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문제 정의
- 본 연구에서는 두 품종의 원두커피와 이를 Monascus ruber 홍국균으로 발효시킨 원두커피 열수추출물의 지방축적 억제활성을 확인하고자 하였다. 세포 내 triglyceride 생성 저해효과 및 주요 전사인자인 PPARγ, C/EBPα와 FAS 및 aP2의 발현을 측정하기 위해 3T3-L1 지방전구세포에서 성숙 지방세포로의 분화 유도와 함께 베트남 로부스타(VR), 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MR-VR), 발아현미(10, 20, 30%)를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MR-VR10, MR-VR20, MR-VR30), 에티오피아 모카 시다모 G2(ES), 홍국균으로 고체발효 한 에티오피아 모카 시다모 G2(MR-ES), 발아현미(10, 20, 30%)를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 에티오피아 모카 시다모 G2 (MR-ES10, MR-ES20, MR-ES30) 원두커피의 열수추출물을 1,000 μg/mL 농도로 처리하였다.
- 본 연구에서는 원두커피를 홍국으로 발효시켜 만든 홍국균 고체발효 원두커피 열수추출물이 3T3-L1 지방전구세포 분화에 어떠한 영향을 미치는지 규명함으로써 홍국균 고체 발효 원두커피를 기능성 식품 소재로 활용할 수 있는 기초 자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- 3T3-L1 지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화 유도와 함께 베트남 로부스타(VR), 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MRVR), 발아현미(10, 20, 30%)를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MR-VR10, MR-VR20, MRVR30), 에티오피아 모카 시다모 G2(ES), 홍국균으로 고체발효 한 에티오피아 모카 시다모 G2(MR-ES), 발아현미(10, 20, 30%)를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 에티오피아 모카 시다모 G2(MR-ES10, MR-ES20, MR-ES30) 원두커피의 열수추출물을 1,000 μg/mL 농도로 처리하였다.
- Cell lysate는 BCA assay를 이용하여 단백질을 정량하였고 cell lysate의 단백질 농도를 8 μg으로 조정하여 10% SDS polyacrylamide gel에서 전기영동을 실시하였다.
- Preadipocyte를 6-well plate에 1×105 cells/well의 농도로 seeding 한 뒤 세포가 confluent stage에 도달하면 5 μg/mL의 insulin(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(Sigma-Aldrich) 및 1 μM dexamethasone(Sigma-Aldrich)을 첨가한 10% FBS-DMEM을 사용하여 이틀간 분화 유도하였으며, 분화 유도 후 2일 동안 insulin만 첨가한 배지를 이용함으로써 지방세포를 성숙시켰다.
- 전사인자들의 하위 유전자들로는 GPDH(glycerophosphate dehydrogenase), ACC(acetyl-CoA carboxylase), FAS, aP2 등이 있으며, 이 중 FAS와 aP2는 지방합성과 지방수송에 관여함으로써 lipid droplet 및 triglyceride의 생성을 촉진시킨다(22). 따라서 본 연구에서는 커피추출물이 FAS와 aP2 발현에 미치는 영향을 western blot을 통해 확인하였다(Fig. 3). 베트남 로부스타 품종의 원두커피 열수추출물을 처리한 VR군이 에티오피아 모카 시다모 G2 품종의 열수추출물을 처리한 ES군보다 FAS와 aP2의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 에티오피아 모카 시다모 G2 품종의 경우 원두커피 열수추출물을 처리하였을 때보다 홍국균으로 고체발효 한 원두커피의 열수추출물을 처리한 MR-ES군에서 FAS와 aP2의 발현량이 유의적으로 감소하였다.
- 따라서 본 연구에서는 커피추출물이 PPARγ와 C/EBPα 발현에 미치는 영향을 western blot을 통해 확인하였다(Fig. 2).
- 발효가 종료된 커피생두는 50℃ drying oven에서 48시간 건조하여 홍국균 균사체-고체발효 커피생두로 조제하였다 (Table 1).
- 세포 내 triglyceride 생성 저해효과 및 주요 전사인자인 PPARγ, C/EBPα와 FAS 및 aP2의 발현을 측정하기 위해 3T3-L1 지방전구세포에서 성숙 지방세포로의 분화 유도와 함께 베트남 로부스타(VR), 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MR-VR), 발아현미(10, 20, 30%)를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MR-VR10, MR-VR20, MR-VR30), 에티오피아 모카 시다모 G2(ES), 홍국균으로 고체발효 한 에티오피아 모카 시다모 G2(MR-ES), 발아현미(10, 20, 30%)를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 에티오피아 모카 시다모 G2 (MR-ES10, MR-ES20, MR-ES30) 원두커피의 열수추출물을 1,000 μg/mL 농도로 처리하였다.
- 커피생두 및 홍국균 균사체-고체발효 커피생두는 coffee roaster(Genecafe, Gyeonggi, Korea)에서 중배전(235~240℃, 12~13분간 로스팅)하여 각각의 고체발효 원두커피(roasted coffee)로 조제한 후 coffee grinder(Bazzatra, Gyeonggi, Korea)를 이용하여 동일 크기로 분쇄하였다. 원두커피의 열수추출물은 이후 20배의 물을 가한 후 decoction법을 이용하여 2시간 동안 half volume이 되도록 90℃에서 추출하였으며 여과지를 이용하여 잔사를 제거하였다. 추출여과액은 원심분리 하여 침전물을 제거하고 상등액은 농축 및 동결건조 하여 시료로 사용하였다.
- 이를 통해 대조군에 비해 지방구의 생성을 유의적으로 감소시키는 실험군인 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MR-VR), 10% 발아현미를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MR-VR10), 홍국균으로 고체발효한 에티오피아 모카 시다모 G2(MR-ES)와 시료대조군인 베트남 로부스타(VR), 에티오피아 모카 시다모 G2(ES)를 이용하여 지방세포 분화에 관여하는 관련 전사인자들의 발현에 미치는 영향을 확인하기로 하였다.
- 5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(Sigma-Aldrich) 및 1 μM dexamethasone(Sigma-Aldrich)을 첨가한 10% FBS-DMEM을 사용하여 이틀간 분화 유도하였으며, 분화 유도 후 2일 동안 insulin만 첨가한 배지를 이용함으로써 지방세포를 성숙시켰다. 이후 2일 간격으로 10% FBS만이 함유된 DMEM으로 배지를 교환하면서 세포의 지방분화 상태를 확인하였다. 이때 시료의 지방축적 및 분화억제력을 확인하기 위해 1,000 μg/mL의 농도로 배지에 첨가하였다.
- 커피생두는 각각 100 g(수분함량: 13~14%)을 칭량하여 2배수의 물로 2시간 동안 30℃에서 침지하여 조직을 연화시킨 후 물기를 제거한 다음 121°C에서 120분간 고압멸균 하였다. 침지 및 멸균된 커피생두는 24시간 발아된 현미와 각각 100:0, 90:10, 80:20 및 70:30 w/w%의 비율로 혼합하였으며 홍국균 균사체 종균을 각각 10%(w/v)로 접종한 후, 25℃에서 모두 10일 동안 고체배양 하였다. 발효가 종료된 커피생두는 50℃ drying oven에서 48시간 건조하여 홍국균 균사체-고체발효 커피생두로 조제하였다 (Table 1).
- 커피생두 및 홍국균 균사체-고체발효 커피생두는 coffee roaster(Genecafe, Gyeonggi, Korea)에서 중배전(235~240℃, 12~13분간 로스팅)하여 각각의 고체발효 원두커피(roasted coffee)로 조제한 후 coffee grinder(Bazzatra, Gyeonggi, Korea)를 이용하여 동일 크기로 분쇄하였다. 원두커피의 열수추출물은 이후 20배의 물을 가한 후 decoction법을 이용하여 2시간 동안 half volume이 되도록 90℃에서 추출하였으며 여과지를 이용하여 잔사를 제거하였다.
- 커피생두는 각각 100 g(수분함량: 13~14%)을 칭량하여 2배수의 물로 2시간 동안 30℃에서 침지하여 조직을 연화시킨 후 물기를 제거한 다음 121°C에서 120분간 고압멸균 하였다.
- PPARγ, C/EBPα, FAS, aP2의 1차 항체는 1:1,000의 비율로 상온에서 2시간 부착시킨 뒤 수차례 세척하고 각각의 2차 항체를 상온에서 1시간 부착시켰다. 항체 반응이 끝난 membrane에 ECL detection reagent(Pierce, Rockford, IL, USA)를 처리하고 X-ray film에 감광시켜 현상하였다.
대상 데이터
- 고체발효에 사용된 홍국균 균사체(M. ruber)는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터(Gyeonggi, Korea)로부터 분양받았으며, 균사체는 potato dextrose agar(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 평판배지에서 25 ℃로 약 7~10일간 배양한 후 potato dextrose broth(Difco)가 담긴 erlenmeyer flask에 접종하여 shaking incubator(Jeio tech, Daejeon, Korea)에서 배양하였다. 커피생두 고체발효용 홍국균 균사체는 potato dextrose broth(PDB) 배지에서 3회 정도 계대배양한 종균으로 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 커피는 베트남 로부스타(VR, AMC Co., Ltd., Gyeonggi, Koera)와 에티오피아 모카 시다모 G2(ES, GSC international Co., Ltd., Seoul, Korea) 두 품종으로 커피생두(green coffe bean) 상태로 구입하여 시료로 사용하였다. 커피생두는 각각 100 g(수분함량: 13~14%)을 칭량하여 2배수의 물로 2시간 동안 30℃에서 침지하여 조직을 연화시킨 후 물기를 제거한 다음 121°C에서 120분간 고압멸균 하였다.
- 실험에 사용된 3T3-L1 preadipocyte는 ATCC(CL193, Manassas, VA, USA)에서 분양 받았으며 세포 증식은 10% bovine calf serum(Gibco BRL Life Technoloies, Grand Island, NY, USA)과 100 units/mL penicillin 및 50μg/mL streptomycin이 함유된 DMEM을 이용하였으며, 분화 유도 및 성숙배지로는 10% fetal bovine serum(FBS, HyClone, Logan, UT, USA)과 100 units/mL penicillin 및 50 μg/mL streptomycin이 함유된 DMEM을 이용하였다.
- ruber)는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터(Gyeonggi, Korea)로부터 분양받았으며, 균사체는 potato dextrose agar(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 평판배지에서 25 ℃로 약 7~10일간 배양한 후 potato dextrose broth(Difco)가 담긴 erlenmeyer flask에 접종하여 shaking incubator(Jeio tech, Daejeon, Korea)에서 배양하였다. 커피생두 고체발효용 홍국균 균사체는 potato dextrose broth(PDB) 배지에서 3회 정도 계대배양한 종균으로 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 이상 반복 측정하였으며, 그 결과는 SAS 9.1(SAS Institute, Cary, NC, USA) software를 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하였다. 유의적 차이가 있는 항목에 대해서는 Duncan's multiple range test로 P<0.
- 유의적 차이가 있는 항목에 대해서는 Duncan's multiple range test로 P<0.05 수준에서 유의차 검정을 실시하였다.
이론/모형
- 지방분화에 관여하는 대표적 transcription factor인 PPARγ, C/EBPα와 특이 유전자들인 FAS, aP2의 발현에 대한 시료의 억제 활성을 확인하기 위해 western blot을 실시하였다.
성능/효과
- 1). 또한 에티오피아 모카 시다모 G2 품종의 원두커피를 처리한 실험군(ES)보다 베트남 로부스타 품종의 원두커피를 처리한 실험군(VR)에서 지방구가 유의적으로 감소함을 관찰하였으며 특히 베트남 로부스타(VR), 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MR-VR), 10% 발아 현미를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타 (MR-VR10)를 처리한 경우 대조군에 비해 triglyceride 축적이 약 40% 저해됨을 확인하였다. 베트남 로부스타 품종은 최근 브라질에 이어 전 세계에서 두 번째로 많은 커피 생산량을 기록하고 있으며, 일반적으로 다른 커피 품종들과 비교하여 높은 항산화 성분 및 항산화 활성을 함유하는 것으로 알려져 있으며(17), 본 연구 결과에서도 베트남 로부스타 품종을 처리한 실험군에서 lipid droplet이 유의적으로 감소하는 것으로 보아 베트남 로부스타 품종이 다량 함유하고 있는 생리활성 물질에서 기인했을 것으로 생각된다.
- 또한 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타 품종의 원두커피 열수추출물을 처리한 MR-VR군 및 10% 발아현미를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타의 열수추출물을 투여한 MR-VR10군에서는 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 에티오피아 모카 시다모 G2 품종의 경우 원두커피 열수추출물을 처리하였을 때보다 홍국균으로 고체발효 한 원두커피의 열수추출물을 처리한 MR-ES군에서 PPARγ와 C/EBPα의 발현량이 유의적으로 감소하였다.
- 베트남 로부스타 품종의 원두커피 열수추출물을 처리한 VR군보다 에티오피아 모카 시다모 G2 품종의 열수추출물을 처리한 PPARγ와 C/EBPα의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 3). 베트남 로부스타 품종의 원두커피 열수추출물을 처리한 VR군이 에티오피아 모카 시다모 G2 품종의 열수추출물을 처리한 ES군보다 FAS와 aP2의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 에티오피아 모카 시다모 G2 품종의 경우 원두커피 열수추출물을 처리하였을 때보다 홍국균으로 고체발효 한 원두커피의 열수추출물을 처리한 MR-ES군에서 FAS와 aP2의 발현량이 유의적으로 감소하였다. 따라서 베트남 로부스타 품종 및 홍국균으로 고체발효 한 에티오피아 모카 시다모 G2 품종이 FAS와 aP2의 조절을 통해 효과적으로 지방의 합성, 이동 및 저장을 억제하는 것으로 사료된다.
- 베트남 로부스타 품종이 에티오피아 모카 시다모 G2 품종보다 지방구 생성 및 지방분화 전사인자들인 PPARγ, C/EBPα, FAS 및 aP2의 발현을 효과적으로 억제하였으며, 에티오피아 모카 시다모 G2 품종의 경우 원두커피 열수추출물을 처리한 실험군보다 홍국균으로 고체발효 한 원두커피의 열수추출물을 처리한 실험군에서 더 높은 지방분화 억제능을 나타냈다.
- Shin 등(18)은 커피의 홍국균 발효과정을 통해 caffeine의 함량 변화 없이 chlorogenic acid의 함량만을 유의적으로 증가시켜 커피의 생물학적 전환(biotransformation) 가능성을 제시하였으며, 또한 Cha 등(19)은 홍국균을 이용하여 홍삼의 생물학적 전환을 보고하였다. 본 연구에서도 에티오피아 모카 시다모 G2 품종의 경우 홍국균으로 발효 후에 지방분화 억제효과가 증가되었다.
- 3T3-L1 지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화 유도와 함께 베트남 로부스타(VR), 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MRVR), 발아현미(10, 20, 30%)를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MR-VR10, MR-VR20, MRVR30), 에티오피아 모카 시다모 G2(ES), 홍국균으로 고체발효 한 에티오피아 모카 시다모 G2(MR-ES), 발아현미(10, 20, 30%)를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 에티오피아 모카 시다모 G2(MR-ES10, MR-ES20, MR-ES30) 원두커피의 열수추출물을 1,000 μg/mL 농도로 처리하였다. 분화 완료된 성숙지방세포에서 Oil Red O 염색 후 관찰한 결과, 분화 유도제만 처리한 대조군에 비해 모든 군에서 세포내 lipid droplet 형성이 유의적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 또한 에티오피아 모카 시다모 G2 품종의 원두커피를 처리한 실험군(ES)보다 베트남 로부스타 품종의 원두커피를 처리한 실험군(VR)에서 지방구가 유의적으로 감소함을 관찰하였으며 특히 베트남 로부스타(VR), 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MR-VR), 10% 발아 현미를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타 (MR-VR10)를 처리한 경우 대조군에 비해 triglyceride 축적이 약 40% 저해됨을 확인하였다.
- 베트남 로부스타 품종은 최근 브라질에 이어 전 세계에서 두 번째로 많은 커피 생산량을 기록하고 있으며, 일반적으로 다른 커피 품종들과 비교하여 높은 항산화 성분 및 항산화 활성을 함유하는 것으로 알려져 있으며(17), 본 연구 결과에서도 베트남 로부스타 품종을 처리한 실험군에서 lipid droplet이 유의적으로 감소하는 것으로 보아 베트남 로부스타 품종이 다량 함유하고 있는 생리활성 물질에서 기인했을 것으로 생각된다. 에티오피아 모카 시다모 G2 품종의 경우 홍국균으로 고체발효 한 원두커피의 열수추출물(MR-ES)을 처리한 결과 시료대조 군인 ES보다 지방구가 유의적으로 감소함을 확인하였지만, 베트남 로부스타 품종의 경우 같은 경향을 나타내지 않았다. Shin 등(18)은 커피의 홍국균 발효과정을 통해 caffeine의 함량 변화 없이 chlorogenic acid의 함량만을 유의적으로 증가시켜 커피의 생물학적 전환(biotransformation) 가능성을 제시하였으며, 또한 Cha 등(19)은 홍국균을 이용하여 홍삼의 생물학적 전환을 보고하였다.
- 세포 내 triglyceride 생성 저해효과 및 주요 전사인자인 PPARγ, C/EBPα와 FAS 및 aP2의 발현을 측정하기 위해 3T3-L1 지방전구세포에서 성숙 지방세포로의 분화 유도와 함께 베트남 로부스타(VR), 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MR-VR), 발아현미(10, 20, 30%)를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 베트남 로부스타(MR-VR10, MR-VR20, MR-VR30), 에티오피아 모카 시다모 G2(ES), 홍국균으로 고체발효 한 에티오피아 모카 시다모 G2(MR-ES), 발아현미(10, 20, 30%)를 첨가하여 홍국균으로 고체발효 한 에티오피아 모카 시다모 G2 (MR-ES10, MR-ES20, MR-ES30) 원두커피의 열수추출물을 1,000 μg/mL 농도로 처리하였다. 연구 결과 대조군과 비교하여 커피추출물을 처리한 모든 실험군에서 유의적으로 지방구 생성이 감소하였다. 베트남 로부스타 품종이 에티오피아 모카 시다모 G2 품종보다 지방구 생성 및 지방분화 전사인자들인 PPARγ, C/EBPα, FAS 및 aP2의 발현을 효과적으로 억제하였으며, 에티오피아 모카 시다모 G2 품종의 경우 원두커피 열수추출물을 처리한 실험군보다 홍국균으로 고체발효 한 원두커피의 열수추출물을 처리한 실험군에서 더 높은 지방분화 억제능을 나타냈다.
- 이를 통해 베트남 로부스타 품종 및 홍국균으로 고체발효 한 에티오피아 모카 시다모 G2 품종이 3T3-L1 지방전구세포에서 adipogenic transcription factor인 PPARγ와 C/EBPα의 발현량을 억제하여 lipid droplet 및 triglyceride 생성을 감소시킴으로써 지방세포의 분화를 억제시킬 수 있을 것으로 추정된다.
후속연구
- 또한 전사인자들의 발현 정도는 지방분화 억제능의 결과와 유사하였다. 따라서 Monascus ruber 홍국균의 고체배양을 이용한 에피오티아모카 시다모 G2 발효원두커피는 효과적인 항비만 기능성 식품으로서의 활용가치가 기대되며 로부스타 품종의 경우 다른 품종들보다 저렴한 원가를 감안할 때 베트남 로부스타 발효원두커피는 경제적인 기능성 커피음료 및 기능성 소재로서 산업적인 응용에 좋은 활용가치가 될 것으로 사료된다.
- 특히 커피는 다른 식품에 비해 폴리페놀 등의 항산화 성분 함량이 높아 세포손상을 유발하는 자유라디칼 소거능이 높다고 알려져 있으며(8,9), 최근에는 신경세포 보호효과를 갖는 lipophilic antioxidant와 chlorogenic acid 등이 커피생두보다 로스팅한 원두커피에서 높은 함량을 나타낸다는 결과도 보고되고 있다(10). 따라서 커피의 유용 성분 극대화와 함께 유해 성분을 감소시키기 위한 다양한 공정 개발과 이에 따른 기능성 커피의 개발은 일상적으로 섭취하는 기호식품을 통한 다양한 만성질환 예방에 크게 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
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