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문제 정의
- Jung 등(2013)이 꾸지뽕나무 열매에서 유리당과 불용성 및 수용성 다당류가 약 50∼66%를 차지하고 있다고 보고한 이후 당류에 대한 연구는 미진한 실정이다. 따라서 본 연구의 목적은 수용성 다당류를 분리하고 이 화합물의 화학구조를 다당류의 분석 기법 중 methylation 분석법을 중심으로 조사하여 그 기초자료를 얻는 것이다.
제안 방법
- F1을 permethylation, 산 가수분해, 환원, silylation 과정을 거쳐서 부분적으로 메틸화된 알디톨 실릴레이트(Partially methylated alditol silylates, PMAS)의 형태로 만든 다음 GC-MS 분석을 실시하였다.
- F1의 permethylation은 Ciucanu와 Kerek (1984)의 방법을 참고하여 일부 조건을 달리하여 실시하였다. F1 5 mg을 0.
- GC-MS 분석은 Agilent 5975C MSD와 FID를 병렬로 연결한 Agilent 7890A GC (USA)를 하였으며, 분석 컬럼은 DB-5ms (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm), carrier gas (Helium)의 유속은 0.3 mℓ/min, 온도 조건은 100℃에서 3분 유지 후 3℃/min의 승온속도로 220℃까지 승온한 후 10분 유지하고 15℃/min의 승온속도로 240℃까지 승온한 후 10분을 유지하였다.
- Injector는 270℃, auxiliary line과 FID는 250℃, 질량분석기는 EI 방식으로 source는 70eV, split ratio는 1 : 50으로 하였다. Reference 물질로 사용한 pullulan, 1,3-glucan, arabinogalactan, xylan은 위와 같은 방법으로 실험하였다.
- 가수분해물은 Waters Delta 600 HPLC system으로, 이동상으로는 암모니아 수를 사용하여 pH를 2.5로 맞춘 0.05 M H3PO4 용액을 1 mℓ/min의 유속으로 사용하였고, 컬럼은 Optimapak C18 (250 × 25 mm, RStech, Korea)을 25℃에서, 검출기는 Waters 2487 UV 검출기(Waters, USA)를 사용하여 230 nm에서 아세트산을 측정하였다.
- 꾸지뽕나무 미숙과에서 추출한 수용성 조추출물을 GPC를 실시하여 다당류를 분리하였다. 이 다당체는 glucose, galactose, arabinose, xylose 등 4가지로 구성되어 있으며 그 조성비는 6.
- 6% 포함되어 있다고 보고된 수치와 유사하였다. 또한 수용성 조추출물 10 g으로부터 분취용 GPC를 이용하여 3개(F1, F2, F3)로 분획하였다. F1은 186 mg을 얻었으나 F2와 F3는 미량 저울에 올려놓기도 전에 끈적끈적하게 변할 정도로 흡습성이 높아서 측정이 불가능하였다.
- 분획물 1(F1, test tube 19∼20, 186 mg), 분획물 2(F2, test tube 21∼22), 분획물 3(F3, test tube 23∼26)으로 분리하였다.
- 시료주입은 조추출물 10 g을 농도가 5%가 넘지 않도록 물에 녹이고 0.45 µm nylon syringe 필터로 거른 다음 1 mℓ를 주입하였으며, 다당류의 검출은 Molisch test를 사용하였다.
- 2 µm syringe filter로 제거하였다. 여과된 시료 용액은 동결건조하고 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(High Performance Anion Exchange Chromatography-Pulsed Amperometric Detection, HPAEC-PAD, Dionex, USA)를 사용하여 단당 성분 분석을 실시하였다. 내부 표준 물질은 2-Deoxy-D-galactose를 사용하였다.
- 5% acetic acid/MeOH 용액을 첨가하여 반응을 종료시킨 후에 3번 이상 반복해서 MeOH 1 mℓ를 넣고 N2 기류로 건조하였다. 이 시료(partially methylated alditol)에 anhydrous pyridine과 Bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide (BSTFA)를 각각 0.15 mℓ를 첨가한 다음 60℃에서 20분간 가열하고 GC-MS 분석하였다. GC-MS 분석은 Agilent 5975C MSD와 FID를 병렬로 연결한 Agilent 7890A GC (USA)를 하였으며, 분석 컬럼은 DB-5ms (30 m × 0.
- 분쇄한 꾸지뽕나무 미숙 열매 약 700 g을 50% 발효주정에 상온에서 7일간 침지하고 추출용액을 회수하는 것을 3회 반복하였다. 추출물은 감압농축기를 이용하여 에탄올을 제거함과 동시에 농축하고, 분액여두깔때기를 사용하여 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 순으로 분액하고 남은 수용액을 동결건조하여 수용성 조추출물을 얻었다. 조추출물은 물로 용해한 후 차가운 에탄올에 넣어 침전시키고 원심분리한 다음 에탄올을 제거하고 데시케이터에서 보관하였다.
대상 데이터
- 여과된 시료 용액은 동결건조하고 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(High Performance Anion Exchange Chromatography-Pulsed Amperometric Detection, HPAEC-PAD, Dionex, USA)를 사용하여 단당 성분 분석을 실시하였다. 내부 표준 물질은 2-Deoxy-D-galactose를 사용하였다.
- 수용성 다당류들은 분취용 GPC를 사용하여 단리 및 정제하였다. 분취용 GPC는 Waters delta 600 pump (Waters, USA)와 Waters fraction collector II (Waters, USA)를 사용하였다. 컬럼은 2개의 PLacuagelOH mixed-H (300 × 25 mm, Agilent, UK) 컬럼을 연결하였고, 이동상 용매는 water를 사용하여 7 mℓ/min의 유속, 1 min/tube로 수집하였다.
- 실험에 사용된 꾸지뽕나무 열매는 전남 함평에서 2013년 9월 초에 채취한 것을 사용하였다. 열매는 채집한 직후 물로 세척한 다음 동결 건조 후 분쇄기로 분쇄하였다.
이론/모형
- Acetyl기를 함유하고 있는 다당류를 염산으로 가수분해하면 아세트산이 생성되는 반응(Tomoda 등, 1985)을 이용하여 HPLC로 분석하였고 Fig. 3에 나타내었다. 아세트산의 피크는 5.
- F1의 uronic acid의 존재 유무 확인은 Nicolet iS10 FT-IR spectrometer (Thermo scientific, USA)를 사용하여 ATR 방식으로 측정하였다.
- MS data의 fragmentation ion의 분석은 Björndal 등(1970)과 Wong 등(1980)의 fragmentation pattern을 참고하였다.
- O-acetyl기 분석을 위한 가수분해 반응은 Tomoda 등(1985)의 방법을 사용하였고, HPLC 분석 조건은 Mcfeeters 등(1984)의 방법을 참고하였다. F1 3 mg을 vial에 넣고 0.
- 산 가수분해는 Seaman 등(1963)의 방법으로 수행하였다. F1 5 mg을 실온에서 12 M의 황산 50 µℓ를 넣어 저어준 뒤에 2 M로 희석한 다음 1 h 동안 100℃에서 reflux하여 반응시켰다.
성능/효과
- 또한 다당체에 acetyl기의 치환여부와 uronic acid의 존재 유무를 확인하기 위해 FT-IR 분석과 염산 가수분해물의 HPLC 분석을 실시한 결과 두 가지 모두 없는 것으로 분석되었다. 결합 위치 확인을 위해 permethylation, acid hydrolysis, reduction, silylation을 순차적으로 실시하여 얻어진 PMAS들에 대한 GC-MS 분석을 실시한 결과, F1은 1,5-di-O-trimethylsilyl-2,3,4-tri-O-methyl xylose, 1,5-di-O-trimethylsily-2,3,4-tri-O-methyl arabinose, 1,4,5-tri-O-trimethylsily-2,3-di-O-methy arabinose, 1,3,5-tri-O-trimethylsily-2,4,6-tri-O-methyl glucose, 1,4,5-tri-O-trimethylsily-2,3,6-tri-O-methyl galactose, 1,4,5-tri-Otrimethylsily-2,3,6-tri-O-methyl glucose, 1,3,5,6-tetra-O-trimethylsily-2,4-di-O-methyl galactose, 1,3,5,6-tetra-O-trimethylsily-2,4-di-O-methyl glucose로 구성되어 있었고 그 조성비는 1.1 : 1.0 : 4.9 : 7.5 : 3.0: 3.1 : 1.4 : 1.5였다.
- 0이었다. 또한 다당체에 acetyl기의 치환여부와 uronic acid의 존재 유무를 확인하기 위해 FT-IR 분석과 염산 가수분해물의 HPLC 분석을 실시한 결과 두 가지 모두 없는 것으로 분석되었다. 결합 위치 확인을 위해 permethylation, acid hydrolysis, reduction, silylation을 순차적으로 실시하여 얻어진 PMAS들에 대한 GC-MS 분석을 실시한 결과, F1은 1,5-di-O-trimethylsilyl-2,3,4-tri-O-methyl xylose, 1,5-di-O-trimethylsily-2,3,4-tri-O-methyl arabinose, 1,4,5-tri-O-trimethylsily-2,3-di-O-methy arabinose, 1,3,5-tri-O-trimethylsily-2,4,6-tri-O-methyl glucose, 1,4,5-tri-O-trimethylsily-2,3,6-tri-O-methyl galactose, 1,4,5-tri-Otrimethylsily-2,3,6-tri-O-methyl glucose, 1,3,5,6-tetra-O-trimethylsily-2,4-di-O-methyl galactose, 1,3,5,6-tetra-O-trimethylsily-2,4-di-O-methyl glucose로 구성되어 있었고 그 조성비는 1.
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2. 추출물의 분리
분쇄한 꾸지뽕나무 미숙 열매 약 700 g을 50% 발효주정에 상온에서 7일간 침지하고 추출용액을 회수하는 것을 3회 반복하였다
. 추출물은 감압농축기를 이용하여 에탄올을 제거함과 동시에 농축하고, 분액여두깔때기를 사용하여 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 순으로 분액하고 남은 수용액을 동결건조하여 수용성 조추출물을 얻었다.
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