전자 발현의 억제 효능을 보였다(30).
- Isopropyl alcohol로 염색된 지방구의 중성지방량 측정 결과에서도 대조군에 비해 SPE 처리군에서 지방축적 감소가 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 따라서 SPE는 지방세포의 분화 억제와 지방세포의 중성지방 축적을 감소시키는 효과가 뛰어남을 알 수 있었다. 구절초 메탄올 추출물(18)을 50~500 μg/mL의 시료 처리 범위에서 농도 의존적으로 지방세포 형성을 감소하였으며, 300, 400, 500 μg/mL의 처리군에서 각각 35, 61, 68%의 억제능을, 비타민나무 잎(19)은 25, 50, 100 μg/mL 처리군이 각각 20.
- 배암차즈기 에탄올 추출물은 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryo fibroblast) 유래 지방세포인 3T3-L1에서 지방세포 분화를 억제하는 효능을 보유하고 있었으며, 지방세포내 중성지방의 농도를 감소시키는 효능을 보유하고 있었다.
- 이상의 결과를 종합하면 3T3-L1 지방세포에서 SPE 처리 시 지방분화 초기 전사인자인 PPARγ, C/EBPα의 발현을 조절하여 이들 전사인자의 타깃 유전자로 알려진 SREBPc1, FAS의 발현을 조절하여 지방세포의 분화억제와 지방합성을 억제할 뿐만 아니라 AMPK 인산화 단백질 발현 증가로 지방세포에서의 지방합성 관련 효소 단백질인 ACC 불활성을 증가시키고, 증가된 ACC 불활성화는 미토콘트리아 내 지방산 산화를 활성화하는 CPT-1을 활성화시키므로 지방축적을 억제시킬 것으로 생각된다.
- 현미경을 통한 관찰을 통해 대조군의 세포에 비해서 SPE 처리군에서 30%로 유의적으로 세포 분화 억제와 지방 축적 감소 효과를 확인할 수 있으며, 양성대조군인 35 μM fenofibrate 처리세포 35%와도 비슷한 수준을 나타내었다.
후속연구
- 또한, PPARγ, C/EBPα, SREBP-1c, pACC, pAMPK, CPT-1, 지방산 합성효소(FAS, fatty acid synthase) 발현 억제, 호르몬자극지방분해효소(HSL, hormone sensitivity lipa-se) 활성화 등 지방합성 관련인자들의 발현을 조절하는 효능을 보유하고 있는 것으로 확인되었다. 이상의 결과로 SPE가 지방세포 분화 및 지방대사에 관련된 인자들의 발현을 조절함으로써 지방 생성 및 지방 축적을 저해하는 효능을 보유하기 때문에 배암차즈기를 활용한 비만 개선을 위한 소재로서의 활용이 가능할 것으로 보인다.
- 현재 배암차즈기의 항비만 활성 물질에 대한 보고가 없어 추가적으로 물질규명 및 분자수준의 대사적 검정을 위해 동물실험이 필요할 것으로 본다.
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