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문제 정의
- 이 연구에서 조현병의 파과형군은 CNR1 유전자와 강한 연관관계를 보였는데, (AAT)n의 반복수가 9개인 allele은 파과형 조현병의 위험인자였으며, 17개인 allele은 강한 역위험인자로, 파과형 조현병의 감수성에 대해 방어적인 요소였다. 이 연구는 (AAT)n 미소부소체의 다형성이 조현병 전체와는 유의미한 연합이 나타나지 않았지만, 조현병의 파과형 아형에서 편집형 아형과 다르게 (AAT)n 삼핵산 반복 다형성과 유의한 연관성을 나타냈다는 결과를 처음 보고한 것이다. (AAT)n 미소부소체는 CNR1 암호 영역의 16 kb 가량의 아래 부위에 위치한다.
- 이러한 선행연구들에 따라 CNR1 유전자의 다형성과 조현병 감수성의 관련성을 검증할 필요성이 대두되고 있으나, 한국인을 대상으로 한 연구는 아직 없는 것으로 파악되었다. 이에 우리는 한국인 조현병 환자군과 대조군을 대상으로 하여 두 군 사이에서 CNR1 유전자 다형성 중 하나인 (AAT)n 미소부소체의 분포 차이가 나타나는지 조사해 보았다.
제안 방법
- Logistic regression analysis was performed to calculate the OR (95% CI) controlling for age (continous value) and gender (male = 0, female = 1). NOR : numbers of (AAT)n repeats, CI : confidence interval, OR : odds ratio
- Polymerase chain reaction 증폭을 위해 형광표지자인 2’-chloro-7’-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein으로 표지된 forward primer인 5’ GCTGCTTCTGTTAACCCTGC 3’와 revese primer 5’ TCCCACCTATGAGTGAGAACAT 3’를 사용하였다. PCR 증폭 반응은 ABI 9700 thermal cycler(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하였으며, touch down 조건하에서 증폭을 수행하였다. Touch down 증폭 조건은 다음과 같다.
- Polymerase chain reaction 증폭을 위해 형광표지자인 2’-chloro-7’-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein으로 표지된 forward primer인 5’ GCTGCTTCTGTTAACCCTGC 3’와 revese primer 5’ TCCCACCTATGAGTGAGAACAT 3’를 사용하였다.
- 조현병 환자군과 정상인 대조군에 대한 CNR1 유전자 (AAT)n의 삼핵산 반복 대립 유전자형(allele)의 빈도에 대한 판별력과 연관성을 확인하기 위하여 로지스틱 회귀분석(logistic regression analysis)을 실시하였다. 나이와 성별을 공변수로 하여 분석하였고, 이를 통해 교차비(odds ratio)와 95% 신뢰구간 및 상응하는 p-value를 측정하였다.
- 여기에 용해 완충액(10 mM Tris-HCl, 0.1M EDTA, 0.5% sodium dodecyl sulfate, pH 8.0)을 첨가한 후, 37℃로 1시간 동안 배양하고 proteinase K를 150 μg/mL의 농도로 첨가하여 50℃에서 4시간 동안 반응한 후 genomic DNA를 추출하였다.
- 정신지체, 기질적 뇌 질환, 약물 또는 알코올 의존, 신경과적 질환, 자가 면역 질환이 있는 환자는 제외하였다. 정상인 대조군은 한림대학교 한강성심병원과 서울대학교 건강증진센터에 근무하는 건강한 직원들이었고, 정상 대조군들 각각에 대해 현재 진행 중인 정신과적 질환이나 정신과적 질환의 과거력이 있는지 확인하기 위해 정신건강의학과 의사에 의하여 Structured Clinical Interview for the DSM-Non-Patient edition을 이용한 면담을 시행하였으며, 정신과적 질환이 발견된 경우 정상 대조군에서 제외하였다. 이들 대상군은 모두 연구에 동의하였고, 연구계획은 각각의 병원들과 순천향대학교병원 임상실험 윤리위원회의 심의를 통과하였다.
- 환자들과 대조군의 혈액을 뽑아 ethylenediaminetetraacetic acid(이하 EDTA)로 바로 처리하여 응고를 방치한 후, 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 buffy coat를 채취하였다. 여기에 용해 완충액(10 mM Tris-HCl, 0.
대상 데이터
- 연구 대상은 2005년 1월부터 2011년 12월까지 4개 병원(진주 정신병원, 순영병원, 하동 우리들병원, 계요병원)에 입원한 환자들 중 정신장애 진단 및 통계편람(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, fourth edition, 이하 DSM-IV)에 의하여 조현병으로 진단된 337명의 환자들(남자 171명, 여자 166명)과 정상인 대조군 394명(남자 223명, 여자 171명)을 연구 대상으로 하였다(Table 1). 정신지체, 기질적 뇌 질환, 약물 또는 알코올 의존, 신경과적 질환, 자가 면역 질환이 있는 환자는 제외하였다.
- 우리의 대상군에서 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15번의 삼핵산 반복(trinucleotide repetition)이 있는 8개의 대립유전자를 발견하였다. 가장 짧은 대립유전자로 AAT 반복이 7개 있는 것, 가장 긴 대립유전자로 AAT 반복이 15개 있는 것을 확인할 수 있었다.
데이터처리
- 05 이하로 하였다. 조현병 환자군과 정상인 대조군에 대한 CNR1 유전자 (AAT)n의 삼핵산 반복 대립 유전자형(allele)의 빈도에 대한 판별력과 연관성을 확인하기 위하여 로지스틱 회귀분석(logistic regression analysis)을 실시하였다. 나이와 성별을 공변수로 하여 분석하였고, 이를 통해 교차비(odds ratio)와 95% 신뢰구간 및 상응하는 p-value를 측정하였다.
- 5℃씩 낮추면서 55℃까지 총 21 cycle 증폭한 후, 94℃ 30초~55℃ 30초~72℃ 30초로 15 cycle 증폭한다. 증폭된 시료는 ABI Prism GeneScan 3.5.1(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 통해 forward primer에 표지된 표지자의 형광 정도를 측정하고, 측정된 data를 Genotyper 3.6 software(Appelied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 repeat의 위치 및 수를 분석하였다.
- 통계분석을 위해 Statistical Analysis System(이하 SAS) 프로그램(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하였으며, 유의수준은 p-value 0.05 이하로 하였다. 조현병 환자군과 정상인 대조군에 대한 CNR1 유전자 (AAT)n의 삼핵산 반복 대립 유전자형(allele)의 빈도에 대한 판별력과 연관성을 확인하기 위하여 로지스틱 회귀분석(logistic regression analysis)을 실시하였다.
성능/효과
- 2) CB1 수용체는 주로 전두엽, 해마, 기저핵, 전측 대상회(anterior cingulate), 소뇌 등에 분포하는데 이는 조현병의 추정 신경회로를 증폭하는 뇌 영역이며 Δ-9-THC는 CB1 수용체의 효능제로 작용한다.1) 472개의 아미노산과 7개의 소수성 막관통(transmembrane) 영역으로 구성된 CB1 단백질은 풍부한 Gi/Go-연관 수용체(Gi/Go-coupled receptor)로 해마, 선조체, 대뇌피질과 같은 뇌의 특정 영역에 존재한다. 이러한 영역은 조현병과 연관되어 있고, 물질사용장애와 관련된 보상과 기억 처리에도 중요하다.
- 2) CB1 수용체는 주로 전두엽, 해마, 기저핵, 전측 대상회(anterior cingulate), 소뇌 등에 분포하는데 이는 조현병의 추정 신경회로를 증폭하는 뇌 영역이며 Δ-9-THC는 CB1 수용체의 효능제로 작용한다.
- 2) CNR1 유전자좌에는 많은 단염기 다형성(single nucleotide polymorphysms)들과 3 prime-untranslated region(이하 3’-UTR)에 위치한 (AAT)n 삼핵산 반복(trinucleotide repeats, 이하 TNR), 미소부소체(microsatellite) 등 유전자적 변이가 존재한다.
- 우리의 대상군에서 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15번의 삼핵산 반복(trinucleotide repetition)이 있는 8개의 대립유전자를 발견하였다. 가장 짧은 대립유전자로 AAT 반복이 7개 있는 것, 가장 긴 대립유전자로 AAT 반복이 15개 있는 것을 확인할 수 있었다.
- 결론적으로 본 연구에서는 한국인에서 CNR1 유전자의 (AAT)n 삼핵산 반복수에 대한 대립인자 분포가 조현병 환자와 대조군 사이에 차이가 있는지를 조사하였으나 유의미한 차이를 나타내지는 않았다(Global p-value = 0.83). 이는 기존의 연구들4)22-24)과 일치되는 부분으로 (AAT)n 삼핵산 반복이 조현병의 발병에 영향을 주지는 않는다는 것을 의미하지만, 카나비노이드 가설 자체를 부인한다고 볼 수는 없을 것이다.
- 그러므로 대마초 사용의 효과가 Δ-9-THC와 상관이 있고 cannabidiol이 Δ-9-THC의 부작용을 상쇄시키는 역할을 한다면, Δ-9-THC와 cannabidiol이 포함된 양의 비율이 대마초 사용 효과에 중요한 영향을 줄 것으로 예측할 수 있으며, 이는 실험적으로 증명되었다.
- 의 연구에서는 DSM-IV의 진단기준으로 내려진 조현병 혹은 파과형 조현병과 CNR1의 (AAT)n 삼핵산 반복수 사이에 유의미한 통계적인 증거는 나타나지 않았다. 대신 환자의 생애 특성에 관한 프로파일들, 즉 양성 증상, Schneiderian 증상, 우울, 조증, 음성 증상, 와해된 증상 등 각각의 증상군의 차원을 후향적 평가에 근거하여 종합하는 수치에 의한 lifetime dimensions of psychosis(이하 LDPS) 점수상 LDPS-파과형 특성을 보인군은 CNR1 유전자의 (AAT)n 반복 다형성과 눈에 띄는 연관성이 있었다(multi-allelic p-value = 0.0282). 독립적으로 allele 8은 이 특정과 연관이 있는 양성 증거를 보여주었고(bi-allelic p-value = 0.
- Table 2에 환자군과 대조군의 대립유전자 빈도 분포를 기술하였다. 대조군에서 가장 빈도가 많은 반복수는 (AAT)13 31.6%이고, (AAT)14 24.5%, (AAT)12 17.2%, (AAT)7 11.6% 순이며, 조현병 환자군에서 가장 빈도가 많은 반복수는 (AAT)13 33.6%이고, (AAT)14 21.6%, (AAT)12 18.5%, (AAT)7 11.1% 순이다. 총 대립유전자는 8종류였고, (AAT)n 삼핵산 반복수는 7~8번, 10~15번 사이였으며, 가장 흔한 것은 조현병 환자군과 대조군 모두 (AAT)13이다(Table 3).
- 두 군 간에 나이에서 유의한 차이(p ＜ 0.0001)를 보였으나 본 연구에서 확인하고자 하는 대립 유전자의 빈도는 DNA에 존재하여 나이와의 연관성이 없으므로 연구 결과에 영향을 미치지 않는 것으로 보았다.
- 본 연구에서는 한국인에서 CNR1 유전자의 (AAT)n 삼핵산 반복수에 대한 대립인자 분포가 조현병 환자와 대조군 사이에 차이가 있는지를 조사하였으나 유의미한 차이를 나타내지는 않았다(Global p-value = 0.83). 이는 기존의 연구들4)22-24)과 일치되는 부분으로 위 삼핵산 반복이 조현병의 발병에 영향을 주지는 않는다는 것을 의미하지만, 카나비노이드 가설 자체를 부인한다고 볼 수는 없을 것이다.
- 본 연구에서는 한국인에서 CNR1 유전자의 (AAT)n 삼핵산 반복수에 대한 대립인자 분포가 조현병 환자와 정상인 대조군 사이에 차이가 있는지를 조사하였으나 유의미한 차이를 나타내지는 않았다(Global p-value = 0.83)(Table 3).
- 안정적인 용량의 항정신병 약물을 복용하여 임상적으로 안정된 상태의 환자에게 투여한 결과, Δ-9-THC는 일시적으로 양성 및 음성 증상, 감각 지각적 변화, 인지적 결핍, 약물 부작용을 악화시켰다.
- ‘인격의 황폐화’는 ICD-10 분류에서 특별히 설명되지는 않았지만 아마도 두드러진 음성 증상과 와해된 행동 및 의사소통기술을 가진 사람이라는 맥락으로 표현되어 이를 파과형 조현병이라는 것을 의미한다고 볼 수 있다. 이 연구에서 조현병의 파과형군은 CNR1 유전자와 강한 연관관계를 보였는데, (AAT)n의 반복수가 9개인 allele은 파과형 조현병의 위험인자였으며, 17개인 allele은 강한 역위험인자로, 파과형 조현병의 감수성에 대해 방어적인 요소였다. 이 연구는 (AAT)n 미소부소체의 다형성이 조현병 전체와는 유의미한 연합이 나타나지 않았지만, 조현병의 파과형 아형에서 편집형 아형과 다르게 (AAT)n 삼핵산 반복 다형성과 유의한 연관성을 나타냈다는 결과를 처음 보고한 것이다.
- 이러한 조현병의 양성 증상과 음성 증상 외에도, 건강한 실험 군에 Δ-9-THC를 투여한 후 단어 목록의 즉시 회상과 지연 회상(30분)을 실시한 결과 용량 의존적인 기능 저하가 나타났고 언어적 회상에서 오류의 수가 증가하는 인지적 결핍이 관찰되었다.
- 28세(나이 분포 범위 : 28~80세)였다. 조현병 환자군과 정상인 대조군의 비율은 46:54였고, 조현병 환자군(남자 57% vs. 여자 43%)과 정상인 대조군(남자 51% vs. 여자 49%)에서 모두 남성이 여성에 비해 많은 수가 모집되었다.
- 1% 순이다. 총 대립유전자는 8종류였고, (AAT)n 삼핵산 반복수는 7~8번, 10~15번 사이였으며, 가장 흔한 것은 조현병 환자군과 대조군 모두 (AAT)13이다(Table 3).
후속연구
- 본 연구의 제한점은 첫째로 비교적 크지 않은 환자와 대조군의 샘플 크기로 인해 통계학적인 제한점이 있을 수 있다는 점이다.
- 연구들 간의 유전적 다형성 비교에서 본 연구의 한국인은 아시아계(일본인22)과 중국인21))의 분포와는 차이를 보였고, 오히려 스페인4)의 분포와 유사하다는 특이점에 대해서는 더 연구해 보아야 할 부분으로 생각된다(Table 4).
- 그렇지 않다면, 이 연구 결과는 CNR1 유전자의 (AAT)n 미소부소체와 가까운 위치에 있는 다른 유전자와 조현병이 연관이 있음을 나타낸다. 조현병의 카나비노이드 가설에 대한 연구의 중요성을 확실히 하기 위하여 CNR1 유전자의 (AAT)n 삼핵산 반복수의 특정한 숫자를 포함한 대립 유전자와 CNR1 유전자의 전사율과의 관계가 향후 연구되어야 할 것이다.22)
- 이는 기존의 연구들4)22-24)과 일치되는 부분으로 (AAT)n 삼핵산 반복이 조현병의 발병에 영향을 주지는 않는다는 것을 의미하지만, 카나비노이드 가설 자체를 부인한다고 볼 수는 없을 것이다. 조현병의 카나비노이드 가설에 대한 연구의 중요성을 확실히 하기 위하여, CNR1 유전자의 (AAT)n 삼핵산 반복수의 특정한 숫자를 포함한 대립유전자와 CNR1 유전자의 전사율과의 관계가 향후 연구되어야 할 것이다.
- 하지만 최근 개정된 DSM-5에서 조현병의 아형 구분이 진단기준상 사라진 변화를 보면 파과형 아형이 생물학적인 근거가 타당하고 향후 중요한 아형군으로 분류될 수 없다는 의미로 파악된다. 최근 조현병이 분명 이형적(heterogenous) 증상군이라는 시각이 존재하는데, 향후 아형을 나눈다면 생물학적인 근거가 명확한 개념에 의해 분류될 가능성도 있을 것이다.
- 저자들의 연구는 국내에서는 처음으로 조현병 자체와 (AAT)n 삼핵산 반복 다형성에 대한 조사를 시행한 것으로, 조현병과 CNR1 다형성과의 연합을 발견하지는 못하였다. 파과형 등의 아형구분에 대한 조사를 실시하지 않았다는 제한점이 있으나 향후의 카나비노이드 가설의 검증과 (AAT)n 삼핵산 반복 다형성에 대한 연구에 유용한 자료가 될 것으로 기대한다.
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