[논문]국산 생약 추출물의 항염증 활성 스크리닝

안상미; 김형건; 최은정; 황형훈; 이은석; 백지훈; 부용출; 고재숙

doi:10.15230/scsk.2014.40.1.95

국산 생약 추출물의 항염증 활성 스크리닝
Screening for Anti-inflammatory Activities in Extracts from Korean Herb Medicines 원문보기

大韓化粧品學會誌 = Journal of the society of cosmetic scientists of Korea, v.40 no.1, 2014년, pp.95 - 108

안상미 ((주)더마프로 피부과학연구소) , 김형건 ((주)더마프로 피부과학연구소) , 최은정 ((주)더마프로 피부과학연구소) , 황형훈 ((주)더마프로 피부과학연구소) , 이은석 ((주)더마프로 피부과학연구소) , 백지훈 ((주)더마프로 피부과학연구소) , 부용출 (경북대학교 의학전문대학원 분자의학교실 세포기질연구소) , 고재숙 ((주)더마프로 피부과학연구소)

초록
AI-Helper

화장품은 일반인이 장기간 연용하는 제품으로 인체 피부에 대한 안전성이 매우 중요하다. 화장품에 의한 접촉피부염은 자극성 물질이 피부에 접촉 후 침투하여 유발하는 염증반응으로 활성화된 면역세포에서 염증을 매개하는 다양한 인자를 분비함으로써 시작된다. 본 연구에서는 국산 생약 추출물을 이용하여 RAW264.7 대식 세포에서 염증 관련 인자에 대한 영향을 통해 항염증 활성을 스크리닝 하였다. 51종의 국산 생약 추출물 중 측백, 측백엽(초), 향부자, 형개, 동과자, 산약, 산약(초), 상지, 송절, 택사의 에탄올 추출물 10종이 lipopolysaccharide(LPS)에 의해 유도된 세포독성을 감소시킴과 동시에 염증 관련 인자인 Nitric oxide (NO), interleukin (IL)-1${\beta}$, IL-6, tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$의 생성을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 이들 생약 추출물은 인체피부에서도 자극을 유발하지 않음을 인체 첩포시험을 통해 검증하였다. 따라서, 항염증 활성이 확인된 10종 국산 생약 추출물은 피부 자극을 예방할 수 있는 화장품 소재로서의 활용이 가능할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Cosmetics are products used over long periods by the public, and their safety is very important. Contact dermatitis induced by cosmetics is the result of an inflammatory response of the skin to direct irritancy. The initial event that this inflammatory response is observed is the release of pro-inflammatory cytokines. In this study, the anti-inflammatory activities of extracts from Korean herb medicines were investigated using RAW264.7 macrophage. Among the fifty one extracts tested, the ethanol extracts from Biotae Orientalis Folium, Biotae Orientalis Folium (roasted), Cyperi Rhizoma, Nepetae Spica, Benincasae Semen, Dioscoreae Rhizoma, Dioscoreae Rhizoma (roasted), Mori Ramulus, Pini Ramulus and Alismatis Rhizoma reduced the cytotoxicity and inhibited the productions of Nitric oxide (NO) and cytokines such as interleukin (IL)-1${\beta}$, IL-6 and tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$n lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW264.7 macrophage. Additionally, they didn't induce the skin irritation when tested the human patch test. Overall, the result of this study suggests that the extracts of the ten Korean herb medicines are useful cosmetic agents for preventing the skin irritation.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

또한, 자극의 강도는 자극원이 피부의 각질층을 투과하는 정도와 살아있는 세포에 대한 세포 독성 정도에 따라 결정된다. 따라서, 본 시험에서는 국산 약용식물 51종을 대상으로 대식세포에서 세포에 대한 독성과 염증 유발 인자에 대한 억제 효과를 측정하여 항염증 효과를 스크리닝하고 항염증 효과가 나타난 10종에 대해 인체 첩포시험을 통해 피부 자극 정도를 검증하였다.
따라서, 본 연구에서는 국산 생약 추출물을 통해 염증 매개물질인 NO, IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성을 억제하여 피부 자극반응을 예방할 수 있는 화장품 소재로서 가능성을 검토하고자 하였다.

제안 방법

24 h 후 세포 배양 상층액을 회수하여 ELISA Kit을 이용하여 상층액에 포함된 IL-1β, IL-6, TNF-α의 함량을 측정하였다.
먼저, 첩포부위인 등 부위를 70% 에탄올로 소독한 후 시험물질 20 µL가 적용된 IQ chamber (Chemotechnique Diagnostics AB, Sweden)를 첩포하였다. 48 h 후 첩포를 제거하고 skin marker (Chemotechnique Diagnostics AB, Sweden)로 시험부위를 표시하였으며, 30 min, 24 h 후에 각 시험 부위를 평가하였다. 평가 기준은 Table 2에 제시한 CTFA 가이드라인[20]의 판정기준에 따랐으며, 2회에 걸쳐 평가한 피부 반응은 다음 식을 통해 평균 반응도를 계산하였다.
51종의 국산 생약 추출물의 세포 독성을 알아보기 위하여 RAW264.7 대식세포에 각 생약 추출물을 50 µg/mL의 농도로 처리하고 24 h 후 세포 생존율을 측정하였다.
51종의 생약 추출물의 NO 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 RAW264.7 대식세포에 LPS를 200 ng/mL의 농도로 처리하여 자극한 후, 각 생약 추출물을 50 µg/mL의 농도로 처리하였다.
Cytokine 측정을 위하여 사용된 Mouse IL-1β ELISA Kit는 Life technologies (InvitrogenTM, USA)에서 구입하였고, OptEIATM Mouse IL-6 ELISA Kit과 OptEIATM Mouse TNF-α ELISA Kit은 BD Bioscience (USA)에서 구입하였다.
NO 생성량은 Griess 시약을 이용한 Nitrite/Nitrate Assay Kit (SIGMA, USA)을 통해 세포 배양액 내 존재하는 NO의 안정된 산화물인 NO₂^-를 측정하여 분석하였다. RAW264.
in vitro 항염증 활성 스크리닝 결과 효과적인 항염증 활성을 보인 10종의 생약 추출물에 대해 인체피부 에서의 피부자극 정도를 평가하기 위하여 인체 첩포 시험을 실시하였다. 0.
세포 배양 상층액 100 µL와 Griess 시약 100 µL를 혼합하여 96-well plate에서 10 min 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 NaNO₂를 이용하여 표준곡선을 구하여 정량하였다.
먼저, 첩포부위인 등 부위를 70% 에탄올로 소독한 후 시험물질 20 µL가 적용된 IQ chamber (Chemotechnique Diagnostics AB, Sweden)를 첩포하였다.
5 h)을 통해 추출되었다. 모든 생약시료는 추출 후 여과, 농축, 건조과정을 거쳐 조제되었다(Table 1).
발색기질은 TMB (3,3´,5,5´-tetramethylbenzidine)를 사용하였고 재조합된 IL-1β, IL-6, TNF-α를 희석하여 표준곡선을 구하여 정량하였다.
세포 생존율은 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 보라색 formazan으로 환원되는 MTT의 원리를 이용하여 분석하였다[16]. RAW264.
세포는 LPS (200 ng/mL)로 자극시키거나 혹은 자극시키지 않은 상태에서 최종 50 µg/mL의 농도로 각 생약 추출물을 처리하고 세포를 다시 24 h 배양 후, 0.5% MTT 용액을 각 well에 100 µL씩 첨가하여, 4 h 동안 배양하였다.
이 세가지 cytokine에 대한 51종 생약 추출물의 영향을 알아보기 위하여 RAW264.7대 식세포에 LPS를 200 ng/mL의 농도로 처리하여 자극 시킨 후, 각 생약 추출물을 50 µg/mL의 농도로 처리하였다.
7 대식세포는 LPS에 의해 세포 생존율이 감소한다고 보고되어 있다[21]. 이러한 염증성 유발 모델에서 생약 추출물의 세포 생존율에 대한 영향을 측정하였다. 시험 결과, 죽엽, 측백, 측백엽(초), 향부자, 백단향, 상지, 송절, 편축, 포도등, 흑두의 에탄올 추출물과 초오, 대추, 송화분의 증류수 추출물은 LPS에 의해 유도된 세포 독성을 억제하는 효과를 보였으며, 특히, 죽엽, 백단향, 상지, 포도등의 에탄올 추출물과 초오, 대추, 송화분의 증류수 추출물은 LPS에 의한 자극 유무에 상관없이 세포 생존율을 증가시키는 것으로 나타났다(Table 3).
측정법을 간단하게 요약하면, IL-1β, IL-6, TNF-α에 특이적인 단일항체로 코팅된 96-well plate에 세포 배양 상층액을 첨가하여 2 h 반응시킨 후 biotin이 결합된 IL-1β, IL-6, TNF-α 단일항체와 streptavidin이 결합된 peroxidase를 차례로 넣어 검출한다.

대상 데이터

Fetal bovine serum (FBS), Antibiotic-Antimycotic, RPMI 1640, Trypsin-EDTA 등의 세포 배양용 시약들은 Life technologies(Gibco^Ⓡ, USA)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 시약 중 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), Lipopolysaccharide (LPS), Dimethyl sulfoxide (DMSO), Squalane은 SIGMA (USA)에서 구입하였다.
RAW264.7 대식세포는 ATCC (CRL-2278TM, USA)에서 구입하여 37 ℃, 5% CO2조건하에서 10% FBS와 1% Antibiotic-Antimycotic (10 units/mL penicillin, 100 µg/mL sterptomycin, 0.25 µg/mL amphotericin)이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
본 시험에 사용된 국산 생약 추출물은 한국생명공학연구원/한국식물추출물은행에서 구입하여 사용하였다. 총 51종의 식물 추출물 중 26종은 95.
, USA)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 시약 중 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), Lipopolysaccharide (LPS), Dimethyl sulfoxide (DMSO), Squalane은 SIGMA (USA)에서 구입하였다. Cytokine 측정을 위하여 사용된 Mouse IL-1β ELISA Kit는 Life technologies (Invitrogen^TM, USA)에서 구입하였고, OptEIA^TM Mouse IL-6 ELISA Kit과 OptEIA^TM Mouse TNF-α ELISA Kit은 BD Bioscience (USA)에서 구입하였다.
인체 첩포시험은 헬싱키 선언에 근거한 윤리규정[17] 및 식품의약품안전처 화장품 인체적용시험가이 드라인[18]에 따라 실시되었으며, Frosch & Kligman이 고안한 방법[19]을 응용하여 특정 피부질환 및 알레르기가 없는 20세~47세의 건강한 여성 피험자 33명(평균연령 35.4 ± 9.3세)을 대상으로 실시하였다.

데이터처리

Values are significantly different by one-way ANOVA test (p < 0.05, *vs Control, † vs VC with LPS).
Values are significantly different by one-way ANOVA test (p <0.05, *vs VC without LPS, † vs VC with LPS).
인체 첩포시험을 제외한 모든 실험은 최소 3회 이상 반복 실험에 대한 평균 ± 표준편차(mean ± SD)로 나타냈으며, 통계학적 분석은 SPSS version (IBM, USA)를 이용하여 one-way analysis of variance (ANOVA)를 시행하여 p < 0.05인 경우 유의한 것으로 판정하였다.

이론/모형

48 h 후 첩포를 제거하고 skin marker (Chemotechnique Diagnostics AB, Sweden)로 시험부위를 표시하였으며, 30 min, 24 h 후에 각 시험 부위를 평가하였다. 평가 기준은 Table 2에 제시한 CTFA 가이드라인[20]의 판정기준에 따랐으며, 2회에 걸쳐 평가한 피부 반응은 다음 식을 통해 평균 반응도를 계산하였다.

성능/효과

in vitro 항염증 활성 스크리닝 결과 효과적인 항염증 활성을 보인 10종의 생약 추출물에 대해 인체피부 에서의 피부자극 정도를 평가하기 위하여 인체 첩포 시험을 실시하였다. 0.5% 농도로 적용한 생약 추출물 중 산약의 에탄올 추출물을 제외한 9종의 생약 추출물은 33명의 피험자에서 모두 음성반응을 보였다. 산약의 에탄올 추출물은 1명의 피험자에서 경미한 홍반 반응인 grade 1의 피부반응을 유도하여 반응도 0.
결과적으로, 국산 생약 추출물 51종을 대상으로 항염증 활성을 스크리닝한 결과, 측백, 측백엽(초), 향부자, 형개, 동과자, 산약, 산약(초), 상지, 송절, 택사의 에탄올 추출물 10종이 RAW264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 세포독성을 감소시킴과 동시에 염증 매개 물질인 NO, IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성을 억제하는 것으로 나타났다.
결과적으로, 측백, 측백엽(초), 향부자, 형개, 동과자, 산약, 산약(초), 상지, 송절, 택사의 에탄올 추출물은 RAW264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 세포 독성과 염증 매개 물질인 NO, IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성을 억제하는 것으로 나타나 효과적인 항염증 활성을 보여주었고 인체 피부에서 자극도 일으키지 않는 것을 확인하였다.
7 대식세포에 LPS를 200 ng/mL의 농도로 처리하여 자극한 후, 각 생약 추출물을 50 µg/mL의 농도로 처리하였다. 시험 결과, 51종 생약 추출물 모두 NO의 생성을 증가시키지 않았다. 하지만, 죽엽, 천궁, 측백, 측백엽(초), 치자(초), 향부자, 형개, 동과자, 백단향, 산약, 산약(초), 상지, 송절, 택란, 택사, 편축, 포도등, 홍화자, 흑두의 에탄올 추출물과 강활, 권백, 백출의 증류수 추출물은 LPS에 의해 증가된 NO 생성량을 효과적으로 감소시켰다(Table 4).
7 대식세포에 각 생약 추출물을 50 µg/mL의 농도로 처리하고 24 h 후 세포 생존율을 측정하였다. 시험 결과, 51종 식물 추출물 중 남성과 건강의 에탄올 추출물이 세포 독성을 보였고, 그 외 나머지 49종 생약 추출물은 세포 독성을 보이지 않았다 (Table 2). 한편, LPS를 처리하여 자극시킨 RAW264.
시험 결과, 염증성 모델에서 전호, 택란, 편축, 포도등을 제외한 모든 에탄올 추출물과 옥죽, 초오, 대추, 목통의 증류수 추출물은 LPS에 의해 유도된 IL-1β의 생성을 유의적으로 감소시켰다.
이러한 염증성 유발 모델에서 생약 추출물의 세포 생존율에 대한 영향을 측정하였다. 시험 결과, 죽엽, 측백, 측백엽(초), 향부자, 백단향, 상지, 송절, 편축, 포도등, 흑두의 에탄올 추출물과 초오, 대추, 송화분의 증류수 추출물은 LPS에 의해 유도된 세포 독성을 억제하는 효과를 보였으며, 특히, 죽엽, 백단향, 상지, 포도등의 에탄올 추출물과 초오, 대추, 송화분의 증류수 추출물은 LPS에 의한 자극 유무에 상관없이 세포 생존율을 증가시키는 것으로 나타났다(Table 3).
본 시험에 사용된 국산 생약 추출물은 한국생명공학연구원/한국식물추출물은행에서 구입하여 사용하였다. 총 51종의 식물 추출물 중 26종은 95.0% 에탄올로 45 ℃에서 15 min간 초음파 처리 후 상온에서 2 h 정치시키는 과정을 하루에 10회 반복하고 이를 3일간 실시하여 추출되었다. 나머지 25종은 증류수로 전통적인 생약추출방법인 열탕추출(100 ℃, 2.
하지만, 죽엽, 천궁, 측백, 측백엽(초), 치자(초), 향부자, 형개, 동과자, 백단향, 산약, 산약(초), 상지, 송절, 택란, 택사, 편축, 포도등, 홍화자, 흑두의 에탄올 추출물과 강활, 권백, 백출의 증류수 추출물은 LPS에 의해 증가된 NO 생성량을 효과적으로 감소시켰다(Table 4). 특히, 죽엽, 측백, 측백엽(초), 향부자, 백단향, 상지, 송절, 편축, 포도등, 흑두의 에탄올 추출물은 RAW264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 세포독성은 억제하고 동시에 NO의 생성은 효과적으로 감소시켜 항염증 소재로서의 가능성을 보였다(Tables 3, 4).
시험 결과, 51종 생약 추출물 모두 NO의 생성을 증가시키지 않았다. 하지만, 죽엽, 천궁, 측백, 측백엽(초), 치자(초), 향부자, 형개, 동과자, 백단향, 산약, 산약(초), 상지, 송절, 택란, 택사, 편축, 포도등, 홍화자, 흑두의 에탄올 추출물과 강활, 권백, 백출의 증류수 추출물은 LPS에 의해 증가된 NO 생성량을 효과적으로 감소시켰다(Table 4). 특히, 죽엽, 측백, 측백엽(초), 향부자, 백단향, 상지, 송절, 편축, 포도등, 흑두의 에탄올 추출물은 RAW264.

후속연구

결론적으로 본 연구를 통해 항염증 활성이 확인된 10종의 국산 생약 추출물은 인체 피부에 대해 피부 자극을 유발하지 않아 피부에 안전한 화장품 소재임이 입증되었고, 향후 이러한 항염증 활성을 활용하여 피부 장벽이 손상된 시험 모델을 이용하여 피부 장벽에 대한 효과를 검증할 예정이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	생약은 인체의 면역시스템 중 어떤 것에 영향을 주는가?	생약(生藥 Crude drugs)은 의약품의 일종으로 인체에 유익한 동식물의 본체, 뿌리, 줄기 등 천연으로 산출되는 자연물을 날로 또는 일차 가공하여 약으로 사용하는 것으로 단일 성분의 화합물로 된 의약품과는 달리 많은 종류의 성분이 혼재하고 있어 그 효과가 복합적이고 상대적으로 부작용이 적다고 알려져 있고 [11], 그 활성성분은 항산화, 항암, 항균 등 다양한 생리활성이 보고되고 있다[12-15]. 특히, 인체의 면역시스템 중 보체계(complement system)나 면역 관련 cytokine의 조절을 통해 생체방어 시스템을 강화하는데 많은 영향을 준다. 따라서, 본 연구에서는 국산 생약 추출물을 통해 염증 매개물질인 NO, IL-1β, IL-6, TNFα의 생성을 억제하여 피부 자극반응을 예방할 수 있는 화장품 소재로서 가능성을 검토하고자 하였다.
	접촉피부염은 무엇인가?	화장품에 의한 피부 이상반응 중에는 접촉피부염 (Contact Dermatitis)이 가장 흔하게 발생하는데 접촉피부염은 자극성 물질이 피부에 접촉하고 피부를 통해 침투하여 유발하는 염증반응으로 활성화된 면역세포에 의해 일어나는 일련의 반응이다. 염증반응은 면역 세포가 생체의 이물질 등을 인식하여 활성화되고, 활성화된 면역세포에서 염증을 매개하는 많은 인자를 분비함으로써 시작된다[5-7].
	생약은 무엇인가?	생약(生藥 Crude drugs)은 의약품의 일종으로 인체에 유익한 동식물의 본체, 뿌리, 줄기 등 천연으로 산출되는 자연물을 날로 또는 일차 가공하여 약으로 사용하는 것으로 단일 성분의 화합물로 된 의약품과는 달리 많은 종류의 성분이 혼재하고 있어 그 효과가 복합적이고 상대적으로 부작용이 적다고 알려져 있고 [11], 그 활성성분은 항산화, 항암, 항균 등 다양한 생리활성이 보고되고 있다[12-15]. 특히, 인체의 면역시스템 중 보체계(complement system)나 면역 관련 cytokine의 조절을 통해 생체방어 시스템을 강화하는데 많은 영향을 준다.

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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