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NF-κB 조절을 통한 오매추출물의 항염효과 및 작용기작에 관한 연구
Study on the Anti-inflammatory Effect and Mechanism of Prunus mume Extract Regarding NF-κB 원문보기

KSBB Journal, v.29 no.1, 2014년, pp.50 - 57  

서원상 (건국대학교 생물공학과) ,  오한나 (참존화장품 기술원) ,  박우정 (참존화장품 기술원) ,  엄상용 (참존화장품 기술원) ,  이대우 ((주)더마랩 기술연구소) ,  강상모 (건국대학교 생물공학과)

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

NF-${\kappa}B$ is a transcriptional factor which is involved in many biological processes including immunity, inflammation, and cell survival. Many investigators studied on the mechanism involved in activation of NF-${\kappa}B$ signalling pathway via ubiquitination and degradat...

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

  • 자세하게 설명하자면, 각 원료를 50% 에탄올 용매로 추출하여 용매를 날리고 잔존물을 얻는다. 1 g의 잔존물에 물 49 g을 넣고 50 g의 1,3 butylene glycol을 넣어 녹여내어 필터링을 한후 나온 여액과 Botanpi (Bot)와 비교하였다. Inhibition rate는 다음과 같이 정의한다.
  • NF-κB를 중심으로 유관된 세포신호물질 정량을 진행하였다.
  • TNF-α 20 ng을 처리한 뒤 8시간후 세포를 완전히 녹이고 세포 내의 Luciferase를 추출한후 Luminometer (Luminoskan Ascent; Thermo Electron, USA)를 이용하여 활성을 측정하였다.
  • 본 연구진에서는 스크리닝을 통하여 4종의 한약재를 선별하였고 그 중 오매의 NF-κB 억제능을 확인하였고 또한 NF-κB와 관련된 신호전달물질인 Akt, MEK, p38 MAPK, Stat3의 시간에 따른 증감을 확인하였다.
  • 부가적으로 오매추출물의 UVB에 의한 COX-2, NF-κB, AP-1의 발현 억제 효과를 확인하였다.
  • TNF-α 20 ng을 처리한 뒤 8시간후 세포를 완전히 녹이고 세포 내의 Luciferase를 추출한후 Luminometer (Luminoskan Ascent; Thermo Electron, USA)를 이용하여 활성을 측정하였다. 상용화되어있는 Botanpi (Ichimaru Pharcos, Japan)와 활성 비교를 위해서 오매, 창출, 승마, 고삼을 Botanpi Liquid 제조방법과 동일하게 하였다. 자세하게 설명하자면, 각 원료를 50% 에탄올 용매로 추출하여 용매를 날리고 잔존물을 얻는다.
  • 세포주는 마우스로부터 유래한 Signosis 사의 NF-κB Luciferase Reporter NIH 3T3 Stable Cell Line을 사용하였으며, Signosis 사의 manual을 참고하여 NF-κB를 유도하고 후보물질을 넣어서 NF-κB 억제율을 확인하였다.
  • 우리는 오매의 UVB에 의한 AP-1 발현과 프로모터 활성도를 AP-1 luciferase plasmid가 transfection된 JB6 P+ cell을 이용하여 측정하였다. 오매추출물은 기본적으로 UVB에 의해 유도되는 AP-1 promoter 활성을 농도의존적으로 억제한다.
  • 우리는 오매의 UVB에 의한 COX-2 단백질 발현과 프로모터 활성도를 COX-2 luciferase plasmid가 transfection된 JB6 P+ cell을 이용하여 측정하였다. 오매추출물은 기본적으로 UVB에 의해 유도되는 COX-2 promoter 활성을 농도의존적으로 억제한다.
  • 우리는 오매의 UVB에 의한 NF-κB 발현과 프로모터 활성도를 NF-κB luciferase plasmid가 transfection된 JB6 P+ cell을 이용하여 측정하였다.
  • 이후 20 ng/mL의 TNF-α를 처리하였고 5, 10, 20, 40, 80분후 p-p38α (Thr180/ Tyr182), p-Akt-1 (Ser473), p-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185), pMEK1/2 (Ser217/221), p-stat3 (Tyr705), p-NF-κB p65 (Ser536), p-IκB-alpha (Ser32) 의 변화를 확인하였다.
  • 이후 activator protein-1 (AP-1), nuclear factor-κB (NF-κB), 그리고 COX-2 luciferase reporter plasmid로 transfection하였고 200µg/mL G418이 함유된 5% FBS MEM으로 전배양을 실시하였다.
  • 이후 세포는 lysis buffer [0.1 mol/L potassium phosphate buffer (pH 7.8), 1% Triton X-100, 1 mmol/L DTT, and 2 mmol/L EDTA] 100 µL로 처리하고 Luciferase 활성도는 Luminometer (Luminoskan Ascent; Thermo Electron, USA)으로 측정하였다.
  • 자세하게 말하자면, 1 kg을 분쇄한 후, 70% 에탄올 (w/w) 10 kg을 넣은 후 실온에서 3일간 추출하였으며, 매일 오전, 오후 각 30분씩 교반하였다. 이후 추출액을 여과한 후 Evaporator (회전증발농축기)를 사용하여 농축하였고, 이를 동결건조하여 분말화 하여 이를 실험물질로 사용하였다.

대상 데이터

  • Eagle's MEM, gentamicin, L-glutamine은 Life Technologies-Bethesda Research Laboratories 사 제품을 이용하였다.
  • Eagle's MEM, gentamicin, L-glutamine은 Life Technologies-Bethesda Research Laboratories 사 제품을 이용하였다. Fetal bovine serum (FBS)는 Gemini Bio-Products에서 구입하였고, COX-2에 대한 Antibody는 Cayman으로부터 구입하였다. p-p38 alpha (Thr180/Tyr182), p-Akt-1 (Ser473), p-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185), p-MEK1/2 (Ser217/221), p-stat3 (Tyr705), p-NF-κB p65 (Ser536), p-IkB-alpha (Ser32)에 대한 Antibody는 Cell Signaling Biotechnology으로부터 구입하였다.
  • p-p38 alpha (Thr180/Tyr182), p-Akt-1 (Ser473), p-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185), p-MEK1/2 (Ser217/221), p-stat3 (Tyr705), p-NF-κB p65 (Ser536), p-IkB-alpha (Ser32)에 대한 Antibody는 Cell Signaling Biotechnology으로부터 구입하였다. Hygromycin B는 Roche사 제품을 사용하였고 Luciferase reporter system은 Promega 사 제품을 사용하였다.
  • Prunus mume (오매) 및 Atractylodes japonica Koidz (창출), Cimicifuga heracleifolia (승마), Sophora flavescens (고삼)을 1차 Screening을 통하여 선별하였으며 (Data not shown), 다음과 같은 방법으로 추출하였다. 자세하게 말하자면, 1 kg을 분쇄한 후, 70% 에탄올 (w/w) 10 kg을 넣은 후 실온에서 3일간 추출하였으며, 매일 오전, 오후 각 30분씩 교반하였다.
  • UVB 처리실험 세포주는 마우스로부터 유래한 JB6 P+ mouse epidermal cell line을 사용하였으며, 2 mmol/L L-glutamine과 25 µg/mL gentamicin이 첨가된 5% FBS-MEM을 배지로 배양하였으며, 배양조건은 37℃, 5% CO2 조건을 사용하였다.
  • p-p38 alpha (Thr180/Tyr182), p-Akt-1 (Ser473), p-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185), p-MEK1/2 (Ser217/221), p-stat3 (Tyr705), p-NF-κB p65 (Ser536), p-IkB-alpha (Ser32)에 대한 Antibody는 Cell Signaling Biotechnology으로부터 구입하였다.
  • 세포주는 순수 NIH 3T3 cell line을 사용하였으며, 하루전 96-well에 seed 하였고 이때 오매 추출물과 대조군인 목단피 추출물을 50 µg/mL으로 동량 사용하였다.

데이터처리

  • 8), 1% Triton X-100, 1 mmol/L DTT, and 2 mmol/L EDTA] 100 µL로 처리하고 Luciferase 활성도는 Luminometer (Luminoskan Ascent; Thermo Electron, USA)으로 측정하였다. 실험통계는 Student t-test를 사용하였다.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
NF-κB는 무엇에 의해 활성화되는가? NF-κB는 B 림프구에서 κ chain enhancer protein이란 이름으로 발견되었으며, Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)라는 검사 방법을 통해 유전 인자의 enhancer element에 결합하여 전사 (transcription)를 조절하는 새로운 종류의 생체분자로 확인되었다 [3]. 이 물질은 Lipopolysaccharide (LPS), Tumor necrosis factor (TNF), Phorbol 12-myristate 13- acetate (PMA), 자외선 등 각종 자극에 의해 활성화되며, 생체 세포 내 어디에서나 존재한다. NF-κB의 구성 성분은 p65 (RelA), C-rel, RelB, NF-B1 (p50/105), NF-B2 (p52/100)이 존재하며, 공통적으로 Rel homology domain (RHD)란 영역을 가지는데 이 영역은 DNA 결합, 이합체화 (dimerization), IκB (inhibitor of NF-κB)와의 상호작용과 같은 기능을 수행한다.
NF-κB는 무엇인가? NF-κB는 B 림프구에서 κ chain enhancer protein이란 이름으로 발견되었으며, Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)라는 검사 방법을 통해 유전 인자의 enhancer element에 결합하여 전사 (transcription)를 조절하는 새로운 종류의 생체분자로 확인되었다 [3]. 이 물질은 Lipopolysaccharide (LPS), Tumor necrosis factor (TNF), Phorbol 12-myristate 13- acetate (PMA), 자외선 등 각종 자극에 의해 활성화되며, 생체 세포 내 어디에서나 존재한다.
IKK complex를 구성하는 성분들과 그들의 역할은 무엇인가? 현재 NF-κB의 상위 kinase인 IKK complex는 α, β, γ 3개의 성분으로 구성되어 있다고 알려졌으며, α, β 2개의 촉매아단위 (catalytic subunit) 중에서 IKKβ 아단위는 NF-κB의 정규 (canonical) 활성화 경로에서 필수적인 역할을 하고, IKKα는 비정규 (noncanonical) 활성화 경로에 관여하며, 비촉매 아단위 (noncatalytic subunit)인 IKKγ (NEMO)는 조절역할을 한다고 생각된다 [5]. 즉 NF-κB는 다양한 경로로 염증반응에 관여한다는 것을 유추할 수 있다.
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