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문제 정의
- 따라서 본 연구는 영지버섯으로 배양된 한국 토종 쌀의 생산을 위해서, 먼저 영지버섯균을 배양하여 토종쌀에 고체배양을 하기 위한 최적의 조건을 찾고, 배양된 토종 영지버섯 쌀을, streptozotocin(STZ)으로 당뇨병이 유발된 흰 쥐에 일정기간 동안 경구투여한 후 당뇨병 흰쥐의 혈당변화와 혈청지질 농도 등을 비교 검토하여 당뇨병의 개선효과를 조사하였다.
제안 방법
- 본 실험에 사용한 영지버섯(Ganoderma lucidum)은 충청북도 괴산군 불정면 앵천리 야산에서 채취하여 분리한 것을 계대배양하여 사용하였다. 영지버섯 균사체 액체배양을 위해 버섯 액체배양의 기본 배지인 MCM(mushroom complete medium; glucose 2%, MgSO4 ․ 7H2O 0.05%, KH2PO4 0.046%, K2HPO4 0.1%, yeast extract 0.2%, peptone 0.2%, pH 4.5)을 기본 배지로 하였고, pH 처리는 2.5에서 8.0까지 0.5 간격으로 배양하였고, 온도 처리는 25, 30, 35℃로 배양하였다.
- 유기인증을 받은 필지에서 농약과 화학비료를 사용하지 않고 생산한 유기 토종 쌀(조동지)을 하룻밤 동안 물에 침지한 후 물을 빼고 비닐봉지에 수침한 곡물을 담고 autoclave로 고압 살균 처리하였다. 고압 살균 처리된 토종 쌀에 액체배양한 버섯 균사체를 접종한 후 28℃로 고정된 배양기에서 7~10일간 배양하였다.
- 1M citrate에 용해시켜 근육 주사(50㎎/㎏ body weight)하며, 당뇨 유발 확인은 STZ을 주사한지 24시간 후에 꼬리 정맥에서 채혈한 혈액의 혈당량이 300㎎/㎗ 이상인 것을 당뇨쥐로 간주하여 본 실험에 사용하였다. 고혈당이 유발된 흰쥐를 각 군당 8마리로 하여 혈당값과 평균체중이 유사하도록 배치시키고, 실험기간 동안 물과 사료는 자유롭게 섭취케 하였다. 당뇨 유발 실험군들은 saline(대조군)과 시료를 2주 동안 매일 체중 ㎏당 100㎎을 경구투여 하였다(Table 1).
- 고혈당이 유발된 흰쥐를 각 군당 8마리로 하여 혈당값과 평균체중이 유사하도록 배치시키고, 실험기간 동안 물과 사료는 자유롭게 섭취케 하였다. 당뇨 유발 실험군들은 saline(대조군)과 시료를 2주 동안 매일 체중 ㎏당 100㎎을 경구투여 하였다(Table 1).
- 당뇨유발 후 2일에 한번씩 rats의 꼬리에서 채혈하여 혈당치를 측정하였다. 실험동물의 체중은 오전의 일정한 시간에 매일 측정하며, 사료 섭취량은 각 실험군별로 체중 측정 직전에 잔량을 수거하여 측정하였다.
- 당뇨유발 후 2일에 한번씩 rats의 꼬리에서 채혈하여 혈당치를 측정하였다. 실험동물의 체중은 오전의 일정한 시간에 매일 측정하며, 사료 섭취량은 각 실험군별로 체중 측정 직전에 잔량을 수거하여 측정하였다.
- 사육이 끝난 실험동물은 희생시키기 9시간 전부터 절식시키고 물만 공급하며, ether로 마취하여 복부대동맥으로부터 주사기로 채혈한 혈액은 4℃에서 원심분리(1,110×g/15분)하여 혈장으로 사용하였다. 간장, 신장, 췌장 및 비장의 무게는 복부 절단한 실험동물로부터 각 장기를 적출해서 지방 및 결합조직을 제거한 후 생리식염수(0.9% NaCl)로 세척하고 여지로 수분을 제거한 후 무게를 측정하였다.
- 영지버섯으로 배양된 유기 한국 토종 쌀이 항당뇨 효과에 미치는 영향을 알아보기 위하여 영지버섯의 액체배양과 유기 한국 토종 쌀에서의 영지버섯 배양 및 생산된 유기 한국 토종 영지버섯 쌀을 당뇨가 유발된 흰쥐에 경구투여한 후, 혈당, 혈청 지질 및 alanine ami- notransferase(ALT)와 aspartate aminotransferase(AST) 활성을 조사하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 영지버섯(Ganoderma lucidum)은 충청북도 괴산군 불정면 앵천리 야산에서 채취하여 분리한 것을 계대배양하여 사용하였다. 영지버섯 균사체 액체배양을 위해 버섯 액체배양의 기본 배지인 MCM(mushroom complete medium; glucose 2%, MgSO4 ․ 7H2O 0.
- 체중이 100~120g인 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 대한 실험동물 센터에서 구입하여 22±0.5℃, 습도 55±5%, 12시간의 명암 사이클을 유지하는 사육실에서 stainless steel cage에 1마리씩 분리하여 일주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 본 실험에 들어갔으며, 시험기간 동안 기본적인 사양관리는 실험동물 복지 및 관리 기준에 의거하여 실시하였다(National Institute of Anima Science, l Animal Care Committee of Korea).
- 당뇨 유발은 췌장의 β-cell에만 특이적으로 작용하여 다른 기관에는 영향을 주지 않으며, insulin의 결핍으로 고혈당을 유발시킨다고 알려져 있는(Lazarus and Shapiro, 1972) streptozotocin (STZ)을 0.1M citrate에 용해시켜 근육 주사(50㎎/㎏ body weight)하며, 당뇨 유발 확인은 STZ을 주사한지 24시간 후에 꼬리 정맥에서 채혈한 혈액의 혈당량이 300㎎/㎗ 이상인 것을 당뇨쥐로 간주하여 본 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 각 결과들은 ANOVA(analysis of variance)분석을 통해 실험군 별로 평균(mean)±표준오차(SE)로 나타내며, 각 실험군 간의 평균치의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test(Duncan, 1957)에 의해 검정하였다.
- 본 실험 결과들은 SPSS(statistical package of social science) program을 이용하여 분석, 비교하였다. 각 결과들은 ANOVA(analysis of variance)분석을 통해 실험군 별로 평균(mean)±표준오차(SE)로 나타내며, 각 실험군 간의 평균치의 통계적 유의성은 p<0.
이론/모형
- )를 사용하여 측정하였다. LDL-cholesterol 함량은 Fridewald 등이 제안한 공식 [Total cholesterol-(HDL-cholesterol+triglyceride/5)]을 이용하여 계산하였다.
- 혈장 포도당은 glucose oxidase법, total cholesterol은 효소법, triglyceride는 Bucolo법, pho- spholipid은 효소법, HDL-cholesterol은 phosphotungstic acid-Mg 침전법, alanine aminotransferase(ALT) 및 aspartate aminotransferase(AST) 활성도는 Reitman-Frankel법에 의한 kit(Sigma Co.)를 사용하여 측정하였다. LDL-cholesterol 함량은 Fridewald 등이 제안한 공식 [Total cholesterol-(HDL-cholesterol+triglyceride/5)]을 이용하여 계산하였다.
성능/효과
- 0에서, 온도는 30℃에서 가장 높은 균사체 생산을 나타내었다. 영지버섯의 액체배양 최적 조건은 pH 4.5와 5.0이고, 30℃가 최적의 배양 조건임을 알 수 있었다. 한편, 최적 pH와 온도를 찾기 위한 각각의 배양에 있어서, 배양 완료 후 pH는 3.
- 쌀의 멸균을 위해 멸균 가능한 봉투의 크기가 32*44.5cm인 곳에 쌀을 1~2.5kg까지 넣어 멸균 후 영지버섯을 배양했을 때, 1kg일 때가 물리적 형태나 배양기간이 최적으로 나타났다. 접종량은 균사체액체배양액 7.
- 5kg까지 넣어 멸균 후 영지버섯을 배양했을 때, 1kg일 때가 물리적 형태나 배양기간이 최적으로 나타났다. 접종량은 균사체액체배양액 7.5%을 접종했을 때, 배양온도는 28℃일 때 가장 적절한 물리적 형태를 나타내었고, 배양기간이 10일로 가장 짧았다. 버섯 쌀 배양 기간에 따른 색감, 버섯 향 및 물리적 형태를 관찰한 결과, 색감은 9일과 10일 배양에서 가장 좋았고, 버섯 향은 12일째에서 가장 진하게 나타났으며, 물리적 형태는 8일에서 13일 사이 모두 양호하였다.
- 5%을 접종했을 때, 배양온도는 28℃일 때 가장 적절한 물리적 형태를 나타내었고, 배양기간이 10일로 가장 짧았다. 버섯 쌀 배양 기간에 따른 색감, 버섯 향 및 물리적 형태를 관찰한 결과, 색감은 9일과 10일 배양에서 가장 좋았고, 버섯 향은 12일째에서 가장 진하게 나타났으며, 물리적 형태는 8일에서 13일 사이 모두 양호하였다. 따라서 9일 배양이 위의 여러 가지 측면에서 가장 효율적인 것으로 나타났다.
- 상기의 결과들로 보아 버섯 쌀의 배양을 위해서는 1kg의 쌀을 멸균한 후 식힌 다음 7.5%을 접종해서 28℃에서 9일간 배양하면 버섯 쌀이 최적의 물리적 형태, 색감, 버섯 향이 나타났고, 배양기간도 가장 짧은 것으로 나타났다. 영지버섯으로 배양된 한국 토종 백미와 영지버섯으로 배양된 한국 토종 현미의 실제 모습이 Fig.
- 5에 나타내었다. 체중에 있어서 대조군(Control)보다 당뇨 유발군들이 사육 시간이 지날수록 증가하는 것을 보였으나, 정상군(Normal)보다는 적은 체중이었다. 이는 Streptozotocin이 췌장의 β-cell을 선택적으로 파괴하여 insulin 생성의 이상을 초래하여 당대사의 불균형을 일으켜 체중이 쉽게 회복되지 않기 때문이다.
- 이는 Streptozotocin이 췌장의 β-cell을 선택적으로 파괴하여 insulin 생성의 이상을 초래하여 당대사의 불균형을 일으켜 체중이 쉽게 회복되지 않기 때문이다. 그러나 당뇨 유발 실험군 중에서, 영지버섯으로 배양된 한국 토종 백미와 영지버섯으로 배양된 한국 토종 현미 투여군들이 대조군보다 체중 증가가 많이 되는 것으로 보아, 이의 섭취에 의해 Streptozotocin으로 당뇨가 유발된 흰쥐에 있어서 insulin의 분비를 다소 증가시켜 주는 것으로 사료된다.
- 특히 영지버섯으로 배양된 한국 토종 백미와 영지버섯으로 배양된 한국 토종 현미의 투여군들은 대조군에 비해 혈당을 약 30% 감소시켜 insulin의 분비 증가와 췌장 β-cell의 손상을 완화시키는 효과가 있는 것으로 판단된다.
- 당뇨시에 간장내 지질 대사 이상을 초래하여 간장 손상을 일으켜 ALT와 AST가 증가하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서 당뇨 유발군들이 ALT와 AST 활성이 높게 나타난 것은 고혈당으로 인한 간장의 손상으로 추측되며, 토종 백미와 현미 및 영지버섯으로 배양된 한국 토종 백미와 영지버섯으로 배양된 한국 토종 현미의 섭취군이 대조군보다 ALT와 AST 활성이 낮게 나타난 것은 이들의 섭취가 고혈당으로 인한 간장 손상을 어느 정도 회복시켜 준 것으로 사료된다.
- 영지버섯 액체배양 조건은 pH가 4.5와 5.0이고, 온도는 30℃에서 최적인 것으로 나타났고, 유기 한국 토종 영지버섯 쌀 생산 조건으로는, 물리적 형태나 배양 조건 등을 고려했을 때, 1kg의 토종 쌀에 7.5%의 종균을 접종하여, 28℃에서 9일간 배양하는 것으로 나타났다. 혈당 강하 효과 시험에서 당뇨 유발군에서, 영지버섯으로 배양된 유기 한국 토종 쌀의 급여군에 있어서의 혈당의 감소정도가 대조군보다 유의하게 감소하였다.
- 5%의 종균을 접종하여, 28℃에서 9일간 배양하는 것으로 나타났다. 혈당 강하 효과 시험에서 당뇨 유발군에서, 영지버섯으로 배양된 유기 한국 토종 쌀의 급여군에 있어서의 혈당의 감소정도가 대조군보다 유의하게 감소하였다. 또한 영지버섯으로 배양된 유기 한국 토종 쌀의 급여군에 있어서의 혈장 total cholesterol과 triglyceride는 대조군에서 보다 낮은 수치를 나타내었고, ALT와 AST 활성은 대조군에서 보다 낮은 수치를 나타내었다.
- 혈당 강하 효과 시험에서 당뇨 유발군에서, 영지버섯으로 배양된 유기 한국 토종 쌀의 급여군에 있어서의 혈당의 감소정도가 대조군보다 유의하게 감소하였다. 또한 영지버섯으로 배양된 유기 한국 토종 쌀의 급여군에 있어서의 혈장 total cholesterol과 triglyceride는 대조군에서 보다 낮은 수치를 나타내었고, ALT와 AST 활성은 대조군에서 보다 낮은 수치를 나타내었다.
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