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문제 정의
- Galactomannan을 함유한 콩의 발효식품은 우리나라를 비롯한 대부분의 아시아 국가뿐 아니라 아프리카 지역에서도 고유식품으로 이용되고 있으며, 이로부터 여러 종류의 Bacillus속 미생물이 비전분성 다당류의 분해효소를 생산하는 균주로 분리되고 그 효소의 특성이 연구되었다[10, 15, 21]. 본 연구에서는 산성조건에서 된장 발효미생물을 증균하여 이로부터 mannanase를 생산하는 Bacillus속 균주를 분리하고 효소 생산성과 특성을 조사하였다.
제안 방법
- 0 unit는 위의 조건에서 1분 동안 LBG로 부터 1 μmol 의 mannose에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. Mannanase 활성에 미치는 반응 온도와 pH의 영향을 조사하기 위하여 30-65℃와 pH 4.0-8.0의 범위에서 각각 효소 활성을 측정하였다. 효소 내열성은 30-60℃에서 mannanase 조효소액을 1시간 동안 방치한 후 잔존활성을 측정하여 결정하였고, pH 안정성을 조사하기 위해서는 pH 3.
- 0)이 각각 사용되었다. Mannanase에 의한 가수분해 산물을 분석하기 위해서는 0.5% 함량의 LBG, guar gum 또는 중합도가 2-6인 MOS를 각각 기질로 사용하였으며, 이들 기질과 20 mM citrate 완충액(pH 5.5)을 포함한 반응액에 과량의 효소를 첨가하여 45℃에서 5시간 반응 시킨 후 95℃에서 5분간 열처리하고 원심분리한 다음 상등액을 적정량 취해 chloroform, acetic acid와 증류수(4.3 : 5 : 0.7, (v/v)) 혼합용액을 전개용액으로 하여 silica gel-precoated thin layer plate (Merck, Kiesegel, No. 5748)에서 박층 크로마토그래피를 수행하였다. 전개된 물질을 발색시키기 위해서는 ethanol 9 ml, p-anisaldehyde 0.
- 0)으로 세척한 후 동일완충액에 15-30분간 방치하였다. Polyacrylamide gel을 꺼내어 동일한 완충용액에 0.2% LBG와 1.5% agar를 녹여 제조한 gel을 중층 하여 비닐로 봉입하고 50℃에서 4시간 반응시킨 후 중층한 gel을 congo red로 염색하여 분해된 부분을 관찰하였으며 polyacrylamide gel은 Coomassie brilliant blue 용액으로 염색하여 단백질을 관찰하였다.
- YB-1401은 된장을 pH 4.5의 조건에서 증균한 후 분리된 것이므로 산성조건에서 균의 성장도를 조사하기 위해 pH가 4.0과 4.5로 조절된 LB 액체 배지에서 16시간 동안 플라스크 배양을 하면서 배양액의 흡광도를 조사하였다. 그 결과 YB-1401은 pH 4.
- 그러므로 부가 탄소원이 Bacillus sp. YB-1401의 mannanase 생산성에 미치는 영향을 조사하기 위해 여러 종류의 탄수화물이 0.5% (w/v)가 되도록 각각 첨가된 LB 배지에서 배양온도를 37℃로 하여 24시간 동안 진탕 배양한 후 배양상등액에 존재하는 mannanase 활성을 조사하였다. 그 결과 곤약이 첨가된 배지에서 효소 생산성이 가장 높았으며, 이외에도 mannan 다당류를 함유한 LBG와 guar gum에 의해서도 그 생산성이 크게 증가하였다.
- 가정에서 제조된 된장 25점을 수집하여 pH를 4.5로 조절한 LB 배지에 접종하고 37℃에서 2일간 진탕 배양한 후 동일한 배지에 3일 간격으로 3회 계대 배양을 추가적으로 실시하였다. pH가 4.
- 된장으로부터 mannanase를 생산하는 내산성 Bacillus속 균주를 분리하기 위하여 pH를 4.5로 조절한 LB 액체배지에 충청도 지역의 가정에서 각각 제조된 25점의 된장 시료를 각각 접종하여 진탕 배양한 후 추가로 3회 계대 배양을 실시 하였다. 그 결과 마지막 계대 배양액 중에서 오직 1점의 시료에서만 균의 성장을 나타냈다.
- 또한 분리균 YB-1401의 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭한 후 1,496 bp 크기의 염기서열을 결정하고 (GenBank accession no. KJ57222) 이를 미국 NCBI의 BLAST 검색방법으로 16S rDNA database와 비교하였다. 그 결과 B.
- 분리균 YB-1401의 형태적 특성을 조사한 결과 포자를 형성하는 그람 양성 간균으로 확인되어 API 50 CHB와 20E kit를 사용하여 생화학적 특성을 조사하였다. Table 1에 보인 바와 같은 YB-1401의 생화학적 특성을 Biomériux의 API web (https://apiweb.
- 분리균의 형태적 관찰을 위해서는 그람염색과 포자염색을 실시하였으며, 배양된 균체 현탁액을 제조사의 지침에 따라 API 20E와 API 50 CHB kits (Bioméreux사, France)에 접종하고 37℃에서 배양하면서 1일과 2일째 각각 관찰하여 탄수화물 이용능과 생화학적 특성을 판별하였다. 분리균의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하기 위해서 분리균의 총 염색체 DNA를 주형으로 하고, 세균의 16S rRNA 유전자의 보존적 지역의 염기서열을 primers로 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 실시함으로써 얻은 PCR 산물을 정제하여 그 염기서열을 결정하였다[10].
- 분리균의 형태적 관찰을 위해서는 그람염색과 포자염색을 실시하였으며, 배양된 균체 현탁액을 제조사의 지침에 따라 API 20E와 API 50 CHB kits (Bioméreux사, France)에 접종하고 37℃에서 배양하면서 1일과 2일째 각각 관찰하여 탄수화물 이용능과 생화학적 특성을 판별하였다.
- 0의 범위에서 각각 효소 활성을 측정하였다. 효소 내열성은 30-60℃에서 mannanase 조효소액을 1시간 동안 방치한 후 잔존활성을 측정하여 결정하였고, pH 안정성을 조사하기 위해서는 pH 3.0-12.0 범위의 완충용액을 최종농도가 50 mM이 되도록 조효소액과 혼합하여 4℃에서 1시간 동안 방치한 후 mannanase 잔존활성을 측정하였다. 이때 pH를 조절하기 위해서 citrate 완충용액(pH 3.
대상 데이터
- 5로 조절한 LB 배지에 접종하고 37℃에서 2일간 진탕 배양한 후 동일한 배지에 3일 간격으로 3회 계대 배양을 추가적으로 실시하였다. pH가 4.5로 조절된 LB 평판배지(yeast extract, 5 g; tryptone, 10 g; NaCl, 5 g; agar, 15 g; water, 1 liter)에 계대 배양액을 도말하여 37℃에서 2일간 배양한 후 형성된 콜로니를 0.5% locust bean gum (LBG)이 첨가된 중성의 LB 평판배지에 접종하여 하룻밤 배양하고 congo red 용액 (0.2%)으로 염색하여 LBG 분해환을 생성하는 미생물을 mannanase 생산균으로 선발하였다.
- 배양액을 원심분리하여 얻은 배양상등 액을 ammonium sulfate (30-75%)로 처리한 후, 12,000 rpm에서 30분 동안 원심분리함으로써 상등액을 제거하였다. 단백질 침전물을 10 mM citrate 완충용액(pH 5.5)에 현탁하여 동일한 완충용액으로 투석한 후 이를 원심분리하고 상등액을 취해 mannanase 조효소액으로 사용하였다.
- 5) 에 도말하고 37℃에서 2일간 배양함으로써 2종류의 콜로니가 분리되었는데, 이로 보아 된장에 존재하는 내산성 세균의 종류가 적은 것으로 판단되었으며 이로 인하여 된장 시료 25점 중 오직 1점 시료의 접종액에서만 균의 성장을 보였던 것으로 추측된다. 한편 분리된 2개의 균주 중 YB-1401로 명명한 한 개의 균주가 LBG를 분해하는 균주로 판명되어 이를 mannanase 생산균으로 선발하였다.
성능/효과
- Mannanase에 의한 가수분해 산물을 조사하기 위해 중합도가 2-6인 MOS, LBG 와 guar gum을 기질로 하여 효소 반응을 실시한 후 가수분해 산물을 TLC로 분석한 결과 Fig. 5에 나타낸 바와 같이 mannobiose는 가수분해 되지 않았으며 이보다 중합도가 큰 MOS는 가수분해 되어 최종 산물로 mannotriose와 mannobiose가 다량 생성되었고 동시에 mannose도 소량 생성되었다. 그러나 mannotriose는 이보다 중합도가 큰 MOS에 비해 가수분해 정도가 미약한 것으로 확인되었으며 이러한 결과는 B.
- 0에서는 1시간 방치하였을 때 잔존활성이 46% 수준을 유지하여 pH 3-10의 범위에서 안정한 것으로 보고된 Thielavia arenaria XZ7 유래의 곰팡이 효소보다는 산성 조건에서 안정성이 낮은 것으로 나타났다[13]. Mannanase의 열안정성을 조사한 결과 45℃ 이하에서 1시간 동안 방치하였을 때 실활되지 않았으나, 50℃ 이상에서는 실활되기 시작하여 50℃에서는 52%, 55℃에서는 15% 정도의 잔존활성을 보였다. 이로 보아 YB-1401의 mannanase는 B.
- Table 1에 보인 바와 같은 YB-1401의 생화학적 특성을 Biomériux의 API web (https://apiweb.biomerieux.com/jsp/login.jsp)에서 다른 균주와 비교한 결과 Brevibacillus laterosporus와 유사도(61.1%)가 가장 높았으며, Bacillus subtilis 및 B. amyloliquefaciens와는 26.9%, B. pumilus와는 11%의 유사도를 보였다.
- pH 3-12의 범위에서 mannanase의 안정성을 조사한 결과 pH 3.5-10에서 1시간 동안 방치하였을 때 실활되지 않았으며, pH 11.0에서도 99%의 잔존활성을 보였다(Fig. 3). 이로 보아 내산성 균주로 분리된 YB-1401가 생산하는 mannanase 는 최적 반응 pH는 Bacillus속 균주 유래 mannanases들과 유사하였지만, pH 4-9의 범위내에서 안정한 것으로 알려진 B.
- 배양시간에 따른 mannanase 생산성을 조사하기 위해 곤약 (4%)을 첨가하거나 첨가하지 않은 LB 배지에서 36시간 동안 배양하면서 mannanase 생산성과 성장도를 조사한 결과, 곤약을 첨가하지 않은 LB 배지에서 9시간 배양 후에 균의 성장이 최대에 이르렀으나 효소 생산성은 1 U/ml 미만으로 매우 낮았다. 곤약을 첨가한 배지에서는 배양시간이 9시간이 되었을 때 mannanase 생산성이 10.2 U/ml이었으나, 12시간에서는 155.7 U/ml로 급격하게 증가되었고 18시간 이후에는 약 265 U/ml 수준의 최대 생산성을 보였으며 36시간까지 그 생산성이 유지되었다(Fig. 1). 한편 LB 배지에서 측정한 배양균액의 흡광도가 12시간 이후부터는 지속적으로 감소하는 것으로 보아 사멸기에 이른 것으로 판단되었는데, 곤약을 첨가한 배지에서는 배지의 점도가 너무 높아 배양초기에 균이 원활하게 성장하지 못하였을 것을 감안하면 사멸기에 이르는 시간이 LB 배지에서 보다 오래 걸릴 것으로 여겨졌다.
- KJ57222) 이를 미국 NCBI의 BLAST 검색방법으로 16S rDNA database와 비교하였다. 그 결과 B. amyloliquefaciens FZB42 (NR_075005)와 가장 유사도가 높았으며 비교된 1,493개 염기중 1개 염기가 달랐고 B. subtilis 168 (NR_102783)과는 4개 염기가 다른 것으로 확인되었다. 그러나 분리균과 생화학적 특성의 유사도가 가장 높았던 B.
- 5로 조절된 LB 액체 배지에서 16시간 동안 플라스크 배양을 하면서 배양액의 흡광도를 조사하였다. 그 결과 YB-1401은 pH 4.0 배지에서는 전혀 성장하지 못하였고 pH 4.5 배지에서는 배양초기에 균의 성장이 매우 느렸지만 배양 시간이 10시간 정도에 이르렀을 때부터 빠른 성장을 보였다. 한편 된장에서 B.
- 5% (w/v)가 되도록 각각 첨가된 LB 배지에서 배양온도를 37℃로 하여 24시간 동안 진탕 배양한 후 배양상등액에 존재하는 mannanase 활성을 조사하였다. 그 결과 곤약이 첨가된 배지에서 효소 생산성이 가장 높았으며, 이외에도 mannan 다당류를 함유한 LBG와 guar gum에 의해서도 그 생산성이 크게 증가하였다. 그러나 mannan 다당류를 함유한 농산부산물인 palm kernel meal에 의한 효소 생산량의 증가정도는 높지 않은 것으로 나타났다(Table 2).
- 그 결과 곤약이 첨가된 배지에서 효소 생산성이 가장 높았으며, 이외에도 mannan 다당류를 함유한 LBG와 guar gum에 의해서도 그 생산성이 크게 증가하였다. 그러나 mannan 다당류를 함유한 농산부산물인 palm kernel meal에 의한 효소 생산량의 증가정도는 높지 않은 것으로 나타났다(Table 2). 또한 곤약의 첨가량을 달리하였을 때 그 함량이 높을수록 효소 생산량이 크게 증가하여 4% 곤약을 첨가하였을 때 최대 생산성을 보였다.
- subtilis 168 (NR_102783)과는 4개 염기가 다른 것으로 확인되었다. 그러나 분리균과 생화학적 특성의 유사도가 가장 높았던 B. laterosporus의 16S rDNA 염기서열(AB112720)과는 89% 수준의 낮은 유사도를 보였다. 그러므로 현재의 결과로는 분리균이 Bacillus속의 어느 균종에 속한다고 판단할 수 없다고 하겠다.
- 그러나 mannan 다당류를 함유한 농산부산물인 palm kernel meal에 의한 효소 생산량의 증가정도는 높지 않은 것으로 나타났다(Table 2). 또한 곤약의 첨가량을 달리하였을 때 그 함량이 높을수록 효소 생산량이 크게 증가하여 4% 곤약을 첨가하였을 때 최대 생산성을 보였다. 이는 곤약을 첨가한 LB 배지에서 곤약의 함량이 0.
- 3). 또한 반응액의 pH를 5.5로 하고 반응 온도에 따른 효소의 활성을 조사한 결과 55℃에서 활성이 가장 높게 나타났다(Fig. 4). 따라서 YB-1401의 mannanase는 반응온도 50-70℃, 반응 pH 5.
- 배양 상등액을 ammonium sulfate로 처리하여 제조한 조 효소액을 사용하여 SDS-PAGE를 수행한 후 활성염색을 실시한 결과 Fig. 2에 보인 바와 같이 분자량이 약 38.0 kDa 정도로 추정되는 mannanase 활성 단백질이 관찰되었으며 이는 SDS-PAGE에서 38-40 kDa의 분자량을 보인 B. subtilis WY34 [6], B. subtilis BCC41051 [18]과 B. subtilis WL-3[15]의 mannanases와 유사하다고 하겠다.
- 배양시간에 따른 mannanase 생산성을 조사하기 위해 곤약 (4%)을 첨가하거나 첨가하지 않은 LB 배지에서 36시간 동안 배양하면서 mannanase 생산성과 성장도를 조사한 결과, 곤약을 첨가하지 않은 LB 배지에서 9시간 배양 후에 균의 성장이 최대에 이르렀으나 효소 생산성은 1 U/ml 미만으로 매우 낮았다. 곤약을 첨가한 배지에서는 배양시간이 9시간이 되었을 때 mannanase 생산성이 10.
- amyloliquefaciens와 유사도가 가장 높았다. 분리균 YB-1401의 mannanase 생산성은 mannans에 의해 급격하게 증가하였으며, 특히 곤약(4%)이 첨가된 배지에서 약 265 U/ml로 최대 생산성을 보였다. 분리균의 mannanase는 55℃와 pH 5.
- YB-1401를 분리 하였다. 분리균의 당이용능을 비롯한 생화학적 특성은 Brevibacillus laterosporus와 유사도(61.1%)가 가장 높은 반면에 16S rRNA 유전자의 염기서열은 B. amyloliquefaciens와 유사도가 가장 높았다. 분리균 YB-1401의 mannanase 생산성은 mannans에 의해 급격하게 증가하였으며, 특히 곤약(4%)이 첨가된 배지에서 약 265 U/ml로 최대 생산성을 보였다.
- Mannanase의 열안정성을 조사한 결과 45℃ 이하에서 1시간 동안 방치하였을 때 실활되지 않았으나, 50℃ 이상에서는 실활되기 시작하여 50℃에서는 52%, 55℃에서는 15% 정도의 잔존활성을 보였다. 이로 보아 YB-1401의 mannanase는 B. subtilis BCC41051 [18], B. subtilis G1 [20]과 B. subtilis WL-3[23]을 포함한 다수의 Bacillus속 균주 유래 mannanases에 비해서 열에 대한 안정성이 낮았으며, B. subtilis BS5 [5]나 Sphingomonas속 균주[27] 유래의 mannanases 보다는 열에 안정하였다.
- 3). 이로 보아 내산성 균주로 분리된 YB-1401가 생산하는 mannanase 는 최적 반응 pH는 Bacillus속 균주 유래 mannanases들과 유사하였지만, pH 4-9의 범위내에서 안정한 것으로 알려진 B. subtilis B23 [26]과 B. subtilis G1 [20]의 mannanases 보다 산성 뿐 아니라 알칼리성의 pH 범위에서도 그 안정성이 우수한 것으로 확인되었다. 그러나 YB-1401의 mannanase 는 pH 3.
- 그 결과 마지막 계대 배양액 중에서 오직 1점의 시료에서만 균의 성장을 나타냈다. 이를 LB 평판배지(pH 4.5) 에 도말하고 37℃에서 2일간 배양함으로써 2종류의 콜로니가 분리되었는데, 이로 보아 된장에 존재하는 내산성 세균의 종류가 적은 것으로 판단되었으며 이로 인하여 된장 시료 25점 중 오직 1점 시료의 접종액에서만 균의 성장을 보였던 것으로 추측된다. 한편 분리된 2개의 균주 중 YB-1401로 명명한 한 개의 균주가 LBG를 분해하는 균주로 판명되어 이를 mannanase 생산균으로 선발하였다.
- 조효소액을 사용하여 반응 pH와 온도가 효소활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 반응온도를 50℃로 고정하고 여러 pH에서 mannanase 활성을 측정한 결과 pH 5.5에서 최대 활성을 보였으며 pH 5.0-6.5 범위에서 최대활성의 70% 이상의 활성을 나타내었다(Fig. 3). 또한 반응액의 pH를 5.
- 1). 한편 LB 배지에서 측정한 배양균액의 흡광도가 12시간 이후부터는 지속적으로 감소하는 것으로 보아 사멸기에 이른 것으로 판단되었는데, 곤약을 첨가한 배지에서는 배지의 점도가 너무 높아 배양초기에 균이 원활하게 성장하지 못하였을 것을 감안하면 사멸기에 이르는 시간이 LB 배지에서 보다 오래 걸릴 것으로 여겨졌다.
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