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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 MR-커피생두 발효물로부터 조제된 원두커피 열수추출물 30종의 대표적인 염증매개인자로 알려진 TNF-α 및 NO의 생성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
- purpureus 균사체를 다양한 산지별 및 품종별 커피생두에 각각 고체 배양한 발표커피를 조제하여 항산화, 항염증 및 지방생성 억제활성을 평가하였으며, 30종의 커피품종 중에서 Vietnam Robusta 발효커피가 기능성 커피음료 및 기능성소재로의 활용에 좋은 소재가 될 수 있을 것으로 제시한 바 있다(Kim 등 2014). 따라서 본 연구에서는 이전까지의 연구결과를 바탕으로 발효특성이 다른 홍국균 균사체인 M. ruber를 30종의 산지별 및 품종에 따른 커피생두에 고체 발효하여 얻은 발효물을 배전하여 원두커피를 조제하고, 이들의 생리활성을 비교함으로써 홍국균-커피생두 발효물로부터 생리활성이 증강된 원두커피를 산업화하기 위한 기초자료로 활용하고자 한다.
- 본 연구는 이미 다양한 생리활성의 증가가 확인된 홍국균 (M. ruber) 균사체-커피생두 발효물의 원두커피 결과를 바탕으로, 다양한 산지별 및 품종별 커피로 확대하여 최적의 생리 활성 증진을 갖는 커피품종을 선정함으로써 향후 산업적으로 이를 활용하고자 하였다. 결론적으로, MR-Indonesia Mandheling 커피생두 발효물의 원두커피는 수율과 NO 생성을 억제하는 항염증 활성을, MR-Ethiopia Sidamo G2 커피생두 발효물의 원두커피는 항산화활성을, 그리고 MR-Vietnam Robusta 커피 생두 발효물로부터 조제된 원두커피는 항산화활성과 함께 항지질대사 활성이 각각 우수한 것으로 나타났다.
가설 설정
- 4) Control is only saline without extract.
제안 방법
- 30종의 홍국균 균사체-커피생두 고체발효물은 coffee roaster (Genecafe, Gyeonggi-do, Korea)에서 중배전(235~240℃, 12~13분간 로스팅)하여 각각의 원두커피(roasted coffee)로 조제한 후, coffee grinder(Bazzatra, Gyeonggi-do, Korea)를 이용하여 동일 크기로 분쇄하였다. 균사체-커피생두 발효물로부터 조제된 원두커피 열수추출물은 원두커피에 20배 물을 가한 후, decoction법을 이용하여 2시간 동안 half volume이 되도록 추출하였으며(over 90℃), Whatman No.
- Confluent로부터 2일 후(day 0), 분화를 유도하기 위한 분화 유도 배지(MDI)로 10% FBS와 5 μg/mL의 insulin (INS, Sigma), 517 nM의 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX, Sigma), 1 μM의 dexamethasone(DEX, Sigma)이 함유된 DMEM으로 교환하고, 분화유도 3일 후(day 3)에는 10% FBS와 insulin만이 함유된 DMEM 배지로 교환하였다.
- Table 2에 나타낸 바와 같이, MR-커피 생두 발효물의 원두커피 열수추출물 30종은 모두 1,000 μg/ mL의 시료농도에서 saline 대조군의 1.15~1.25배로 RAW 264.7세포에 대한 독성을 나타내지 않았으므로, LPS로 유도시킨 RAW 264.7 세포의 항염증 관련 실험은 시료농도 100 및 1,000μg/mL의 농도수준에서 확인하기로 하였다.
- 원두커피의 다양한 생리활성을 증진시키기 위하여 홍국균 (Monascus ruber, MR) 균사체와 30여종의 산지별 및 품종별 커피생두를 고체 발효하여 MR-커피생두 발효물로 조제하였다. 건조시킨 30종의 산지별 및 품종별 MR-커피생두 발효물은 중배 전 조건에서 로스팅하여 원두커피로 조제한 후, 열수 추출을 통해 MR-커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물로 각각 조제하였다. 조제한 원두커피 열수추출물 중, MR-Indonesia Mandheling 커피생두 발효물로부터 조제된 원두커피 열수추 출물은 가장 우수한 추출수율을 나타내었으며(15.
- 본 연구의 소재가 되는 커피는 다양한 원산지로부터 커피생두(green coffee bean, GCB)를 직수입하여 국내로 유통하는 (주)지에스씨인터네셔널(Seoul, Korea), (주)엠아이커피(Seoul, Korea) 및 (주)에이엠씨(Gyeonggi-do, Korea)의 3곳 공급업체를 통하여 총 30여종의 각기 다른 원산지와 품종의 커피생두를 구입하였다. 구입한 커피생두는 각각 100 g(수분함량 13~ 14%)을 칭량하여 중량 대비 2배수의 물로 2시간 동안 30℃에서 침지하여 조직을 연화시킨 후 물기를 제거하고, 생두의 내부까지 충분한 열전달을 위해 121℃에서 120분간 고압멸균하였다. 멸균된 30종의 커피생두에 확보한 홍국균 균사체 종균 10 mL를 접종하고, 25℃에서 모두 10일 동안 고체배양하였으며, 발효가 종료된 커피생두는 50℃ drying oven(Jeiotech)에서 48시간 동안 건조하여 수분을 제거한 30종의 홍국균 균사체-커피생두 고체 발효물로 조제하였다.
- 30종의 홍국균 균사체-커피생두 고체발효물은 coffee roaster (Genecafe, Gyeonggi-do, Korea)에서 중배전(235~240℃, 12~13분간 로스팅)하여 각각의 원두커피(roasted coffee)로 조제한 후, coffee grinder(Bazzatra, Gyeonggi-do, Korea)를 이용하여 동일 크기로 분쇄하였다. 균사체-커피생두 발효물로부터 조제된 원두커피 열수추출물은 원두커피에 20배 물을 가한 후, decoction법을 이용하여 2시간 동안 half volume이 되도록 추출하였으며(over 90℃), Whatman No. 2 여과지(GE healthcare, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 잔사를 제거하였다. 추출 여과액은 원심분리(7,600×g, 4℃, 30분)로 불용성 침전물을 제거하고, 상등액은 농축 및 동결건조하여 30종의 홍국균 균사체-커피생두 발효물로부터 조제된 원두커피의 열수추출물로 조제하였다(Table 1).
- 기능성 원두커피의 산업적 개발 가능성을 검토하기 위하여 국내에 수입되는 30여종의 산지별 및 품종별 커피생두에 홍국균(Monascus ruber, MR) 균사체를 고체 발효시켜 MR 균사체-커피생두(green coffee bean) 발효물을 조제한 후, 중배전을 통해 품종에 따른 MR 균사체-원두커피(roasted coffee)로 제조하였다. 커피는 전 세계적으로 다양한 품종이 재배되고 있으나, 상업적으로 재배하는 주요 품종은 세계 산출량의 약 70%를 차지하고 있는 아라비카종(Coffea arabica L.
- 따라서 본 실험에서 사용된 커피생두의 품종도 순수 로부스타종인 Vietnam Robusta(26번), 로부스타종과 아라비카종이 섞인 브라질산 Santos 또는 Cerrado(3, 18 및 30번) 및 Indonesia Mandheling(4, 13, 21번)을 제외하고는 모두 순수 아라비카종을 구입하여 진행하였다. 다음으로 이와 같이 제조된 30여종 MR-원두커피의 다양한 생리활성 (항산화, 항염증 및 지방세포 분화억제능 등)을 측정하기 위하여 각 시료에 20배의 물을 첨가한 후 decoction시킴으로써 MR-원두커피의 열수추출물을 조제하였다. 원두커피의 열수 추출물 수율은 Table 1에 나타내었는데, 커피생두의 품종이 많아서 열수로 1회만 추출하였기 때문에 Shin 등(2013)의 연구결과에 비해 수율은 전반적으로 낮았으나, MR-Indonesia Mandheling 커피생두로부터 조제된 원두커피 열수추출물(시료번호 4, 13 및 21번)이 공급업체에 따라 차이를 보이지 않으면서 모두 높은 수율을 보여주었다(발효물 대비 13.
- 따라서 본 연구에서는 MR-커피생두 발효물로부터 조제된 원두커피 열수추출물 30종의 대표적인 염증매개인자로 알려진 TNF-α 및 NO의 생성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 먼저, RAW 264.7 세포에 대한 항염증 실험을 진행하기에 앞서 원두커피 열수추출물의 세포독성이 없는 농도조건을 확립하기 위해 동일 세포주에 대한 독성 여부를 CCK-8 kit를 사용하여 확인하였다. Table 2에 나타낸 바와 같이, MR-커피 생두 발효물의 원두커피 열수추출물 30종은 모두 1,000 μg/ mL의 시료농도에서 saline 대조군의 1.
- 구입한 커피생두는 각각 100 g(수분함량 13~ 14%)을 칭량하여 중량 대비 2배수의 물로 2시간 동안 30℃에서 침지하여 조직을 연화시킨 후 물기를 제거하고, 생두의 내부까지 충분한 열전달을 위해 121℃에서 120분간 고압멸균하였다. 멸균된 30종의 커피생두에 확보한 홍국균 균사체 종균 10 mL를 접종하고, 25℃에서 모두 10일 동안 고체배양하였으며, 발효가 종료된 커피생두는 50℃ drying oven(Jeiotech)에서 48시간 동안 건조하여 수분을 제거한 30종의 홍국균 균사체-커피생두 고체 발효물로 조제하였다.
- 이후 2일 간격으로 10% FBS만이 함유된 DMEM으로 배지를 교환하면서 세포의 지방 분화 상태를 확인하였으며, 시료는 day 0과 day 3에 2회 처리 하고, 대조군에는 시료대신 saline을 처리하였다. 분화를 유도한 지 7일 후(day 7), 생성된 중성지방의 양을 측정하기 위해 배양액을 제거하고 PBS로 2번 세척하였으며, 회수한 세포를 10% formalin이 함유된 PBS로 20분간 고정하였다. 이후 formalin 을 제거한 다음 증류수로 4회 세척한 세포는 0.
- 5%(w/v) Oil red O working solution/60% isopropanol 용액을 첨가하여 20분간 세포 내 중성지방을 염색하였다. 염색된 세포 내 중성지방은 100% isopropanol로 추출하여 520 nm로 흡광도를 측정하고, 지방의 분화 정도는 일반배지(10% BS/DMEM)에 saline이 첨가된 미분화 대조군에 대한 relative activity(%)로 나타내고, 분화유도 배지에 시료 대신 saline이 첨가된 분화 대조군에 대해서는 inhibitory activity(%)로 표시하였다.
- 원두커피의 다양한 생리활성을 증진시키기 위하여 홍국균 (Monascus ruber, MR) 균사체와 30여종의 산지별 및 품종별 커피생두를 고체 발효하여 MR-커피생두 발효물로 조제하였다. 건조시킨 30종의 산지별 및 품종별 MR-커피생두 발효물은 중배 전 조건에서 로스팅하여 원두커피로 조제한 후, 열수 추출을 통해 MR-커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물로 각각 조제하였다.
- 이 용액에 시료 50 μL를 가한 후 상온에서 60분간 방치하여 반응 액의 흡광도 변화를 측정하였으며, 표준물질인 L-ascorbic acid 에 대한 mg ascorbic acid equivalents antioxidant capacity(AEAC)/ 100 mg 추출물로 비교, 산출하여 나타내었다.
- Confluent로부터 2일 후(day 0), 분화를 유도하기 위한 분화 유도 배지(MDI)로 10% FBS와 5 μg/mL의 insulin (INS, Sigma), 517 nM의 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX, Sigma), 1 μM의 dexamethasone(DEX, Sigma)이 함유된 DMEM으로 교환하고, 분화유도 3일 후(day 3)에는 10% FBS와 insulin만이 함유된 DMEM 배지로 교환하였다. 이후 2일 간격으로 10% FBS만이 함유된 DMEM으로 배지를 교환하면서 세포의 지방 분화 상태를 확인하였으며, 시료는 day 0과 day 3에 2회 처리 하고, 대조군에는 시료대신 saline을 처리하였다. 분화를 유도한 지 7일 후(day 7), 생성된 중성지방의 양을 측정하기 위해 배양액을 제거하고 PBS로 2번 세척하였으며, 회수한 세포를 10% formalin이 함유된 PBS로 20분간 고정하였다.
- 즉, 7.4 mM 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS, Sigma-Aldrich)와 2.6 mM potassium persulphate를 12시간 이상 암소에서 방치하여 청록색의 ABTS 양이온을 형성시킨 후, 이용액을 734 nm에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 몰 흡광계수(ε =3.6×104M－1cm－1)를 이용하여 증류수로 희석하였다.
- 즉, Folin-Ciocalteus’ reagent가 알칼리 조건에서 시료의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원되면 청색에서 노란색으로 발색되는 원리를 이용하여, 추출물 시료 100 μL에 알칼리 조건을 형성하기 위해 2% Na2CO3을 2mL를 가한 후 3분간 반응시키고, 50%의 FolinCiocalteus’ reagent(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 μL를 첨가해 30분간 반응시킨 후 반응액을 750 nm에서 측정함으로써 총 폴리페놀의 함량을 확인하였다.
- 지방 분화 억제능을 확인하기 위해 3T3-L1 지방전구세포는 24 well tissue culture plate에 5×104 cells/well로 분주하고, 세포 증식 기에는 10% BS을 함유한 DMEM으로 confluent(day 2) 때까지 2일 간격으로 배지를 교환하면서 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 추출 여과액은 원심분리(7,600×g, 4℃, 30분)로 불용성 침전물을 제거하고, 상등액은 농축 및 동결건조하여 30종의 홍국균 균사체-커피생두 발효물로부터 조제된 원두커피의 열수추출물로 조제하였다(Table 1).
대상 데이터
- )과 약 30%를 차지하고 있는 로부스타종(Coffea canephora)으로 구분되어진다(Kim 등 2014). 따라서 본 실험에서 사용된 커피생두의 품종도 순수 로부스타종인 Vietnam Robusta(26번), 로부스타종과 아라비카종이 섞인 브라질산 Santos 또는 Cerrado(3, 18 및 30번) 및 Indonesia Mandheling(4, 13, 21번)을 제외하고는 모두 순수 아라비카종을 구입하여 진행하였다. 다음으로 이와 같이 제조된 30여종 MR-원두커피의 다양한 생리활성 (항산화, 항염증 및 지방세포 분화억제능 등)을 측정하기 위하여 각 시료에 20배의 물을 첨가한 후 decoction시킴으로써 MR-원두커피의 열수추출물을 조제하였다.
- 또한, 항염증실험의 염증유도에 사용된 lipopolysaccharide(LPS from Escherichia coli)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 염증성 사이토카인인 tumor necrosis factor(TNF)-α 및 interleukin(IL)-6는 BD Bioscience(San Diego, CA, USA)의 ELISA kit를 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에서 커피생두의 고체발효를 위해 사용한 홍국균 균사체(Monascus ruber, MR)는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터(Gyeonggi-do, Korea)로부터 분양받았으며, 균사체는 potato dextrose agar(Difco, Detroit, MI, USA) 평판배지에서 25℃로 약 7~10일간 배양한 후 potato dextrose broth (Difco)가 담긴 Erlenmeyer flask에 접종하고, shaking incubator (Jeio tech, Daejeon, Korea)에서 약 5일마다 계대 배양하였다. 커피생두 고체발효용 홍국균 균사체는 PDB 배지에서 3회 정도 계대배양한 종균을 실험에 사용하였다.
- 본 연구의 소재가 되는 커피는 다양한 원산지로부터 커피생두(green coffee bean, GCB)를 직수입하여 국내로 유통하는 (주)지에스씨인터네셔널(Seoul, Korea), (주)엠아이커피(Seoul, Korea) 및 (주)에이엠씨(Gyeonggi-do, Korea)의 3곳 공급업체를 통하여 총 30여종의 각기 다른 원산지와 품종의 커피생두를 구입하였다. 구입한 커피생두는 각각 100 g(수분함량 13~ 14%)을 칭량하여 중량 대비 2배수의 물로 2시간 동안 30℃에서 침지하여 조직을 연화시킨 후 물기를 제거하고, 생두의 내부까지 충분한 열전달을 위해 121℃에서 120분간 고압멸균하였다.
- 실험에 사용된 3T3-L1 세포는 American type culture collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였고, 10% bovine serum(BS, Gibco, NY, USA)과 100 U/mL의 penicillin, 100 μg/ mL의 streptomycin이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 의 조건에서 3일마다 계대배양하며 사용하였다.
- 본 연구에서 커피생두의 고체발효를 위해 사용한 홍국균 균사체(Monascus ruber, MR)는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터(Gyeonggi-do, Korea)로부터 분양받았으며, 균사체는 potato dextrose agar(Difco, Detroit, MI, USA) 평판배지에서 25℃로 약 7~10일간 배양한 후 potato dextrose broth (Difco)가 담긴 Erlenmeyer flask에 접종하고, shaking incubator (Jeio tech, Daejeon, Korea)에서 약 5일마다 계대 배양하였다. 커피생두 고체발효용 홍국균 균사체는 PDB 배지에서 3회 정도 계대배양한 종균을 실험에 사용하였다.
- 항염증 활성실험에 사용된 murine macrophage cell line인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양 받았으며, GenDEPOT(Houston, TX, USA)에서 구입한 10% Fetal bovine serum(FBS), 100 U/mL의 penicillin과 100 μg/mL의 streptomycin(GenDEPOT)이 함유된 DMEM(GenDEPOT) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기(Vision Scientific, Gyeonggi, Korea)에서 2~3일 간격으로 계대하면서 배양하였다.
이론/모형
- 30종의 홍국균-커피생두 발효물로부터 조제된 원두커피 열수추출물의 총 폴리페놀 화합물 함량은 Folin-Ciocalteu법(Velioglu 등 1998)을 이용하여 측정하였다. 즉, Folin-Ciocalteus’ reagent가 알칼리 조건에서 시료의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원되면 청색에서 노란색으로 발색되는 원리를 이용하여, 추출물 시료 100 μL에 알칼리 조건을 형성하기 위해 2% Na2CO3을 2mL를 가한 후 3분간 반응시키고, 50%의 FolinCiocalteus’ reagent(Sigma-Aldrich, St.
- LPS로 유도된 TNF-α 및 nitric oxide(NO) 억제능은 세포배양 상등액 50μL를 취하여 BD Bioscience사의 instruction manual에 의한 ELISA법 및 Griess reagent 반응법(Fox JB 1979)을 이용하여 측정하고, LPS 처리군에 대한 억제율(%)로 나타내었다.
- 7 cells (2×105 cells/well) were treated with 1,000 μg/mL of hot-water extracts for 24 hours. The cell viability were determined by CCK-8 kit assay.
- 표준물질로는 gallic acid를 사용하여 검량선을 작성한 후 총 폴리페놀 화합물 함량을 gallic acid에 대한 mg gallic acid equivalents(GAE)/100mg 추출물로 나타내었다. 한편, 화학적으로 안정한 free radical인 ABTS cation을 이용한 decolorization assay에 의한 총 항산 화력은 Choi 등(2006)의 방법에 의하여 측정하였다. 즉, 7.
성능/효과
- 30종의 MR-커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물(MDI 분화배지에 추출물 첨가군)은 100 μg/mL의 시료농도에서 지방생성 억제능을 전혀 나타내지 못했으나(data not shown), 시료농도가 1,000 μg/mL로 증가함에 따라 분화 유도 대조군에 비해 15.9~63.4%의 수준으로 억제활성이 증가됨을 확인할 수 있었다.
- 30종의 MR-커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물에 대한 NO 억제활성은 Fig. 4에 나타내었는데, 100 μg/mL의 시료농도에서 억제활성은 전반적으로 유사 했으나(LPS 유도군의 11.3-17.9% 억제), 1,000 μg/mL의 시료 농도에서는 20.9~36.1%로 억제활성이 모두 유의적으로 증가했으며, 특히 같은 품종이지만 다른 공급업체인 4번과 13번 (MR-Indonesia Mandheling 커피생두로부터 조제된 원두커피 열수추출물)에서 억제활성이 우수한 것으로 나타났다(각각 33.3 과 36.1% 억제).
- 그러나 본 연구결과에서는 동일하게 발효를 진행한 30종의 원두커피 중에서 아라비카종인 Ethiopia Sidamo G2 커피가 가장 높은 폴리페놀 함량을 나타낸 것으로 보아, 이는 발효과정을 통하여 커피 속 다양한 성분이 폴리페놀성 물질로 전환되었을 가능성을 제시하는 것으로 사료될 수 있다. ABTS를 이용한 라디칼 소거능 측정결과도 총 폴리 페놀 함량과 유사한 결과를 나타내었는데, 8번 시료인 MR- Ethiopia Sidamo G2 커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물 (25.41 mg AEAC/100 mg)과 26번 시료인 MR-Vietnam Robusta 커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물(19.93 mg AEAC/ 100mg)이 다른 원두커피 열수추출물에 비해 높은 자유라디칼 소거활성을 보여주었다(Fig. 2). 원두커피의 항산화활성 역시 아라비카종에 비해 로부스타종에서 높다고 알려져 있으며, 항산화활성에 관여하는 성분으로는 chlorogenic acid(Sato 등 2011; Yen 등 2005)를 비롯하여 배전공정 중 화학적으로 쉽게 분해되어 형성하는 caffeic acid, cinnamic acid 및 ferulic acid 등의 함량 역시 아라비카종에 비해 로부스타종에서 높다고 이미 보고되어 있다(Trugo & Macrae 1984a; Trugo & Macrae 1984b; Clifford & Jarvis 1988).
- TNF-α 억제활성의 경우(Fig. 3), 시료농도 100 μg/mL에서는 모든 MR-커피생두 발효물로부터 조제된 원두커피 열수추출물에서 억제활성을 나타나지 못했지만(p>0.05), 1,000 μg/mL의 시료농도에서 모든 MR-커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물들이 LPS 자극군에 비해 유의적인 억제효과를 나타내었으며(p<0.05), 특히 26번 시료인 MR-Vietnam Robusta 커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물이 가장 우수한 TNF-α 억제능을 보여주었고, 이는 LPS 자극군과 비교하여 73.7%의 억제효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
- ruber) 균사체-커피생두 발효물의 원두커피 결과를 바탕으로, 다양한 산지별 및 품종별 커피로 확대하여 최적의 생리 활성 증진을 갖는 커피품종을 선정함으로써 향후 산업적으로 이를 활용하고자 하였다. 결론적으로, MR-Indonesia Mandheling 커피생두 발효물의 원두커피는 수율과 NO 생성을 억제하는 항염증 활성을, MR-Ethiopia Sidamo G2 커피생두 발효물의 원두커피는 항산화활성을, 그리고 MR-Vietnam Robusta 커피 생두 발효물로부터 조제된 원두커피는 항산화활성과 함께 항지질대사 활성이 각각 우수한 것으로 나타났다. 향후 이들 각각의 홍국균-커피생두 발효물의 원두커피에서의 생리활성 증진이 배양된 홍국균 균사체의 단순한 효과가 아닌 발효과 정에 의해 균사체의 생물학적 전환이 유도되었음을 명백히 밝히기 위해서 다양한 생리활성 성분의 분석과 함께 활성획 분의 정제 및 활성성분의 구조동정 등을 진행할 예정이다.
- 5~2배가량 높다고 이미 보고되어 있다(Hečimović 등 2011). 그러나 본 연구결과에서는 동일하게 발효를 진행한 30종의 원두커피 중에서 아라비카종인 Ethiopia Sidamo G2 커피가 가장 높은 폴리페놀 함량을 나타낸 것으로 보아, 이는 발효과정을 통하여 커피 속 다양한 성분이 폴리페놀성 물질로 전환되었을 가능성을 제시하는 것으로 사료될 수 있다. ABTS를 이용한 라디칼 소거능 측정결과도 총 폴리 페놀 함량과 유사한 결과를 나타내었는데, 8번 시료인 MR- Ethiopia Sidamo G2 커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물 (25.
- 1과 2에 각각 나타내었다. 먼저, 항산화 활성이 강하다고 알려져 있는 총 폴리페놀 함량의 측정결과(Fig. 1), 8번 시료인 MR-Ethiopia Sidamo G2 커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물(3.08 mg GAE/100 mg)과 26번 시료인 MR-Vietnam Robusta 커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물(2.52 mg GAE/100 mg)이 다른 원두커피 열수 추출물에 비해서 우수한 폴리페놀 함량을 나타내었다. 일반적으로 원두커피의 폴리페놀 함량은 아라비카종에 비해 로부스타종에서 약 1.
- 지방전구세포로부터 지방세포로의 분화는 뚜렷이 형태학적 또는 생화학적 변화를 보이는데, 3T3-L1 세포처럼 이미 확립된 지방전구세포나 지방조직 유래의 기질전구세포는 in vitro에서 지방세포 생성의 과정을 관찰하는데 널리 이용되어 왔다. 본 연구에서 3T3-L1 지방전구세포의 지방생성 억제에 미치는 영향을 Oil red O staining으로 비교한 결과, 분화를 유도시킨 대조군(MDI 분화배지에 saline 첨가군)에서 생성된 중성지방은 미분화 유도군(일반배지에 saline 첨가군)에 비해 7.2배의 지방생성량을 나타내었다. 30종의 MR-커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물(MDI 분화배지에 추출물 첨가군)은 100 μg/mL의 시료농도에서 지방생성 억제능을 전혀 나타내지 못했으나(data not shown), 시료농도가 1,000 μg/mL로 증가함에 따라 분화 유도 대조군에 비해 15.
- 건조시킨 30종의 산지별 및 품종별 MR-커피생두 발효물은 중배 전 조건에서 로스팅하여 원두커피로 조제한 후, 열수 추출을 통해 MR-커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물로 각각 조제하였다. 조제한 원두커피 열수추출물 중, MR-Indonesia Mandheling 커피생두 발효물로부터 조제된 원두커피 열수추 출물은 가장 우수한 추출수율을 나타내었으며(15.5%), MR-Ethiopia Sidamo G2 커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물은 유의적으로 가장 우수한 총 폴리페놀 함량(3.08 mg GAE/100 mg) 및 ABTS 라디칼 소거능(25.41 mg AEAC/100 mg)을 나타내었다. 한편, MR-Vietnam Robusta 커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물은 LPS로 유도한 RAW 264.
- 4%의 수준으로 억제활성이 증가됨을 확인할 수 있었다. 특히 26번 시료인 MR-Vietnam Robusta 커피생두 발효물로부터 조제된 원두커피 열수추출물의 경우 분화 유도군에 비해 63.5.%의 지방생성이 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 5). 이러한 결과는 로부 스타종이 아라비카종에 비해 높게 함유하고 있는 항비만 성분인 caffeine 또는 chlorogenic acid(Cho 등 2010; Hsu 등 2006) 에 따른 결과일 수도 있으나, 홍국균의 발효과정을 통해 강력한 콜레스테롤 합성 억제력인 가지는 모나콜린류(Endo A 1980; Endo 등 1985) 등 2차 대사산물(secondary metabolite)의 생산에 기인할 수도 있을 것이라고 사료된다.
- 한편, MR-Vietnam Robusta 커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물은 LPS로 유도한 RAW 264.7 세포의 TNF-α 생성을 유의적으로 억제할 뿐 아니라(LPS 유도군의 73.7% 억제), 3T3-L1 지방전구세포의 지방생성능을 효과적으로 억제하는 항지질대사 활성(분화 유도군의 63.5% 억제)을 나타내었다.
후속연구
- 5% 억제)을 나타내었다. 결론적으로, 이러한 결과를 통해 Monascus ruber 균사체의 고체배양을 이용한 Ethiopia Sidamo G2와 Vietnam Robusta 커피 생두 발효물로부터 조제된 원두커피는 다른 산지 및 품종보다도 기능성 커피음료로의 활용에 좋은 소재가 될 것으로 사료된다.
- 원두커피의 항산화활성 역시 아라비카종에 비해 로부스타종에서 높다고 알려져 있으며, 항산화활성에 관여하는 성분으로는 chlorogenic acid(Sato 등 2011; Yen 등 2005)를 비롯하여 배전공정 중 화학적으로 쉽게 분해되어 형성하는 caffeic acid, cinnamic acid 및 ferulic acid 등의 함량 역시 아라비카종에 비해 로부스타종에서 높다고 이미 보고되어 있다(Trugo & Macrae 1984a; Trugo & Macrae 1984b; Clifford & Jarvis 1988). 그러나 8번 시료인 MR-Ethiopia Sidamo G2 커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물이 총 폴리페놀 성분과 더불어 라디칼 형성을 억제하는 항산화활성이 다른 MR-커피생두 발효물의 원두커피 열수추출물보다도 월등히 우수하게 나타냄으로써, 추후 Ethiopia Sidamo G2 커피가 홍국균 균사체에 의해 발효되기 전후를 비교함으로써 항산 화활성의 증강 여부를 확인할 필요가 있을 것으로 사료된다.
- 하지만 이와 같은 생리활성에 관한 연구 이외에도 커피의 과다 섭취로 야기되는 카페인 중독증(caffeinism)을 비롯한 정서불안, 신경과민, 수면장애 및 위장장애 등의 부정적인 연구도 함께 보고되어 있다(Mackay & Rollins 1989; McMullen 등 2011). 따라서 커피의 유용성분 증진과 함께 유해성분을 감소시키기 위해 생물학적 전환(발효) 등을 이용한 다양한 공정 개발과 이에 따른 기능성커피의 개발은 일상적으로 섭취하는 기호식품을 통한 새로운 커피시장의 개척 및 다양한 대사성 질환 예방에 크게 기여할 수 있다고 사료된다.
- 특히, 홍국균 2종(Monascus purpureus 및 Monascus ruber)으로 고체 배양한 Indonesia Mandheling 원두커피는 다른 진균류 균사체의 고체배양을 이용해 조제된 원두커피 또는 일반 원두커피에 비해 항산화 및 면역 활성이 유의적으로 증가했으며, 카페인 함량에 영향을 주지 않으면서 클로로겐산을 유의적으로 증가시킴을 확인하였다(Shin 등 2013). 또한 그 연구를 바탕으로 M. purpureus 균사체를 다양한 산지별 및 품종별 커피생두에 각각 고체 배양한 발표커피를 조제하여 항산화, 항염증 및 지방생성 억제활성을 평가하였으며, 30종의 커피품종 중에서 Vietnam Robusta 발효커피가 기능성 커피음료 및 기능성소재로의 활용에 좋은 소재가 될 수 있을 것으로 제시한 바 있다(Kim 등 2014). 따라서 본 연구에서는 이전까지의 연구결과를 바탕으로 발효특성이 다른 홍국균 균사체인 M.
- 이러한 홍국의 우수한 생리활성 효능을 새로운 건강기능식품 개발에 활용하려는 연구가 활발하게 이루어지고있는 가운데 홍국을 가공공정에 활용한 커피, 된장, 고추장, 발효 콩, 쿠키, 죽 등이 상품화 되고 있다(Kim 등 2014; Kim 등 2015; Kim & Rhyu 2000; Pyo & Lee 2007; Jeong 등 2013). 또한, 균사체가 가지는 생물학적 변환능력(biotransformation)을 이용하여 생리활성이 우수한 홍국균 균사체가 커피생두를 영양원으로 생육할 수 있다면, 커피가 가지는 다양한 생리 활성 성분이 홍국균 균사체의 약리작용과 더불어 시너지 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
- 5). 이러한 결과는 로부 스타종이 아라비카종에 비해 높게 함유하고 있는 항비만 성분인 caffeine 또는 chlorogenic acid(Cho 등 2010; Hsu 등 2006) 에 따른 결과일 수도 있으나, 홍국균의 발효과정을 통해 강력한 콜레스테롤 합성 억제력인 가지는 모나콜린류(Endo A 1980; Endo 등 1985) 등 2차 대사산물(secondary metabolite)의 생산에 기인할 수도 있을 것이라고 사료된다. 더욱이 이전 연구를 통해 저자들은 Indonesia Mandheling 커피가 홍국균 균사체와의 발효과정을 통해 caffeine의 함량은 유지한 채 chlorogenic acid의 함량을 유의적으로 증가시킨 결과를 보고하여 홍국균에 의한 커피의 생물학적 전환(biotransformation) 가능성을 제기하였었다(Shin 등 2013).
- 결론적으로, MR-Indonesia Mandheling 커피생두 발효물의 원두커피는 수율과 NO 생성을 억제하는 항염증 활성을, MR-Ethiopia Sidamo G2 커피생두 발효물의 원두커피는 항산화활성을, 그리고 MR-Vietnam Robusta 커피 생두 발효물로부터 조제된 원두커피는 항산화활성과 함께 항지질대사 활성이 각각 우수한 것으로 나타났다. 향후 이들 각각의 홍국균-커피생두 발효물의 원두커피에서의 생리활성 증진이 배양된 홍국균 균사체의 단순한 효과가 아닌 발효과 정에 의해 균사체의 생물학적 전환이 유도되었음을 명백히 밝히기 위해서 다양한 생리활성 성분의 분석과 함께 활성획 분의 정제 및 활성성분의 구조동정 등을 진행할 예정이다.
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