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가설 설정
- 1)Crustacea muscle was homogenized and heat-treated at 70oC for 10 min.
- 1)Foods spiked with shrimp (black tiger prawn) were homogenized, heated and diluted with PBST for the quantitation of shrimp by sELISA.
- 1)Shrimp (black tiger prawn) muscle was homogenized and heattreated at each temperature for 10 min.
제안 방법
- 매 면역 일주일 후, 토끼의 귀 정맥으로부터 채혈하여 4℃에서 하룻밤 방치한 후 원심분리(1,000×g, 20 min)하여 항혈청을 분리하였다. TGelTM Purification Kit (Pierce Co., Rockford, IL, USA)를 이용하여 제조사의 설명에 따라 항혈청으로부터 항체를 정제한 후, PBS에 투석하여 사용하였다.
- 가공식품 중 새우의 검출을 위한 샌드위치 ELISA(sELISA)의 조건을 확립하기 위해 홍다리 새우의 tropomyosin에 대한 특이항체를 이용하여 하였다. 이때, 새우의 검출범위는 1-100 ppm (μg/mL)이며, 검출한계는 0.
- Full 등(12)의 방법에 따라 홍다리 새우(black tiger prawn, Penaeus monodon)의 고염용액 용해성단백질인 tropomyosin을 정제하였다. 근육조직에 2배(v/w)의 저염완충용액(20 mM KCl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM DTT)을 첨가하여 균질화한 후 면포로 잔사를 회수하였다. 그 새우 조직에 2배(v/w)의 95% 에탄올을 혼합하여 10분간 실온에서 방치하고 면포로 잔사를 회수하는 과정을 2회 반복한 후, 다시 2배(v/w)의 diethyl ether을 혼합하여 면포로 잔사를 회수하는 과정을 2회 반복하였다.
- 1의 흰색 동그라미)을 회수하였다. 다시 이들 분획물을 모아서 tropomyosin에 해당하는 밴드를 잘라내고 정제하여 그 정제도를 SDS-PAGE로 확인하였다(Fig. 3).
- 따라서, ELISA 분석치에 희석계수(20×20=400)를 곱하여 시료 중의 농도를 구하였다.
- 본 연구에서는 열에 안정한 새우 tropomyosin을 실험동물에 면역하여 새우에 대해 매우 높은 특이성을 나타내는 항체를 생산하고, 이를 이용하여 샌드위치 ELISA 조건을 확립하였다. 또한 새우의 열처리에 따른 항체의 반응성 변화, 갑각류에 대한 항체의 교차반응, 새우 첨가량을 달리한 식품을 제조하여 새우 tropomyosin의 회수율을 확인하고, 시판 중인 가공식품 내의 새우를 검출하였다.
- 따라서, ELISA 분석치에 희석계수(20×20=400)를 곱하여 시료 중의 농도를 구하였다. 또한, 이수치와 새우 첨가량을 비교하여 분석 회수율을 구하였다.
- 본 연구에서는 열에 안정한 새우 tropomyosin을 실험동물에 면역하여 새우에 대해 매우 높은 특이성을 나타내는 항체를 생산하고, 이를 이용하여 샌드위치 ELISA 조건을 확립하였다. 또한 새우의 열처리에 따른 항체의 반응성 변화, 갑각류에 대한 항체의 교차반응, 새우 첨가량을 달리한 식품을 제조하여 새우 tropomyosin의 회수율을 확인하고, 시판 중인 가공식품 내의 새우를 검출하였다.
- 2). 새우 tropomyosin의 분자량은 36 kDa이며(5), 200 mM NaCl에서 용출되는 단백질(fraction 24-48, Fig. 1의 흰색 동그라미)을 회수하였다. 다시 이들 분획물을 모아서 tropomyosin에 해당하는 밴드를 잘라내고 정제하여 그 정제도를 SDS-PAGE로 확인하였다(Fig.
- 새우의 tropomyosin을 면역원으로 사용하고자 이온교환 크로마토그래피로 홍다리 새우 단백질을 분리, 정제하였다(Fig. 1). 이들 분획물의 단백질량은 SDS-PAGE로 확인하였다(Fig.
- 새우의 열처리 정도에 따른 특이항체의 반응성을 sELISA로 조사하였다(Table 2, Fig. 6). 그 결과 70-121oC까지 각각 10분간 열처리하였을 때 상온처리에 비하여 각 온도별 반응성이 221, 121, 128, 149, 7.
- 시중에 유통되는 소스류 3종, 복합조미료류 6종, 경단류 3종, 만두류 2종, 시료 14점의 새우 검출을 실시하였다. 시료의 희석 비율을 400배이며, 흡광도 기본값 0.
- 신뢰성 검증을 위하여 가공식품에 농도별로 첨가한 새우의 함량을 sELISA로 검출하고 그 분석수치의 회수율을 조사하였다. 대표적인 표준곡선을 Fig.
- 토끼의 등 피부에 마리 당 500 μg의 tropomyosin 용액과 Freund’s complete adjuvant를 1:1로 혼합한 유탁액 1 mL을 피하주사 하였다. 이어서 2주 간격으로 3차례 추가면역을 실시하였다. 다만, 이때에는 adjuvant로서 Freund’s incomplete adjuvant를 사용하였다.
- ELISA 검출법의 신뢰성을 검정하기 위하여 spike test를 실시하였다. 즉, 가공식품(크림수프, 이유식, 소시지, 어묵, 소스)에 새우를 첨가하고, 그 속에 함유된 새우의 함량을 sELISA로 분석하였다. 최종 30-1,000 ppm의 새우 첨가 시료에 추출완충액(5 g SDS, 20 mL 2-ME in 1 L PBS)을 20배 첨가하여 상온에서 16시간 교반한 다음, 10,000×g에서 20분간 원심분리한 추출액을 PBS로 20배 희석하여 sELISA를 실시하였다.
- 특이항체가 면역원(tropomyosin) 이외의 갑각류에 대해 반응하는 정도를 조사하였다. 즉, 홍다리 새우, 흰다리 새우, 칵테일 새우, 바다가재, 꽃게 등을 시료처리 방법에 따라 준비한 후, 각각 여러 농도의 시료용액에 대하여 sELISA를 실시하였다. 본 연구에서 특이항체의 교차반응율은 다음 식에 의하여 구하였다.
- 최종 30-1,000 ppm의 새우 첨가 시료에 추출완충액(5 g SDS, 20 mL 2-ME in 1 L PBS)을 20배 첨가하여 상온에서 16시간 교반한 다음, 10,000×g에서 20분간 원심분리한 추출액을 PBS로 20배 희석하여 sELISA를 실시하였다.
- 특이항체가 면역원(tropomyosin) 이외의 갑각류에 대해 반응하는 정도를 조사하였다. 즉, 홍다리 새우, 흰다리 새우, 칵테일 새우, 바다가재, 꽃게 등을 시료처리 방법에 따라 준비한 후, 각각 여러 농도의 시료용액에 대하여 sELISA를 실시하였다.
- 특이항체와 항체-HRP 복합물을 이용하여 새우를 분석하기 위한 sELISA의 조건을 확립하고 그 표준곡선을 작성하였다(Fig. 4). 이때, 새우의 검출범위는 1-100 ppm (μg/mL), 검출한계는 0.
- 한편, 교차반응을 알아보기 위하여 70℃에서 10분간 열처리한 갑각류에 대한 특이항체의 반응성을 sELISA로 조사하였다. 그 반응의 정도는 면역원으로 사용하였던 홍다리 새우에 대한 반응성을 100%로 하였을 때, 흰다리 새우 73%, 칵테일 새우 155%, 바다가재 18%, 꽃게 0%를 나타내었다(Table 1, Fig.
- 홍다리 새우(tropomyosin)를 25, 70, 80, 90, 100, 121℃에서 각각 10분간 열처리하고 10,000×g에서 20분간 원심분리한 후 상징액에 대하여 sELISA를 실시하였다.
대상 데이터
- ELISA를 의한 항 새우 tropomyosin 항체 및 특이항체-효소 결합물은 자체적으로 제작한 것을 사용하였다. New Zealand White 종 토끼는 한림실험동물(Pyeongtaek, Korea)로부터 구입하였으며, microplate는 Nunc사(Roskilde, Denmark)의 MaxisorpTM를, microplate reader는 Molecular Devices사(Sunnyvale, CA, USA)의 ThermoMaxTM를 사용하였다. 갑각류와 가공식품류 시료는 성남시 분당소재 할인매장에서 구입하였고, 특히 후자의 경우 국내 및 국외 제품 중 소스류 3종, 복합조미료류 6종, 경단류 3종, 만두류 2종, 총 14점을 무작위로 확보하였으며, 그 외에 크림수프, 이유식, 소시지, 어묵, 소스 등을 실험에 사용하였다.
- Phosphate buffered saline (PBS: 0.01 M phosphate buffer with 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7.4), PBS with Tween 20 (PBST), phosphate citrate buffer tablet, 3,3',5,5'-tetramethyl benzidine dihydrochloride (TMB), Freund’s adjuvant, carbornate-bicarbonate buffer, horseradish peroxidase (HRP) 등은 Sigma-Aldrich Korea (Yongin, Korea)로부터 구입하였다.
- New Zealand White 종 토끼는 한림실험동물(Pyeongtaek, Korea)로부터 구입하였으며, microplate는 Nunc사(Roskilde, Denmark)의 MaxisorpTM를, microplate reader는 Molecular Devices사(Sunnyvale, CA, USA)의 ThermoMaxTM를 사용하였다. 갑각류와 가공식품류 시료는 성남시 분당소재 할인매장에서 구입하였고, 특히 후자의 경우 국내 및 국외 제품 중 소스류 3종, 복합조미료류 6종, 경단류 3종, 만두류 2종, 총 14점을 무작위로 확보하였으며, 그 외에 크림수프, 이유식, 소시지, 어묵, 소스 등을 실험에 사용하였다.
- 4에, 분석의 회수율을 Table 3에 각각 나타내었다. 이때, 가공식품군은 크림스프, 이유식, 소시지, 어묵, 소스를 대상으로 하였다. 그 결과 분석상의 회수율은 비교적 안정한 수치를 보였으며 그 평균치는 각각 397, 639, 168, 234, 0%로 나타났다.
데이터처리
- ELISA 검출법의 신뢰성을 검정하기 위하여 spike test를 실시하였다. 즉, 가공식품(크림수프, 이유식, 소시지, 어묵, 소스)에 새우를 첨가하고, 그 속에 함유된 새우의 함량을 sELISA로 분석하였다.
- 이를 microplate reader로 흡광도(A450)를 측정하였다. 표준분석 시료는 black tiger prawn로 하였으며, 모든 시료는 3반복 처리하여 얻은 평균값을 사용하였다.
- 한편 본 연구에서 개발한 sELISA를 이용하여 위와 동일한 방법으로 시판 시료 14점의 새우 검출을 실시하였다.
이론/모형
- Full 등(12)의 방법에 따라 홍다리 새우(black tiger prawn, Penaeus monodon)의 고염용액 용해성단백질인 tropomyosin을 정제하였다. 근육조직에 2배(v/w)의 저염완충용액(20 mM KCl, 1 mM KHCO3, 0.
- Kim 등(14)의 방법에 따라 특이항체를 생산하였다. 토끼의 등 피부에 마리 당 500 μg의 tropomyosin 용액과 Freund’s complete adjuvant를 1:1로 혼합한 유탁액 1 mL을 피하주사 하였다.
- 1). 이들 분획물의 단백질량은 SDS-PAGE로 확인하였다(Fig. 2). 새우 tropomyosin의 분자량은 36 kDa이며(5), 200 mM NaCl에서 용출되는 단백질(fraction 24-48, Fig.
- 5)에 NaCl 농도를 150-350 mM이 되도록 처리하여 새우 단백질을 분리하였다. 이들 분획물의 분자량 및 순도 확인을 위하여 Laemmli 방법(13)에 따라 SDS-PAGE를 실시하였다.
성능/효과
- 크림스프, 이유식, 소시지, 어묵, 소스에 대한 spike test에서 새우의 분석회수율은 각각 397, 639, 168, 234, 0%로 소스를 제외하고 매우 높게 나타났다. sELISA에 의하여 14점의 시판시료 중 새우의 함유 유무를 조사한 결과, 정성적으로 원료의 표시사항과 일치하는 비율은 79%이었다.
- 6). 그 결과 70-121oC까지 각각 10분간 열처리하였을 때 상온처리에 비하여 각 온도별 반응성이 221, 121, 128, 149, 7.8%로 나타났으며 121oC 이상 열처리 시 그 반응성이 1/13로 급격히 감소하였다. 본 연구에서 개발한 sELISA분석법은 100oC 범위 내에서 새우의 열안정성이 양호하며 실제 열처리한 시료의 분석 시 효과적일 것으로 추측되었다.
- 이때, 가공식품군은 크림스프, 이유식, 소시지, 어묵, 소스를 대상으로 하였다. 그 결과 분석상의 회수율은 비교적 안정한 수치를 보였으며 그 평균치는 각각 397, 639, 168, 234, 0%로 나타났다. 소스를 제외한 모든 가공식품은 열처리한 제품임에도 매우 높은 반응을 나타내었다.
- 한편, 교차반응을 알아보기 위하여 70℃에서 10분간 열처리한 갑각류에 대한 특이항체의 반응성을 sELISA로 조사하였다. 그 반응의 정도는 면역원으로 사용하였던 홍다리 새우에 대한 반응성을 100%로 하였을 때, 흰다리 새우 73%, 칵테일 새우 155%, 바다가재 18%, 꽃게 0%를 나타내었다(Table 1, Fig. 5). Kamath 등(16)은 새우에서 추출한 tropomyosin에 대하여 단클론 항체를 생산하여 그 특이성을 조사하였을 때 모든 갑각류에서 교차 반응성이 나타날 뿐만 아니라 홍합, 가리비, 다슬기 등의 연체동물에서도 교차반응을 나타내었다고 하였다.
- 새우가 함유 된 것으로 표시된 9점 시료 중 정성적으로 검출된 것은 6점, 불검출된 것은 3점이었으며, 새우의 함유가 표시되지 않은 시료 5점은 모두 불검출 되었다(Table 4). 따라서 표시와 검출이 정성적으로 일치하는 시료는 총 14점 중 11점으로 정성적 검출율은 79%이었다. 일반적으로 가공식품 중에 새우가 함유된 제품이 많지 않고 그나마 소스나 복합조미료에 많이 편중되어 있는데, 특히 소스 중의 새우 검출이 안되는 것은 앞선 spike test에서 밝힌 바와 같이 높은 염농도와 낮은 pH 등에 의한 것으로 추측되었다.
- 8%로 나타났으며 121oC 이상 열처리 시 그 반응성이 1/13로 급격히 감소하였다. 본 연구에서 개발한 sELISA분석법은 100oC 범위 내에서 새우의 열안정성이 양호하며 실제 열처리한 시료의 분석 시 효과적일 것으로 추측되었다.
- 특히, 소스에 대한 sELISA 분석이 어려웠는데 이는 소스에 함유된 높은 염 농도나 낮은 pH 등이 항원항체 반응을 극심하게 방해하였기 때문으로 추측하였다. 본 연구의 결과 새우 함량에 대한 sELISA 분석 회수율이 매우 높게 나타나므로 정량적으로는 다소 차이가 있으나 정성적 분석에는 효과적일 것으로 판단되었다.
- 056의 두 배 이하는 검출되지 않은 것으로 판단하였다. 새우가 함유 된 것으로 표시된 9점 시료 중 정성적으로 검출된 것은 6점, 불검출된 것은 3점이었으며, 새우의 함유가 표시되지 않은 시료 5점은 모두 불검출 되었다(Table 4). 따라서 표시와 검출이 정성적으로 일치하는 시료는 총 14점 중 11점으로 정성적 검출율은 79%이었다.
- 시중에 유통되는 소스류 3종, 복합조미료류 6종, 경단류 3종, 만두류 2종, 시료 14점의 새우 검출을 실시하였다. 시료의 희석 비율을 400배이며, 흡광도 기본값 0.056의 두 배 이하는 검출되지 않은 것으로 판단하였다. 새우가 함유 된 것으로 표시된 9점 시료 중 정성적으로 검출된 것은 6점, 불검출된 것은 3점이었으며, 새우의 함유가 표시되지 않은 시료 5점은 모두 불검출 되었다(Table 4).
- 이때, 새우의 검출범위는 1-100 ppm (μg/mL), 검출한계는 0.3 ppm 으로써 민감한 검출이 가능함을 알 수 있었다.
- 이상의 결과를 종합하면, 본 연구에서 새우 tropomyosin에 대한 특이항체를 이용한 sELISA는 소스류와 같은 일부 식품에는 적용이 불가능한 문제가 있지만 일반적인 가공식품 중 새우의 함유유무를 정성적으로 분석하는데 효과적으로 활용 가능한 것으로 판단되었다.
- 8%). 크림스프, 이유식, 소시지, 어묵, 소스에 대한 spike test에서 새우의 분석회수율은 각각 397, 639, 168, 234, 0%로 소스를 제외하고 매우 높게 나타났다. sELISA에 의하여 14점의 시판시료 중 새우의 함유 유무를 조사한 결과, 정성적으로 원료의 표시사항과 일치하는 비율은 79%이었다.
- 3 ppm이었다. 특이항체의 교차반응 결과, 홍다리새우, 흰다리 새우, 칵테일 새우, 바다가재, 꽃게에 대한 반응성은 각각 100, 73, 155, 18, 0%를 나타내었으며 새우에 대한 특이성이 매우 높았다. 열처리한 시료와 항체간의 반응성은 100oC 까지는 121-221%로 안정하였으나 121oC에서는 반응성이 급격히 감소하였다(7.
- Kamath 등(16)은 새우에서 추출한 tropomyosin에 대하여 단클론 항체를 생산하여 그 특이성을 조사하였을 때 모든 갑각류에서 교차 반응성이 나타날 뿐만 아니라 홍합, 가리비, 다슬기 등의 연체동물에서도 교차반응을 나타내었다고 하였다. 하지만 본 연구에서 생산한 다클론 특이항체는 새우에 대하여 매우 특이적으로 반응했으며 다른 갑각류에 대한 반응은 낮거나 거의 없었다.
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