NF-${\kappa}B$ is a transcriptional factor which is involved in many biological processes including immunity, inflammation, and cell survival. Many investigators studied on the mechanism involved in activation of NF-${\kappa}B$ signalling pathway via ubiquitination and degradat...
NF-${\kappa}B$ is a transcriptional factor which is involved in many biological processes including immunity, inflammation, and cell survival. Many investigators studied on the mechanism involved in activation of NF-${\kappa}B$ signalling pathway via ubiquitination and degradation of $I{\kappa}B$ regarding skin disease. Some specific molecules including Akt, MEK, p38 MAP Kinase, Stat3, et al. represent convergence points and key regulatory proteins in signaling pathways controlling cellular events such as growth and differentiation, energy homeostasis, and the response to stress and inflammation. Ultraviolet (UV) irradiation has many adverse effects on skin, including inflammation, alteration in the extracellular matrix, cellular senescence, apoptosis and skin cancer. Prunus mume, a naturally derived plant extract, has beneficial biological activities as blood fluidity improvement, anti-fatigue action, antioxidative and free radical scavenging activities, inhibiting the motility of Helicobacter pyolri. Previous reports on various beneficial function prompted us to investigate UVB-induced or other immunostimulated biological marker regarding P. mume extract. P. mume extract suppresses UVB-induced cyclooxygenase-2 (COX-2) expression in mouse skin epidermal JB6 P+ cells. The activation of activator protein-1 and nuclear factor-${\kappa}B$ induced by UVB was dose-dependently inhibited by P. mume extract treatment. This results suggest that P. mume extracts might be used as a potential agents for protection of inflammation or UVB induced skin damage.
NF-${\kappa}B$ is a transcriptional factor which is involved in many biological processes including immunity, inflammation, and cell survival. Many investigators studied on the mechanism involved in activation of NF-${\kappa}B$ signalling pathway via ubiquitination and degradation of $I{\kappa}B$ regarding skin disease. Some specific molecules including Akt, MEK, p38 MAP Kinase, Stat3, et al. represent convergence points and key regulatory proteins in signaling pathways controlling cellular events such as growth and differentiation, energy homeostasis, and the response to stress and inflammation. Ultraviolet (UV) irradiation has many adverse effects on skin, including inflammation, alteration in the extracellular matrix, cellular senescence, apoptosis and skin cancer. Prunus mume, a naturally derived plant extract, has beneficial biological activities as blood fluidity improvement, anti-fatigue action, antioxidative and free radical scavenging activities, inhibiting the motility of Helicobacter pyolri. Previous reports on various beneficial function prompted us to investigate UVB-induced or other immunostimulated biological marker regarding P. mume extract. P. mume extract suppresses UVB-induced cyclooxygenase-2 (COX-2) expression in mouse skin epidermal JB6 P+ cells. The activation of activator protein-1 and nuclear factor-${\kappa}B$ induced by UVB was dose-dependently inhibited by P. mume extract treatment. This results suggest that P. mume extracts might be used as a potential agents for protection of inflammation or UVB induced skin damage.
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제안 방법
자세하게 설명하자면, 각 원료를 50% 에탄올 용매로 추출하여 용매를 날리고 잔존물을 얻는다. 1 g의 잔존물에 물 49 g을 넣고 50 g의 1,3 butylene glycol을 넣어 녹여내어 필터링을 한후 나온 여액과 Botanpi (Bot)와 비교하였다. Inhibition rate는 다음과 같이 정의한다.
NF-κB를 중심으로 유관된 세포신호물질 정량을 진행하였다.
TNF-α 20 ng을 처리한 뒤 8시간후 세포를 완전히 녹이고 세포 내의 Luciferase를 추출한후 Luminometer (Luminoskan Ascent; Thermo Electron, USA)를 이용하여 활성을 측정하였다.
본 연구진에서는 스크리닝을 통하여 4종의 한약재를 선별하였고 그 중 오매의 NF-κB 억제능을 확인하였고 또한 NF-κB와 관련된 신호전달물질인 Akt, MEK, p38 MAPK, Stat3의 시간에 따른 증감을 확인하였다.
부가적으로 오매추출물의 UVB에 의한 COX-2, NF-κB, AP-1의 발현 억제 효과를 확인하였다.
TNF-α 20 ng을 처리한 뒤 8시간후 세포를 완전히 녹이고 세포 내의 Luciferase를 추출한후 Luminometer (Luminoskan Ascent; Thermo Electron, USA)를 이용하여 활성을 측정하였다. 상용화되어있는 Botanpi (Ichimaru Pharcos, Japan)와 활성 비교를 위해서 오매, 창출, 승마, 고삼을 Botanpi Liquid 제조방법과 동일하게 하였다. 자세하게 설명하자면, 각 원료를 50% 에탄올 용매로 추출하여 용매를 날리고 잔존물을 얻는다.
세포주는 마우스로부터 유래한 Signosis 사의 NF-κB Luciferase Reporter NIH 3T3 Stable Cell Line을 사용하였으며, Signosis 사의 manual을 참고하여 NF-κB를 유도하고 후보물질을 넣어서 NF-κB 억제율을 확인하였다.
우리는 오매의 UVB에 의한 AP-1 발현과 프로모터 활성도를 AP-1 luciferase plasmid가 transfection된 JB6 P+ cell을 이용하여 측정하였다. 오매추출물은 기본적으로 UVB에 의해 유도되는 AP-1 promoter 활성을 농도의존적으로 억제한다.
우리는 오매의 UVB에 의한 COX-2 단백질 발현과 프로모터 활성도를 COX-2 luciferase plasmid가 transfection된 JB6 P+ cell을 이용하여 측정하였다. 오매추출물은 기본적으로 UVB에 의해 유도되는 COX-2 promoter 활성을 농도의존적으로 억제한다.
우리는 오매의 UVB에 의한 NF-κB 발현과 프로모터 활성도를 NF-κB luciferase plasmid가 transfection된 JB6 P+ cell을 이용하여 측정하였다.
이후 20 ng/mL의 TNF-α를 처리하였고 5, 10, 20, 40, 80분후 p-p38α (Thr180/ Tyr182), p-Akt-1 (Ser473), p-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185), pMEK1/2 (Ser217/221), p-stat3 (Tyr705), p-NF-κB p65 (Ser536), p-IκB-alpha (Ser32) 의 변화를 확인하였다.
이후 activator protein-1 (AP-1), nuclear factor-κB (NF-κB), 그리고 COX-2 luciferase reporter plasmid로 transfection하였고 200µg/mL G418이 함유된 5% FBS MEM으로 전배양을 실시하였다.
자세하게 말하자면, 1 kg을 분쇄한 후, 70% 에탄올 (w/w) 10 kg을 넣은 후 실온에서 3일간 추출하였으며, 매일 오전, 오후 각 30분씩 교반하였다. 이후 추출액을 여과한 후 Evaporator (회전증발농축기)를 사용하여 농축하였고, 이를 동결건조하여 분말화 하여 이를 실험물질로 사용하였다.
대상 데이터
Eagle's MEM, gentamicin, L-glutamine은 Life Technologies-Bethesda Research Laboratories 사 제품을 이용하였다.
Eagle's MEM, gentamicin, L-glutamine은 Life Technologies-Bethesda Research Laboratories 사 제품을 이용하였다. Fetal bovine serum (FBS)는 Gemini Bio-Products에서 구입하였고, COX-2에 대한 Antibody는 Cayman으로부터 구입하였다. p-p38 alpha (Thr180/Tyr182), p-Akt-1 (Ser473), p-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185), p-MEK1/2 (Ser217/221), p-stat3 (Tyr705), p-NF-κB p65 (Ser536), p-IkB-alpha (Ser32)에 대한 Antibody는 Cell Signaling Biotechnology으로부터 구입하였다.
p-p38 alpha (Thr180/Tyr182), p-Akt-1 (Ser473), p-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185), p-MEK1/2 (Ser217/221), p-stat3 (Tyr705), p-NF-κB p65 (Ser536), p-IkB-alpha (Ser32)에 대한 Antibody는 Cell Signaling Biotechnology으로부터 구입하였다. Hygromycin B는 Roche사 제품을 사용하였고 Luciferase reporter system은 Promega 사 제품을 사용하였다.
Prunus mume (오매) 및 Atractylodes japonica Koidz (창출), Cimicifuga heracleifolia (승마), Sophora flavescens (고삼)을 1차 Screening을 통하여 선별하였으며 (Data not shown), 다음과 같은 방법으로 추출하였다. 자세하게 말하자면, 1 kg을 분쇄한 후, 70% 에탄올 (w/w) 10 kg을 넣은 후 실온에서 3일간 추출하였으며, 매일 오전, 오후 각 30분씩 교반하였다.
UVB 처리실험 세포주는 마우스로부터 유래한 JB6 P+ mouse epidermal cell line을 사용하였으며, 2 mmol/L L-glutamine과 25 µg/mL gentamicin이 첨가된 5% FBS-MEM을 배지로 배양하였으며, 배양조건은 37℃, 5% CO2 조건을 사용하였다.
(c)와 같이 인산화되지 않은 NF-κB p65 subunit의 양의 시간에 따른 증감은 없을 것으로 사료되었고, 결과와 같이 자체 양의 증감은 없는 것으로 확인되었다.
Fig. 2에서와 같이 4종의 후보물질이 상용화된 추출물인 목단피 (Bot, botanpi)보다 IL-4, IFN-γ의 억제능이 뛰어나다는 것을 보여준다.
또한 p65와 IkB-α의 인산화도 억제하는 경향을 확인하였다.
오매추출물은 Akt 시그널을 조절함으로써 NF-κB의 활성화를 억제하는 경향을 확인할 수 있었다. 반면 대조군으로 사용된 목단피 추출물도 p-Akt-1 활성을 억제하나 오매보다 다소 낮은 억제율을 보여주었다.
NF-κB를 중심으로 유관된 세포신호물질 정량을 진행하였다. 사용된 대조군인 목단피 추출물과 같이 p38은 미약하게 억제되었으나, p-Akt-1과 SAPK/JNK를 억제하는 양상을 확인할 수 있었고, MEK1/2, p-stat3 모두 억제하는 양상을 확인할 수 있었다. 또한 p65와 IkB-α의 인산화도 억제하는 경향을 확인하였다.
3(d)와 같이 MEK1/2는 자극 20분후 최대치를 나타내었으며 시간에 지남에 따라 내려가는 양상을 확인할 수 있었다. 오매는 MEK1/2의 활성을 후반부인 40~80 min에서 대조군인 목단피 추출물보다 다소 억제하는 양상을 확인할 수 있었다.
오매를 파쇄, 추출하여 내부의 유효성분을 모은 후 transfection 된 JB6 P+ cell에 자외선을 조사한 실험에서 COX-2, NF-κB, AP-1 모두 농도 의존적으로 억제되는 양상을 확인할 수 있었다.
오매추출물은 Akt 시그널을 조절함으로써 NF-κB의 활성화를 억제하는 경향을 확인할 수 있었다.
위 두 개의 결과치에서 모두 오매는 상당한 NF-κB 억제능을 보이며, 모두 유의적 차이를 나타내었다.
Akt는 IKK-α, β, γ에 영향을 미치어 최종적으로 NF-κB의 활성화에 영향을 미치는 것으로 보인다 [6]. 유도원에 의해 Akt-1의 특이적인 양상은 확인되지 않았으나 Fig. 4(d) 와 같이 유도원 처리후 80분일 때 오매 추출물에 의해 Akt-1의 양이 줄어듬을 확인할 수 있었다. Akt-1의 양이 유도원에 의해 줄어드는 이유는 p-Akt-1으로 변환되서 상대적으로 줄어드는 것으로 사료된다.
유도원에 의해 약 20배 증가율을 보였으며 4종의 후보물질 모두 NIH3T3 cell에서 NF-κB 억제능을 나타내고 있다.
즉 오매는 농도의존적으로 NF-κB를 억제함으로써 UVB에 의한 NF-κB 활성 억제 효과를 확인할 수 있었다.
후속연구
이런 이유로 NF-κB와 COX-2의 발현량을 조절할 수 있다면 장기적으로 피부병변과 관련된 질환의 예방에 도움을 줄 수 있을 것이라고 생각된다.
종합적으로 한방유래 추출물인 오매는 기본적으로 NF-κB를 조절하고 다양한 부위의 시그널을 억제하고 UV에 의한 염증의 악화도 완화하는 것으로 생각되므로 최종적으로 만성피부염증을 억제하여 아토피, 건선 뿐만 아니라 다양한 염증 자극원으로부터 피부를 지키는 피부병변 예방물질로 기대된다.
오매를 파쇄, 추출하여 내부의 유효성분을 모은 후 transfection 된 JB6 P+ cell에 자외선을 조사한 실험에서 COX-2, NF-κB, AP-1 모두 농도 의존적으로 억제되는 양상을 확인할 수 있었다. 즉 한방훈증추출물인 오매에서 추출한 성분이 자외선으로부터 피부를 보호할 수 있는 새로운 원료로서의 가능성을 보여주었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
NF-κB는 무엇에 의해 활성화되는가?
NF-κB는 B 림프구에서 κ chain enhancer protein이란 이름으로 발견되었으며, Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)라는 검사 방법을 통해 유전 인자의 enhancer element에 결합하여 전사 (transcription)를 조절하는 새로운 종류의 생체분자로 확인되었다 [3]. 이 물질은 Lipopolysaccharide (LPS), Tumor necrosis factor (TNF), Phorbol 12-myristate 13- acetate (PMA), 자외선 등 각종 자극에 의해 활성화되며, 생체 세포 내 어디에서나 존재한다. NF-κB의 구성 성분은 p65 (RelA), C-rel, RelB, NF-B1 (p50/105), NF-B2 (p52/100)이 존재하며, 공통적으로 Rel homology domain (RHD)란 영역을 가지는데 이 영역은 DNA 결합, 이합체화 (dimerization), IκB (inhibitor of NF-κB)와의 상호작용과 같은 기능을 수행한다.
NF-κB는 무엇인가?
NF-κB는 B 림프구에서 κ chain enhancer protein이란 이름으로 발견되었으며, Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)라는 검사 방법을 통해 유전 인자의 enhancer element에 결합하여 전사 (transcription)를 조절하는 새로운 종류의 생체분자로 확인되었다 [3]. 이 물질은 Lipopolysaccharide (LPS), Tumor necrosis factor (TNF), Phorbol 12-myristate 13- acetate (PMA), 자외선 등 각종 자극에 의해 활성화되며, 생체 세포 내 어디에서나 존재한다.
IKK complex를 구성하는 성분들과 그들의 역할은 무엇인가?
현재 NF-κB의 상위 kinase인 IKK complex는 α, β, γ 3개의 성분으로 구성되어 있다고 알려졌으며, α, β 2개의 촉매아단위 (catalytic subunit) 중에서 IKKβ 아단위는 NF-κB의 정규 (canonical) 활성화 경로에서 필수적인 역할을 하고, IKKα는 비정규 (noncanonical) 활성화 경로에 관여하며, 비촉매 아단위 (noncatalytic subunit)인 IKKγ (NEMO)는 조절역할을 한다고 생각된다 [5]. 즉 NF-κB는 다양한 경로로 염증반응에 관여한다는 것을 유추할 수 있다.
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