선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 15) 본 실험에서도 EGCG의 세포 증식에 관한 효과를 살펴보고자 하였다. 세포증식 조절에서 CSK와의 관계를 증명하기 위하여 CSK+/+와 CSK-/- MEF 세포를 제작하였다.
- CSK Kinase 활성에 대한 EGCG의 효과 − 다음으로 우리는 EGCG가 CSK의 인산화 또는 kinase 활성을 억제 할 수 있는지 확인하였다.
- 14) Kinase screening 실험을 통하여 EGCG 5 µM에 의해서 CSK가 억제됨을 확인하였다. 그래서 우리는 EGCG와 CSK가 서로 상호작용을 할 것으로 예상하고 실험을 진행하였다. 우선 EGCG와 CSK의 결합 능력을(binding affinity; Kd) GST pull-down assay와 3H-labeled EGCG를 이용하여 확인하였다.
- 그러나 EGCG와 CSK의 연관 관계에 대한 연구는 드물어 보다 면밀한 연구가 앞으로 더 진행되어야 할 것으로 사료된다. 따라서 본 실험은 다양한 농도의 EGCG를 적용하여 세포의 성장 및 CSK활성에 미치는 영향을 분석 평가하고자 한다.
제안 방법
- (Charlottesville, VA)와 1 µg의 unactive LCK 단백질 (millipore, MA, USA) 그리고 EGCG(0.5-20 µM), 100 µM ATP, 1 µCi의 [γ-32P]ATP를 반응시켰다.
- 그 결과, 대장암 세포주에서 정상 세포주보다 CSK의 발현이 현저히 증가되어 있는 것을 확인하였다.17) 유방암에 관한 CSK의 연구를 살펴보면, 정상 breast 조직과 breast tumor에서 CSK의 kinase 활성을 조사하였다. CSK는 정상 breast 조직과 breast carcinomas, 유방암 세포주에서 높은 발현과 kinase 활성을 나타내었다.
- 02 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1×proteinase inhibitor)에서 EGCG-Sepharose 4B beads와 반응시켰다. Bead는 완충용액(50 mM Tris, pH 7.5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 0.01% Nonidet P-40, 0.02 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)으로 5번 세척한 후 bead와 결합한 단백질을 autoradiography 또는 immunoblotting으로 분석하였다.
- CSK+/+와 CSK-/-세포에서의 20 µM EGCG 처리후 성장률을 3주간 관찰하였다.
- EGCG-Sepharose 4B와 L-[35S] Methionine-labeled CSK단백질 Pulldown Assays − Full-length CSK유전자 (pcDNA4/HIS/Max-CSK)를 TNT Quick Coupled Transcription/Translation System(Promega) 이용하여 L-[35S] methionine과 함께 in vitro translation 시켜서 라벨을 만들었다.
- 5, 1, 5, 10, or 20 µM)에서 72시간 동안 배양하였다. EGCG의 세포 성장 억제 효과를 측정하기 위하여 the Cell-Titer 96 AQueous One Solution cell proliferation assay kit(MTS)(Promega, Madison, WI)를 이용하였다. 시약을 각 well에 첨가하여 흡광도를 492 nm 파장에서 96-well plate reader(Labsystem Multiskan MS, Labsystem, Finland)로 결과를 측정하였다.
- CSK Kinase 활성에 대한 EGCG의 효과 − 다음으로 우리는 EGCG가 CSK의 인산화 또는 kinase 활성을 억제 할 수 있는지 확인하였다. Kinase 활성은 활성 CSK와 기질인 poly(Glu4-Tyr)펩타이드를 이용한 in vitro kinase assay를 통하여 측정하였다. 그 결과, EGCG는 농도의존적으로 CSK kinase 활성을 억제하였으며, 4 µM의 농도에서 50% 활성억제(IC50)를 보였다(Fig.
- 결합력 및 Kd측정 − GST-CSK의 결합력을 측정하기 위하여 GST fusion 단백질을 glutathione-Sepharose 4B beads와 한 시간 동안 상온에서 반응시켜 immobilization 하였다.
- 그 다음으로 CSK의 기질로 알려진 lymphocyte-specific protein tyrosine kinase(LCK)를 이용하여 EGCG가 CSK의 활성에 미치는 영향을 확인하였다. EGCG를 농도 별로 처리하였을 때 LCK의 인산화가 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(Fig.
- 2A). 그 다음으로 EGCG와 CSK의 결합을 EGCG-Sepharose 4B affinity chromatography 실험을 통하여 확인하였다. 그 결과 EGCG와 CSK는 complex를 이루는 것이 확인되었다(Fig.
- 다른 폴리페놀들(ECG, EGC, EC)과 EGCG의 CSK kinase 활성을 비교 실험하였다. EGCG는 다른 폴리페놀들에 비해 가장 강력하게 kinase 활성을 억제하였다(Fig.
- 또한 EGCG와 CSK 사이의 결합에 대한 구조적 관계를 좀 더 확실하게 파악하고자 우리는 CSK의 x-ray co-crystal 구조를 활용하여 EGCG의 결합 부위를 확인하였다(Fig. 2C).
- CSK+/+와 CSK-/-세포에서의 20 µM EGCG 처리후 성장률을 3주간 관찰하였다. 본 실험은 focus-forming 방법에 의해 수행하였으며 약 3주후 세포 콜로니를 methaol에 고정 후 0.4% crystal violet으로 염색 후 관찰 하였다
- 세포 성장 측정 − 세포(6×105)를 96-well plate에 24시간 동안 배양한 후 각각의 EGCG 농도(0, 0.5, 1, 5, 10, or 20 µM)에서 72시간 동안 배양하였다.
- 15) 본 실험에서도 EGCG의 세포 증식에 관한 효과를 살펴보고자 하였다. 세포증식 조절에서 CSK와의 관계를 증명하기 위하여 CSK+/+와 CSK-/- MEF 세포를 제작하였다. 두 세포에서 세포 성장에 미치는 EGCG의 영향을 조사하기 위해 MTS assay와 anchorage independent cell growth assay(Soft agar assay)를 실시한 결과 CSK knockout된 MEF 세포(CSK-/-)에서는 EGCG 처리와는 관계없이 세포 증식이 이루어졌으며, CSK+/+ MEF 세포에서는 EGCG 처리 농도 의존적으로 증식이 억제 되었다(Fig.
- EGCG의 세포 성장 억제 효과를 측정하기 위하여 the Cell-Titer 96 AQueous One Solution cell proliferation assay kit(MTS)(Promega, Madison, WI)를 이용하였다. 시약을 각 well에 첨가하여 흡광도를 492 nm 파장에서 96-well plate reader(Labsystem Multiskan MS, Labsystem, Finland)로 결과를 측정하였다. CSK+/+와 CSK-/-세포에서의 20 µM EGCG 처리후 성장률을 3주간 관찰하였다.
- 그래서 우리는 EGCG와 CSK가 서로 상호작용을 할 것으로 예상하고 실험을 진행하였다. 우선 EGCG와 CSK의 결합 능력을(binding affinity; Kd) GST pull-down assay와 3H-labeled EGCG를 이용하여 확인하였다. EGCG와 CSK의 결합 Kd 값은 0.
대상 데이터
- 재조합 CSK와 poly(Glu4-Tyr) peptide는 Upstate Biotechnology, Inc.(Charlottesville, VA)로 부터 구입하였다. ATP immobilized agarose 4B는 Fluka(St.
- (Charlottesville, VA)로 부터 구입하였다. ATP immobilized agarose 4B는 Fluka(St. Louis)에서 구입하여 사용하였다. EGCG, EC, ECG, EGC는 Dr.
- CNBr-Sepharose 4B, glutathione-Sepharose 4B, [γ-32P]ATP는 Amersham Biosciences에서 구입하여사용하였다.
- Louis)에서 구입하여 사용하였다. EGCG, EC, ECG, EGC는 Dr. Chi-Tang Ho(Rutgers University, Piscataway, NJ)로부터 제공받아 사용하였다.
- Zigang Dong (Cellular & molecular biology, Hormel institute, Austin, MN, USA)로 부터 제공받아 사용하였다. Jurkat와 CSK knockout MEF 세포는 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
- 반응 종결 후 scintillation counter를 이용하여 결과를 분석하였다. LCK 단백질의 인산화를 확인하기위해 anti-phospho-LCK(Tyr505) 항체(millipore, MA, USA)를 이용하였다.
- 3H]EGCG(13Ci/mmolin ethanol containing 8 mg/ml ascorbic acid)는 Dr. Yukihiko Hara(Food Research Laboratory, Mitsui Norin Co. Ltd., Fujieda, Shizuoka, Japan)로 부터 제공받아 사용하였다. 재조합 CSK와 poly(Glu4-Tyr) peptide는 Upstate Biotechnology, Inc.
- 세포배양 − Jurkat(clone E6-1) human T cell leukemia 세포와 CSK+/+와 CSK-/- MEF 세포는 Dr. Zigang Dong (Cellular & molecular biology, Hormel institute, Austin, MN, USA)로 부터 제공받아 사용하였다.
- 시약 및 시료 − 모든 배지는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)의 권장 배지를 사용하였고, fetal bovine serum(FBS) 시약은 Gemini Bio-Products(Calabasas, CA, USA)로 부터 구입하였다.
데이터처리
- 농도 의존적 분석을 위해서 EGCG 농도를 3 pM에서 50 µM 까지 사용하였다. Kd 측정은 Prizm 4.0 program(Graphpad Inc., San Diego, CA)을 사용하여 nonlinear regression 분석을 이용하였다.
- ECG, EGC, EC는 10 µM로 처리하였다. 반응 종결 후 scintillation counter를 이용하여 결과를 분석하였다. LCK 단백질의 인산화를 확인하기위해 anti-phospho-LCK(Tyr505) 항체(millipore, MA, USA)를 이용하였다.
성능/효과
- 14) Kinase screening 실험을 통하여 EGCG 5 µM에 의해서 CSK가 억제됨을 확인하였다.
- 2) 폴리페놀은 활성산소를 제거하고 지질과산화에 의한 생체의 순환기능 장애와 노화 등을 억제하는 항산화 기능을 가지고 있으므로 각종 질환의 예방과 치료에 이용된다.3) 또한 산화적 DNA 손상, 비정상적 세포증식, 세포의 돌연변이, 세포간 정보전달 등을 억제하므로 인해 발암과 관련된 과정에 항암효과를 가지며 단백질과 결합하여 신체대사에 관여하는 효소활성을 변화시키거나 화학물질의 독성 제거를 위한 유전자 발현을 촉진하는 작용을 한다.
- 보고된 연구에 의하면 hypoxanthine-xanthine oxidase system으로 생성된 ROS가 암세포의 침윤을 증가시킨다고 하였다.27) Ascorbic acid에서 유래한 지용성 asc-2-Ophosphate-6-O-palmitate(Asc2P6Plm) 혹은 carotenoid는 항산화작용을 통해 암세포의 침윤을 억제하였다.28) 뿐만 아니라, superoxide를 제거하는 효소인 Cu-Zn superoxide dismutase의 처치가 생쥐연구에서 암의 폐 전이를 억제하였다.
- 연구에 의하면 EGCG가 전사인자인 activator protein-1(AP-1)를 억제하여 유전자발현을 조절함을 보고하였다.31) VEGF 유전자 promoter는 여러 AP-1 결합부위를 가지기 때문에 EGCG는 전사인자인 AP-1의 활성을 감소시킴으로써 VEGF의 발현을 억제할 수 있다. 이상 종합해 볼 때, EGCG는 ERK-1과 ERK-2의 활성을 억제하거나, VEGF promoter에 전사인자 AP-1의 결합을 억제하여 VEGF 발현을 조절할 수 있다.
- 32) 또한 EGCG는 EGF가 EGFR에 결합하는 것을 차단하여 EGFR 인산화 활성을 억제하였다.33) EGCG가 EGFR 신호 전달계를 억제하는 정확한 기전은 잘 알려지지 않고 있지만, EGF 신호전달 억제는 EGCG의 항암효과가 암세포 성장억제와 함께 혈관신생 조절에 의해 일부분 매개될 수 있음을 제시한다.
- 17) 유방암에 관한 CSK의 연구를 살펴보면, 정상 breast 조직과 breast tumor에서 CSK의 kinase 활성을 조사하였다. CSK는 정상 breast 조직과 breast carcinomas, 유방암 세포주에서 높은 발현과 kinase 활성을 나타내었다.18)
- 그 다음으로 CSK의 기질로 알려진 lymphocyte-specific protein tyrosine kinase(LCK)를 이용하여 EGCG가 CSK의 활성에 미치는 영향을 확인하였다. EGCG를 농도 별로 처리하였을 때 LCK의 인산화가 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3C).
- 그 다음으로 EGCG와 CSK의 결합을 EGCG-Sepharose 4B affinity chromatography 실험을 통하여 확인하였다. 그 결과 EGCG와 CSK는 complex를 이루는 것이 확인되었다(Fig. 2B).
- 그 결과, EGCG는 농도의존적으로 CSK kinase 활성을 억제하였으며, 4 µM의 농도에서 50% 활성억제(IC50)를 보였다(Fig. 3A).
- 16) 다른 연구 그룹에서는 2개의 정상 대장 세포주와 18개의 대장암 세포주에서 CSK의 발현 정도를 확인하였다. 그 결과, 대장암 세포주에서 정상 세포주보다 CSK의 발현이 현저히 증가되어 있는 것을 확인하였다.17) 유방암에 관한 CSK의 연구를 살펴보면, 정상 breast 조직과 breast tumor에서 CSK의 kinase 활성을 조사하였다.
- 마지막으로는 matrix metalloproteinase의 생성을 억제하여 세포의 이동이나 침윤을 억제시키는 것이다. 다른 동물모델에서는 폴리페놀이 oxidative stress를 줄이고 phase II enzyme 활성이 유도되는 동안 phase I enzyme의 활성을 억제시키는 것으로 나타났다.35)
- 다른 연구에서는 EGCG가 p53 비의존적인 경로로 VEGF 및 MMP-9의 활성을 조절할 수 있는 것으로 나타났으며, p53 비의존적인 경로에서는 EGCG가 AMPK의 활성을 통해 암세포의 전이를 억제하는 것을 확인하였다.34)
- 세포증식 조절에서 CSK와의 관계를 증명하기 위하여 CSK+/+와 CSK-/- MEF 세포를 제작하였다. 두 세포에서 세포 성장에 미치는 EGCG의 영향을 조사하기 위해 MTS assay와 anchorage independent cell growth assay(Soft agar assay)를 실시한 결과 CSK knockout된 MEF 세포(CSK-/-)에서는 EGCG 처리와는 관계없이 세포 증식이 이루어졌으며, CSK+/+ MEF 세포에서는 EGCG 처리 농도 의존적으로 증식이 억제 되었다(Fig. 4A, B). EGCG는 CSK pathway를 통하여 세포 증식을 조절함을 알 수 있다.
- 본 실험의 결과로 EGCG가 CSK의 kinase 활성을 조절할 수 있음을 확인하였다. 아직까지 암에서 CSK의 명확한 기능이 밝혀져 있지 않은 상태에서 이런 EGCG의 조절은 암의 메커니즘에서 CSK의 역할을 설명할 수 있는 증거를 제시할 수 있다.
- 본 연구에서는 EGCG가 CSK 활성을 조절한다는 사실을 확인하였으며 EGCG는 암종 중에서 C-Src family kinase 발현이 높은 암종의 경우 암 예방에 있어서 효과적으로 작용할 수 있음을 제시한 결과이다.
- 31) VEGF 유전자 promoter는 여러 AP-1 결합부위를 가지기 때문에 EGCG는 전사인자인 AP-1의 활성을 감소시킴으로써 VEGF의 발현을 억제할 수 있다. 이상 종합해 볼 때, EGCG는 ERK-1과 ERK-2의 활성을 억제하거나, VEGF promoter에 전사인자 AP-1의 결합을 억제하여 VEGF 발현을 조절할 수 있다.
- 28) 뿐만 아니라, superoxide를 제거하는 효소인 Cu-Zn superoxide dismutase의 처치가 생쥐연구에서 암의 폐 전이를 억제하였다. 이상의 결과들은 EGCG와 같은 항산화제가 잠재적으로 항전이 약물로의 개발가능성이 있음을 시사한다.
후속연구
- 여러 선행 연구에 의하면 EGCG는 항암 효과를 가지면 CSK는 세포의 증식에 연관이 있다는 것이 확인되었다. 그러나 EGCG와 CSK의 연관 관계에 대한 연구는 드물어 보다 면밀한 연구가 앞으로 더 진행되어야 할 것으로 사료된다. 따라서 본 실험은 다양한 농도의 EGCG를 적용하여 세포의 성장 및 CSK활성에 미치는 영향을 분석 평가하고자 한다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.