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문제 정의
- 또한, 자생 지역에 따른 활성에 대한 연구도 많이 부족한 실정이다. 따라서 본 연구팀은 선행연구를 통하여 엉겅퀴가 자생하는 환경에 따라 생리활성물질의 함량이 다름을 확인하였고, 이와 관련하여 항균 효과의 차이가 있을 수 있을 것으로 예측하여 본 연구를 통하여 자생 지역별 엉겅퀴의 항균활성능력 기초자료를 확보하고자 하였다.
- 한편, 항균활성 측정 시 배지의 상태(broth와 agar)에 따른 균의 생육 상태나 시료의 확산정도가 다르며, broth dilution 방법에 의한 항균력 검증에는 시료가 지닌 고유의 색이 MIC를 결정하는 탁도에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 항균 효과는 하나의 assay만으로 결정하기에 무리가 있어, 탁도(O.D.)에 영향을 미치지 않는 agar diffusion 방법으로 항균력을 측정하여 엉겅퀴 추출물의 항균활성의 근거를 확인하고자하였다.
제안 방법
- 3시간까지 Staphylococcus aureus를 제외하고 다른 균주들의 생장을 효과적으로 저해하였으며, 24시간까지 Bacillus cereus, Salmonella enterica, Vibrio vulnificus에 대하여 비교적 저농도의 MIC(93.75～375 μg/mL)를 나타내었다.
- 96-well plate(Falcon, NJ, USA)에 nutrient broth 120 μL에 균액 50 μL, 엉겅퀴추출물 희석액 50 μL을 차례대로 첨가하여 엉겅퀴 추출물의 최종 농도가 375 μg/mL이 되도록 맞추어 3시간마다 UV-spectrophotometer (SpectraMax M2, Molecular Decives, NJ, USA)를 이용해 흡광도 값을 측정하면서 24시간 동안 36.5˚C에서 배양하였다.
- MIC 측정은 생육저해효과와 동일한 방법으로 조사하였으며 엉겅퀴 추출물의 최종 농도를 0～750 μg/mL 농도로 희석하여 농도별로 식중독 균에 대한 생육곡선을 나타내어 엉겅퀴 추출물이 균의 생장을 저해하는 정도를 확인하였으며 6, 9, 24시간까지 생육 곡선 상에서 균의 생장(turbidity)이 검출되지 않는 최소 농도를 MIC(minimum inhibition concentration)로 설정하였다.
- 각 균주는 35% glycerol medium을 사용하여 -70˚C에서 저장, 보관하였다. Vibrio 균주를 제외한 다른 균주는 1 mL의 균액을 9 mL의 nutrient broth(Difco, MI, NJ, USA)배지에 접종하였고, Vibrio 균주는 3% NaCl을 첨가한 nutrient broth 배지에 접종하여 36.5˚C에서 2회 계대배양 하였다. 실험에 사용한 균액은 UV-spectrophotometer(SpectraMax M2, Molecular Decives, NJ, USA)를 이용하여 O.
- 농축한 추출물은 동결건조(PVTED 10R, Ilsin Lab, Yangin, Korea)하여 –20˚C에 저장하였다가 실험할 때 균의 생장에 영향을 주지 않는 2% 이하 농도의 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 시료로 사용하였으며 DMSO를 음성대조군으로 사용하였다.
- 3(약 107 CFU/mL) 농도로 일정하게 조정한 후 항균실험에 사용하였다. 배지는 균주의 특성에 맞도록 제조하여 121oC, 1.5기압 하에서 15분간 멸균하였고, 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였다.
- 5˚C에서 배양하였다. 생육저해효과는 식중독 균 각각의 생육곡선을 나타내어 엉겅퀴 추출물이 균의 생장을 저해하는 정도를 확인하였다.
- 식중독균의 생장억제효과를 확인하기 위하여(Jang M 등 2010)의 agar-well diffusion 방법을 수정하여 nutrient agar 배지를 petri dish에 준비하여 750 μg/mL의 농도로 용해한 1 mL의 엉겅퀴 추출물을 주입한 후 배지에 완전히 흡수되도록 상온에서 10분 방치하였다.
- 지역별 엉겅퀴의 건조시료 100 g에 중량대비 15배의 에탄올을 가하고 70˚C 수욕상에서 환류냉각하면서 6시간 추출한 후에 ADVANTEC paper(No.6) (ADVANTEC Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 여과하는 과정을 2번 거친 후 감압 농축기(EYELA N-1000, Riakikiai Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 농축하였다. 농축한 추출물은 동결건조(PVTED 10R, Ilsin Lab, Yangin, Korea)하여 –20˚C에 저장하였다가 실험할 때 균의 생장에 영향을 주지 않는 2% 이하 농도의 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 시료로 사용하였으며 DMSO를 음성대조군으로 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 실험균주는 국내 식중독의 주요 원인균주들로서 Table 1에 나타내었다. 각 균주는 35% glycerol medium을 사용하여 -70˚C에서 저장, 보관하였다.
- 본 연구에 사용한 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense)는 충남 예산(CN), 경기 포천(GG), 강원 평창(GW), 제주 제주(JJ) 및 전남 고흥(JN) 지역에서 자생하는 것으로 2011년 7월～8월까지 야산에서 채취하여 실험에 이용하였다. 채취한 엉겅퀴는 국립수목원 식물분류전문가에게 동일 품종임을 확인 받았으며, 종자와 뿌리부위를 제외한 지상부위를 사용하였다.
- 채취한 엉겅퀴는 국립수목원 식물분류전문가에게 동일 품종임을 확인 받았으며, 종자와 뿌리부위를 제외한 지상부위를 사용하였다. 세척 및 절단과정을 거친 뒤 동결건조 하였으며, 건조된 시료는 분쇄(Jam-606, Hanil, Seoul, Korea)한 뒤 모두 냉동보관(-70˚C)하면서 실험에 사용하였다.
- 5˚C에서 2회 계대배양 하였다. 실험에 사용한 균액은 UV-spectrophotometer(SpectraMax M2, Molecular Decives, NJ, USA)를 이용하여 O.D.600=0.2～0.3(약 107 CFU/mL) 농도로 일정하게 조정한 후 항균실험에 사용하였다. 배지는 균주의 특성에 맞도록 제조하여 121oC, 1.
- ussuriense)는 충남 예산(CN), 경기 포천(GG), 강원 평창(GW), 제주 제주(JJ) 및 전남 고흥(JN) 지역에서 자생하는 것으로 2011년 7월～8월까지 야산에서 채취하여 실험에 이용하였다. 채취한 엉겅퀴는 국립수목원 식물분류전문가에게 동일 품종임을 확인 받았으며, 종자와 뿌리부위를 제외한 지상부위를 사용하였다. 세척 및 절단과정을 거친 뒤 동결건조 하였으며, 건조된 시료는 분쇄(Jam-606, Hanil, Seoul, Korea)한 뒤 모두 냉동보관(-70˚C)하면서 실험에 사용하였다.
이론/모형
- 자생 지역별 엉겅퀴 추출물의 식중독 균의 생장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 broth-dilution method를 사용하여 실험하였다(Jang M 등 2010). 각각의 균주는 농도를 nutrient broth 배지를 넣어 O.
성능/효과
- 1). 24시간 배양하였을 때 엉겅퀴 시료가 첨가된 실험군에서는 첨가하지 않은 대조군에 비하여 균의 생장이 70～95%까지 감소하는 것으로 나타났다. 시료를 첨가하지 않은 모든 균주는 9～18시간 사이에 균의 생장이 급격히 증가하였으나 추출물을 처리한 실험군은 9～18시간 사이에 균의 생장을 효과적으로 제어되는 것이 관찰되어 엉겅퀴 추출물이 균의 생장 저해에 매우 효과적인 물질이라고 판단된다.
- Gram negative 균주인 Salmonella enterica (93.75～750 μg/mL)와 Vibrio vulnificus(93.75～750 μg/mL)에 대하여는 생육저해효과시험과 마찬가지로 효과적인 항균 활성이 확인되었으며, 모든 지역의 엉겅퀴 추출물이 24시간까지 95～100% 균의 생장을 저해하는 것으로 나타났다.
- 지역별 엉겅퀴 추출물은 Gram positive 균주들 중에서는 특히 Bacillus subtilis의 생장을 효과적으로 제어하는 것이 나타났으며, Cushnie TP와 Lamb AJ(2005)의 연구에서 플라보노이드가 특히 Bacillus subtilis에 대하여 강한 항균력을 나타낸다고 보고하여 본 연구와 유사하다. Gram negative 균주인 Salmonella enterica 및 Vibrio vulnificus는 시험 농도에서 24시간 동안 균의 생장을 완벽하게 억제시키는 것이 관찰되었다. 우리나라에서 Salmonella에 의한 식중독은 발생건수가 많을 뿐만 아니라 발생건수에 비해 환자 수는 더욱 많은 실정이다.
- 특히, gram negative 균주에 대하여 더욱 강력한 효과가 나타났다. Time killing assay 결과 항균활성이 24시간 동안 지속적으로 유지되며 엉겅퀴 추출물이 균의 생장을 탁월하게 저해하는 것을 확인하였다. 다섯 지역의 엉겅퀴 추출물 중에서 제주 지역과 강원 지역의 엉겅퀴 추출물로부터 비교적 강한 항균력을 확인 할 수 있었다.
- 각각의 실험은 모두 3회 반복 실시하였으며, 그 평균과 표준편차를 나타내었다. 모든 통계처리는 SPSS ver.
- 결론적으로 본 연구에 사용된 엉겅퀴 추출물은 자생 지역에 따라 유의적인 항균활성차이가 있었으나 모든 지역의 엉겅퀴 추출물이 모든 시험 균주의 생장을 유의적으로 저해하는 것으로 나타나 뛰어난 항균력이 검증되었다. 따라서 추후 천연 식품 보존료로서의 개발 가능성이 기대된다.
- 75～750 μg/mL), Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Vibrio vulnificus에 대하여는 24시간까지 균의 생장은 95%이상 저해하는 것으로 강력한 항균 활성을 보였다. 그 다음으로 강원지역의 엉겅퀴 추출물이 효과적으로 균의 생장을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 3시간까지 Staphylococcus aureus를 제외하고 다른 균주들의 생장을 효과적으로 저해하였으며, 24시간까지 Bacillus cereus, Salmonella enterica, Vibrio vulnificus에 대하여 비교적 저농도의 MIC(93.
- Time killing assay 결과 항균활성이 24시간 동안 지속적으로 유지되며 엉겅퀴 추출물이 균의 생장을 탁월하게 저해하는 것을 확인하였다. 다섯 지역의 엉겅퀴 추출물 중에서 제주 지역과 강원 지역의 엉겅퀴 추출물로부터 비교적 강한 항균력을 확인 할 수 있었다. 따라서 이러한 엉겅퀴의 우수한 항균활성능력이 천연 항균제재로서 식품보존료로 이용이 가능하리라 사료된다.
- 이들 용매는 폴리페놀과 플라보노이드 추출 및 정제에 주로 사용되는 용매로서 항균력이 이들 용매 분획물에서 강하게 나타난 것은 함유된 폴리페놀이 미생물의 생장에 영향을 주었을 것이라 사료된다. 본 연구결과에서 또한 강원 및 제주지역의 항균활성이 뛰어난 것은 이 두 지역의 엉겅퀴 추출물에 다량의 폴리페놀 및 플라보노이드가 함유되어 있어 이들 물질이 항균활성에 영향을 미치는 것으로 판단된다. 따라서 추후 엉겅퀴 항균활성 연구에서는 미생물 생장 저해에 영향을 주는 폴리페놀 및 플라보노이드의 성분 규명 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 본 연구는 국내 다섯 지역(충남, 경기, 강원, 제주 및 전남)에서 자생하는 엉겅퀴를 천연 생리활성 소재로 사용 하여 식중독 균 6종(Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica 및 Vibrio vulnificus)에 대하여 항균활성을 측정한 결과, 모든 시험 균주에 대하여 뛰어난 항균활성이 확인되었다. 특히, gram negative 균주에 대하여 더욱 강력한 효과가 나타났다.
- 본 연구에 사용된 시료의 농도에서는 균이 완전히 사멸하는(≥99%, colony가 관찰되지 않는 농도) minimum bactericidal concentration(MBC)는 관찰되지 않았다.
- 24시간 배양하였을 때 엉겅퀴 시료가 첨가된 실험군에서는 첨가하지 않은 대조군에 비하여 균의 생장이 70～95%까지 감소하는 것으로 나타났다. 시료를 첨가하지 않은 모든 균주는 9～18시간 사이에 균의 생장이 급격히 증가하였으나 추출물을 처리한 실험군은 9～18시간 사이에 균의 생장을 효과적으로 제어되는 것이 관찰되어 엉겅퀴 추출물이 균의 생장 저해에 매우 효과적인 물질이라고 판단된다. 지역에 따른 엉겅퀴 추출물 사이의 생육 저해 활성의 정도는 균주에 따라 차이가 있으나 가장 효과적이었던 것은 강원 및 제주 지역의 추출물로 나타났으며 그다음으로 경기, 전남, 충남 지역의 엉겅퀴 추출물 순으로 효과적이었다(p<0.
- 시험 용액 중 375 μg/mL 농도의 조제액을 24시간 동안 배양하면서 0, 3, 6, 9, 18, 24시간에 엉겅퀴 추출물이 식중독 균의 생장에 미치는 영향을 검토한 결과 모든 시험 균주에 대하여 유의적으로 균의 생장을 저해하는 효과를 볼 수 있었다(p<0.05)(Fig. 1).
- 앞의 두 시험법에서 효과적으로 항균력이 검증된 제주 및 강원 지역 엉겅퀴의 항균력을 agar plate에서 확인한 결과, 마찬가지로 모든 시험 균주에 대하여 엉겅퀴 추출물을 접종한 경우 엉겅퀴 추출물을 접종하지 않은 control에 비하여 적은 colony가 관찰되어 엉겅퀴 추출물의 뛰어난 항균력을 확인할 수 있었다. 본 연구에 사용된 시료의 농도에서는 균이 완전히 사멸하는(≥99%, colony가 관찰되지 않는 농도) minimum bactericidal concentration(MBC)는 관찰되지 않았다.
- 본 연구에 사용된 시료의 농도에서는 균이 완전히 사멸하는(≥99%, colony가 관찰되지 않는 농도) minimum bactericidal concentration(MBC)는 관찰되지 않았다. 엉겅퀴 추출물은 실험 농도 내에서 Vibrio vulnificus에 대하여 colony가 20개 이하로 생성되어 nutrient agar plate 상태에서 효과적으로 균의 생장 저해에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 그 다음으로 Salmonella enteria에 대하여 50개 이하의 colony를 생성하였다.
- 엉겅퀴 추출물의 자생 지역별 항균활성 차이는 Time killing assay를 통하여 자생 지역별 차이를 확인하긴 하였으나 그 차이가 미비하였던 반면 MIC 측정을 통하여 제주지역 엉겅퀴 추출물이 9시간까지 모든 균주에 대하여 MIC가 관찰되었고(93.75～750 μg/mL), Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Vibrio vulnificus에 대하여는 24시간까지 균의 생장은 95%이상 저해하는 것으로 강력한 항균 활성을 보였다.
- 지역에 따른 엉겅퀴 추출물 사이의 생육 저해 활성의 정도는 균주에 따라 차이가 있으나 가장 효과적이었던 것은 강원 및 제주 지역의 추출물로 나타났으며 그다음으로 경기, 전남, 충남 지역의 엉겅퀴 추출물 순으로 효과적이었다(p<0.05).
- 본 연구는 국내 다섯 지역(충남, 경기, 강원, 제주 및 전남)에서 자생하는 엉겅퀴를 천연 생리활성 소재로 사용 하여 식중독 균 6종(Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica 및 Vibrio vulnificus)에 대하여 항균활성을 측정한 결과, 모든 시험 균주에 대하여 뛰어난 항균활성이 확인되었다. 특히, gram negative 균주에 대하여 더욱 강력한 효과가 나타났다. Time killing assay 결과 항균활성이 24시간 동안 지속적으로 유지되며 엉겅퀴 추출물이 균의 생장을 탁월하게 저해하는 것을 확인하였다.
후속연구
- 다섯 지역의 엉겅퀴 추출물 중에서 제주 지역과 강원 지역의 엉겅퀴 추출물로부터 비교적 강한 항균력을 확인 할 수 있었다. 따라서 이러한 엉겅퀴의 우수한 항균활성능력이 천연 항균제재로서 식품보존료로 이용이 가능하리라 사료된다.
- 본 연구결과에서 또한 강원 및 제주지역의 항균활성이 뛰어난 것은 이 두 지역의 엉겅퀴 추출물에 다량의 폴리페놀 및 플라보노이드가 함유되어 있어 이들 물질이 항균활성에 영향을 미치는 것으로 판단된다. 따라서 추후 엉겅퀴 항균활성 연구에서는 미생물 생장 저해에 영향을 주는 폴리페놀 및 플라보노이드의 성분 규명 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 결론적으로 본 연구에 사용된 엉겅퀴 추출물은 자생 지역에 따라 유의적인 항균활성차이가 있었으나 모든 지역의 엉겅퀴 추출물이 모든 시험 균주의 생장을 유의적으로 저해하는 것으로 나타나 뛰어난 항균력이 검증되었다. 따라서 추후 천연 식품 보존료로서의 개발 가능성이 기대된다. 엉겅퀴는 국내 야생에 흔히 자생하는 식물자원이기 때문에 경제적으로 용이하게 접근할 수 있을 것이라 생각되며, 향이 은은하여 천연 식품보존료들이 흔히 갖고 있는 이취 등이 문제되지 않을 것이라 판단된다.
- 하지만 엉겅퀴의 항균활성에 대한 결과 보고가 미비한 상황이며, 아직 기초 연구단계 이므로 앞으로 더욱 광범위한 균주에 대한 연구가 필요하다. 또한 엉겅퀴의 우수한 항균활성능력을 추후 식품의 가공 및 생산 과정에 효과 적으로 적용시킬 수 있는 방법에 대한 연구 및 실제 식품의 형태에 적용하여 식품의 저장기간 동안 어떤 효과를 발휘하는지도 연구되어야 할 것이다.
- 엉겅퀴는 국내 야생에 흔히 자생하는 식물자원이기 때문에 경제적으로 용이하게 접근할 수 있을 것이라 생각되며, 향이 은은하여 천연 식품보존료들이 흔히 갖고 있는 이취 등이 문제되지 않을 것이라 판단된다. 하지만 엉겅퀴의 항균활성에 대한 결과 보고가 미비한 상황이며, 아직 기초 연구단계 이므로 앞으로 더욱 광범위한 균주에 대한 연구가 필요하다. 또한 엉겅퀴의 우수한 항균활성능력을 추후 식품의 가공 및 생산 과정에 효과 적으로 적용시킬 수 있는 방법에 대한 연구 및 실제 식품의 형태에 적용하여 식품의 저장기간 동안 어떤 효과를 발휘하는지도 연구되어야 할 것이다.
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