선박평형수 처리 시스템 효율 검증을 위한 해양 플랑크톤 생사판별시 Neutral red 염색법 적용 가능성 연구 Application of Neutral Red Staining Method to Distinguishing Live and Dead Marine Plankton for the Investigation of Efficacy of Ship's Ballast Water Treatment System원문보기
선박평형수를 통한 외래종 확산을 방지하기 위해 국제해사기구(IMO)에서는 2004년 선박평형수관리협약을 채택하였다. 이 협약에 따르면 앞으로 대부분의 선박들은 선박평형수 처리시스템을 통해서 해양 생물을 사멸 또는 제거시킨 후 배출해야 하며, 이는 플랑크톤의 생사판별방법을 통하여 이루어진다. 본 연구에서는 국제적으로 선박평형수 처리후 생사판별법으로 널리 사용되고 있는 fluorescein diacetate assay (FDA) 염색방법의 제한성과 이의 대안으로 Neutral red (NR) 염색방법사용 가능성을 살펴보고자 하였다. FDA 염색법은 대부분의 플랑크톤 염색에 되어서 현재 가장 널리 사용되는 방법임에도 불구하고 본 연구에서는 Ditylum brightwellii 을 제외한 모든 식물플랑크톤 대해서 낮은 염색 효율(전체 평균 염색 효율 <50%)을 보였으며, 식물플랑크톤이 갖는 고유한 형광(적색)에 간섭을 많이 받는 것으로 나타났다. 또한 FDA는 형광파장에 노출된 후 빠르게 색이 바래지는 경향도 관찰되었다. 반면에 NR은 조사된 모든 동 식물플랑크톤 개체수에 대해서 90% 이상의 높은 염색 효율을 보였다. 두 염색법 모두 포르말린을 이용해서 사멸시킨 동 식물플랑크톤에 대해서는 염색이 되지 않았다. 본 연구결과를 통해서 NR 염색법을 이용한 동 식물플랑크톤 생사판별은 매우 효율적이라고 판단된다.
선박평형수를 통한 외래종 확산을 방지하기 위해 국제해사기구(IMO)에서는 2004년 선박평형수관리협약을 채택하였다. 이 협약에 따르면 앞으로 대부분의 선박들은 선박평형수 처리시스템을 통해서 해양 생물을 사멸 또는 제거시킨 후 배출해야 하며, 이는 플랑크톤의 생사판별방법을 통하여 이루어진다. 본 연구에서는 국제적으로 선박평형수 처리후 생사판별법으로 널리 사용되고 있는 fluorescein diacetate assay (FDA) 염색방법의 제한성과 이의 대안으로 Neutral red (NR) 염색방법사용 가능성을 살펴보고자 하였다. FDA 염색법은 대부분의 플랑크톤 염색에 되어서 현재 가장 널리 사용되는 방법임에도 불구하고 본 연구에서는 Ditylum brightwellii 을 제외한 모든 식물플랑크톤 대해서 낮은 염색 효율(전체 평균 염색 효율 <50%)을 보였으며, 식물플랑크톤이 갖는 고유한 형광(적색)에 간섭을 많이 받는 것으로 나타났다. 또한 FDA는 형광파장에 노출된 후 빠르게 색이 바래지는 경향도 관찰되었다. 반면에 NR은 조사된 모든 동 식물플랑크톤 개체수에 대해서 90% 이상의 높은 염색 효율을 보였다. 두 염색법 모두 포르말린을 이용해서 사멸시킨 동 식물플랑크톤에 대해서는 염색이 되지 않았다. 본 연구결과를 통해서 NR 염색법을 이용한 동 식물플랑크톤 생사판별은 매우 효율적이라고 판단된다.
In order to prevent the spread of non-indigenous aquatic species through the ballast water in commercial ships, International Maritime Organization (IMO) adopted in 2004 the International Convention for Control and Management of Ship's Ballast Water and Sediments. The Convention mandates treatment o...
In order to prevent the spread of non-indigenous aquatic species through the ballast water in commercial ships, International Maritime Organization (IMO) adopted in 2004 the International Convention for Control and Management of Ship's Ballast Water and Sediments. The Convention mandates treatment of ballast water for most transoceanic voyages and its confirmation of treatment is made with plankton live/dead assay. Fluorescein diacetate assay (FDA), which produces bright green light for live phytoplankton, has been a de facto standard method to determine the survival of marine plankton, but its staining efficacy has been in dispute. In the present study, we examined the limitation of FDA, and compared its efficacy with Neutral red (NR) staining, another promising assay and widely used especially for zooplankton mortality. For all phytoplankton species studied in the present study, except Ditylum brightwellii, the staining efficiency was <50% with FDA. The green FDA fluorescence interfered with phytoplankton autofluorescence in most samples. In contrast, NR assay stained over 90% of both phytoplankton and zooplankton species tested in this study. FDA assay also showed that green FDA fluorescence rapidly faded when phytoplankton cells were exposed to microscope light. Both FDA and NR assay were negative on formalin-killed individuals of both phytoplankton and zooplankton species. Our results suggest that NR assay is more effective for determining the survival of marine plankton and can be applied to test the efficacy of ballast water treatment.
In order to prevent the spread of non-indigenous aquatic species through the ballast water in commercial ships, International Maritime Organization (IMO) adopted in 2004 the International Convention for Control and Management of Ship's Ballast Water and Sediments. The Convention mandates treatment of ballast water for most transoceanic voyages and its confirmation of treatment is made with plankton live/dead assay. Fluorescein diacetate assay (FDA), which produces bright green light for live phytoplankton, has been a de facto standard method to determine the survival of marine plankton, but its staining efficacy has been in dispute. In the present study, we examined the limitation of FDA, and compared its efficacy with Neutral red (NR) staining, another promising assay and widely used especially for zooplankton mortality. For all phytoplankton species studied in the present study, except Ditylum brightwellii, the staining efficiency was <50% with FDA. The green FDA fluorescence interfered with phytoplankton autofluorescence in most samples. In contrast, NR assay stained over 90% of both phytoplankton and zooplankton species tested in this study. FDA assay also showed that green FDA fluorescence rapidly faded when phytoplankton cells were exposed to microscope light. Both FDA and NR assay were negative on formalin-killed individuals of both phytoplankton and zooplankton species. Our results suggest that NR assay is more effective for determining the survival of marine plankton and can be applied to test the efficacy of ballast water treatment.
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문제 정의
이러한 문제를 해결하기 위해서 현재 가장 널리 사용되고 있는 생사판별기법은 염색법이다. 따라서 본 연구에서는 선박평형수 처리시스템 형식 승인 및 설치된 장비의 효율을 조사하는데 있어 FDA와 NR염색법의 적용 가능성을 알아 보았다. 일반적으로 염색법은 다음과 같은 사항을 충족해만 선박평형수 처리장치를 통과한 생물의 생사판별에 적용될 수 있다; 1) 염색 방법이 간단·명료 해야 한다.
따라서 본 연구에서는 자연상태의 동·식물플랑크톤 군집을 대상으로 NR 염색효능을 파악해 보고자 하였다.
따라서 선박평형수 처리 시스템의 운영 효율을 검증하기 위한 동·식물플랑크톤 생사판별에 복합적으로 적용할 수 있는 효과적이면서 간단한 생사 판별 기술이 필요한 실정이며, 이러한 요구에 대한 대안으로 본 연구에서는 NR 염색법의 적용 가능성 여부를 확인해 보았다.
또한 식물플랑크톤 군집을 대상으로 생사판별 시 보편적으로 사용되고 있는 FDA 결과를 NR 염색 결과와 비교해서 NR이 선박평형수 처리 시스템 생사판별을 하는데 있어서 동·식물플랑크톤 생사판별기법으로 이용될 수 있는지를 알아보았다.
또한 사멸한 플랑크톤들이 염색 유무를 판별하기 위해 4% 중성포르말린 용액을 이용하여 동·식물플랑크톤을 고정한 후 바로(0h) 그리고 24시간 뒤에 염색 유무를 확인하였다. 모든 분석은 하나의 종에 대해서 100개체 이상 염색 유무를 확인하였으며, 샘플링 당시 개체수가 많지 않았던 Cylindrotheca closterium(규조류) 및 와편모조류는 50개체 이상을 계수해서 결과값의 통계적 유의성을 확보하고자 하였다.
가설 설정
FDA 와 NR 모두 방법이 간단하고 염색에 소요되는 시간도 약 15분 정도로 적게 소요되기 때문에 이 부분에 대해서는 둘 다 충족을 한다고 판단된다. 2) 일정 시간 이상 염색이 지속 되어야 한다. 현미경을 통한 생사판별시 염색 지속 시간이 짧아서 염색된 색상이 바래지면 결과값에 오차가 발생할 수 있다.
본 연구에서도 광의 세기를 측정하지는 못했지만 일정시간 450-490 nm 파란색 파장에 노출된 FDA로 염색된 샘플의 형광의 강도가 약해지는 경향을 보였다. 3) 대상 생물에 대한 염색 효율이 좋아야 한다. 가장 중요한 항목으로 약하게 염색이 되거나 같은 종임에도 불구하고 염색 유무가 불확실하다면 생사판별시 매우 큰 어려움이 따른다.
제안 방법
NR 염색 방법을 이용해서 현장에서 채집한 동·식물플랑크톤을 염색하였으며, 살아있는 개체는 적색을 띄게 된다.
동·식물플랑크톤은 mesh size가 20 μm(식물플랑크톤 채집용)와 200 μm(동물플랑크톤 채집용) 네트를 이용해서 저층에서 표층까지 수직인양하여 채집하였으며, 채집 후 500mL 채수병(PC bottle)에 살아 있는 생물을 고농도로 농축을 한 후 인접한 실험실로 옮겼다.
동물플랑크톤은 시료 10 mL에서 15μL NR 표준용액을 넣은 후 약 15분간 암상태에서 시료와 염색약을 반응시킨 후 실체현미경을 이용해서 dark field 조건에서 계수하였다.
따라서 본 연구에서는 FDA염색방법을 이용한 식물플랑크톤 생사판 별시 살아있는 세포에 대해서 강한 녹색 형광을 띄는 개체를 ‘(+)’ 로 판별하고, 녹색형광과 다른 색상 특히 빨간색 형광이 부분적으로 발하는 개체를 ‘(+, -)’, 녹색형광이 아닌 다른 색상을 띄거나 형광을 발하지 않는 개체를 ‘(-)’로 분류해서 계수하였다.
또한 사멸한 플랑크톤들이 염색 유무를 판별하기 위해 4% 중성포르말린 용액을 이용하여 동·식물플랑크톤을 고정한 후 바로(0h) 그리고 24시간 뒤에 염색 유무를 확인하였다.
FDA 염색은 백과 신(2009)의 보고한 내용을 근거로 수행하였다. 먼저 염색 시약인 FDA (10209CE, Sigma-Aldrich) 시약 100 mg을 25 mL 갈색 암병에 20mL 의 dimethysulfoxide (DMSO) 와 혼합해서 working solution 을 조제하였다. 조제된 working solution 원액은 여과해수를 이용하여 400배 희석 한 다음 1.
본 연구에서 적색을 띈 개체를 ‘(+)’로 판별하였고, 염색이 되지 않은 개체를 ‘(-)’로 분류해서 계수하였다.
사멸된 동·식물플랑크톤을 대상으로 살아 있는 세포 염색방법을 이용한 염색 여부 확인은 현미경을 이용한 생사판별시 매우 중요하기 때문에 본 연구에서도 포르말린을 넣어서 사멸시킨 동·식물플랑크톤을 대상으로 FDA와 NR 염색 여부를 확인하였다(Table 1, 2; Fig. 5A, B).
식물플랑크톤 염색 유무를 관찰하기 위해 시료 50 mL에 75 μL NR 표준용액을 넣은 후 약 5분간 암상태에서 시료와 염색약을 반응시킨 후 형광현미경을 이용해서 light field 조건에서 계수하였다.
약 15분간 암상태에서 시료와 염색약을 반응을 시킨 후 형광현미경 blue excitation filter (excitation: 450-490nm, emission: ≥520 nm)하에서 염색 유무를 관찰하였다.
현장에서 채집된 동·식물플랑크톤은 형광(Axioplan2; Carl Zeiss, Germany) 및 실체현미경(Stemisv II; Carl Zeiss, Germany) 하에서 동·식물플랑크톤 도감(Cupp, 1943; Chihara and Murano, 1997; Tomas, 1997)을 참고해서 분류하였다(Table 1, 2).
현장에서 채집한 총 17종(규조류 15종, 와편모조류 2종)이 식물플랑크톤을 대상으로 FDA와 NR 염색 방법의 염색 효율을 알아보았다(Table 1, 2). FDA 염색법으로 염색을 한 식물플랑크톤 중 Ditylum brightwellii, Thalassionema frauendfeldii 종을 제외한 나머지 규조류는 FDA 염색 시약에 대해서 염색 효율이 90% 미만이며, 특히 Chaetoceros affinis를 제외한 Chaetoceros spp.
환경 변화에 따른 동·식물플랑크톤이 스트레스를 줄이기 위해 실험실 온도를 해수 온도 (표층 수온: 7.76ºC)와 유사한 상태로 조정한 후 빠른 시간 내에 염색하여 분석하였다.
대상 데이터
NR 염색법이 동물플랑크톤 대한 염색 효율을 알아 보기 위해 현장에 채집한 동물플랑크톤을 대상으로 실험을 실시 하였다. 현장에서 채집된 동물플랑크톤은 요각류가 11종으로 가장 많은 수를 차지하였고, 지각류 1종(Podon leuckarti), 패충류 1종(unidentified ostracods), 유생류 2종[따개비 유생(cirriped larvae), 다모류 유생(polychaeta larvae)] 등 총 15개의 분류군으로 동정되었다(Table 2).
동·식물플랑크톤 생사판별을 위한 자연시료는 거제시 장목면에 위치한 한국해양과학기술원 남해연구소 부두에서 2014년 2월에 채집하였다.
이론/모형
NR 염색은 Elliott and Tang (2009) 의 방법을 따랐다. NR 표준용액은 100 mL 순수(deionized water)에 NR (BCBG8681, SigmaAldrich) 분말 1g을 넣은 후 교반기를 이용해 12시간 이상 mixing 을 해서 조제하였다.
성능/효과
또한 강한 적색 형광으로 인해 FDA 녹색 형광이 간섭되는 현상이 와편모조류를 제외한 모든 규조류에서 관찰되었으며, 특히 세포 하나의 크기가 작고 체인을 형성하는 Chaetoceros spp., Leptocylindrus danicus, Skeletonema costatum 에서 뚜렷하게 나타났다(Fig. 1E, G). 백과 신(2009)의 연구 결과에 따르면 Leptocylindrus danicus, Skeletonema costatum과 같은 규조류는 염색이 잘 되지 않으며, 또한 Pleurosigma normanii 에서 녹색 형광이 무시될 정도의 강한 적색 형광이 관찰됐다고 보고하였다.
1) 염색 방법이 간단·명료 해야 한다.
NR 염색법으로 염색을 한 식물플랑크톤 염색 효율 결과를 보면, 조사된 모든 식물플랑크톤을 대상으로 90% 이상의 매우 좋은 염색 효율을 보였고, 17 종 중 11종은 100% 염색이 되는 것으로 나타났다(Table 2; Fig. 2). 또한 NR은 크기가 작은 Chaetoceros spp.
저서성 요각류인 harpacticoids 중 2개체가 살아있음에도 불구하고 염색이 되지 않았는데 본 연구에서는 명확한 이유를 찾을 수가 없었다. 따개비 유생과 지각류, 그리고 패충류도 요각류와 마찬가지로 NR 염색시약에 대해서 100% 염색이 되는 것으로 나타났다(Table 2). 하지만 따개비 유생과 패충류는 부속지 기관의 가장 자리에만 빨간색으로 염색이 되어서 염색 유무를 결정하는데 어려움이 있었으나, Elliott and Tang (2009)의 선행 연구에서 NR 염색시 살아 있는 따개비 유생은 부속지 기관 가장자리에만 옅은 핑크색을 띈다는 결과를 고려해서 본 연구에서는 모두 염색이 된 것으로 판단하였다.
따라서 NR 염색법을 이용한 비교 분석 및 실험에 적용한 결과마다 장·단점이 있지만, 본 연구 결과에서는 NR 염색법을 이용한 동·식물플랑크톤 생사판별이 매우 효율적이라고 판단된다.
5A, B). 먼저 포르말린을 넣어서 사멸시킨 식물플랑크톤을 대상으로 FDA 염색 유무를 확인한 결과, 조사되어진 모든 식물플랑크톤을 대상으로 경과 시간에 관계없이 염색이 되지 않아서 사멸된 세포의 상각(epivalve), 하각(hypovalve) 혹은 환각면(girdle)에 염색약이 침착되지 않는 것을 확인할 수 있었다(Table 1; Fig. 5A). 포르말린을 넣어서 사멸시킨 동·식물플랑크톤을 NR 로 염색한 결과에서도 모두 경과 시간에 관계없이 염색이 되지 않았다(Table 2; Fig.
, 2007), NR 은 광학 현미경 하에서 관찰을 수행하기 때문에 광원에 노출에 따른 색 바램이 FDA 염색법 보다 적다고 판단된다. 본 연구에서도 광의 세기를 측정하지는 못했지만 일정시간 450-490 nm 파란색 파장에 노출된 FDA로 염색된 샘플의 형광의 강도가 약해지는 경향을 보였다. 3) 대상 생물에 대한 염색 효율이 좋아야 한다.
위의 결과를 요약 정리하면, NR 염색법은 현재 널리 사용되고 있는 FDA 염색법 보다 식물플랑크톤 염색에 있어서 보다 높은 효율을 보였으며, 동물플랑크톤도 종에 따라서 다소 차이는 있으나 조사된 거의 모든 종이 다 염색 되는 것으로 나타났다. 따라서 NR 염색법을 이용한 비교 분석 및 실험에 적용한 결과마다 장·단점이 있지만, 본 연구 결과에서는 NR 염색법을 이용한 동·식물플랑크톤 생사판별이 매우 효율적이라고 판단된다.
하지만 따개비 유생과 패충류는 부속지 기관의 가장 자리에만 빨간색으로 염색이 되어서 염색 유무를 결정하는데 어려움이 있었으나, Elliott and Tang (2009)의 선행 연구에서 NR 염색시 살아 있는 따개비 유생은 부속지 기관 가장자리에만 옅은 핑크색을 띈다는 결과를 고려해서 본 연구에서는 모두 염색이 된 것으로 판단하였다. 전반적으로 염색은 요각류 성체 및 후기 유생(copepodites)과 다모류 유생(polychaeta larvae)이 빠르게 염색이 잘되었고, 지각류인 Podon leuckarti, 패충류, 따개비 유생은 요각류나 다모류 유생보다는 다소 느리게 염색이 되는 것으로 나타났다. Elliott and Tang (2009)은 또한 크기가 작은 동물플랑크톤 후기 유생 및 따개비 유생에서 일정 시간(0.
현장에서 채집된 동물플랑크톤은 요각류가 11종으로 가장 많은 수를 차지하였고, 지각류 1종(Podon leuckarti), 패충류 1종(unidentified ostracods), 유생류 2종[따개비 유생(cirriped larvae), 다모류 유생(polychaeta larvae)] 등 총 15개의 분류군으로 동정되었다(Table 2). 채집된 모든 동물플랑크톤을 각각 100개체를 관찰한 결과 저서성 요각류인 harpacticoids 에서 2개체가 염색이 되지 않은 것을 제외하면 관찰된 모든 개체에서 100% 염색이 되는 것으로 나타났다(Table 2; Fig. 4). Crippen and Perrier (1974)도 NR 염색법을 이용해서 현장에 채집한 살아 있는 동물플랑크톤의 주요 분류군인 요각류(calanoid copepods), 다모류의 알과 유생(polychaete eggs and larvae), 복족류 알(gastropod eggs), 히드로충 유생(hydrozoans larvae), 윤충류(rotifers)와 모악류(chaetognaths)의 생사 판별에 적용해서 성공하였다고 보고하였다.
NR 염색법이 동물플랑크톤 대한 염색 효율을 알아 보기 위해 현장에 채집한 동물플랑크톤을 대상으로 실험을 실시 하였다. 현장에서 채집된 동물플랑크톤은 요각류가 11종으로 가장 많은 수를 차지하였고, 지각류 1종(Podon leuckarti), 패충류 1종(unidentified ostracods), 유생류 2종[따개비 유생(cirriped larvae), 다모류 유생(polychaeta larvae)] 등 총 15개의 분류군으로 동정되었다(Table 2). 채집된 모든 동물플랑크톤을 각각 100개체를 관찰한 결과 저서성 요각류인 harpacticoids 에서 2개체가 염색이 되지 않은 것을 제외하면 관찰된 모든 개체에서 100% 염색이 되는 것으로 나타났다(Table 2; Fig.
후속연구
따라서 NR 염색법을 이용한 비교 분석 및 실험에 적용한 결과마다 장·단점이 있지만, 본 연구 결과에서는 NR 염색법을 이용한 동·식물플랑크톤 생사판별이 매우 효율적이라고 판단된다. 또한, 상대적으로 염색 강도가 약해서 생사판별 결정에 어려움이 따르는 동물플랑크톤 종에 대해서는 침을 이용한 자극법과 같이 사용한다면 매우 유용할 것으로 판단된다.
5). 하지만 본 연구에서는 포르말린을 이용해서 플랑크톤을 사멸시켰지만, 추가적인 플랑크톤 생사판별을 위한 염색방법 연구는 실제로 선박평형수 설비에 적용되는 방법을 이용해서 플랑크톤을 사멸시킨 후 반응을 지켜봐야 할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
선박평형수은 무엇인가?
선박평형수는 해양 생물을 다른 지역으로 장거리 이동시키는 여러 가지 인자 중 가장 중요한 운송 수단으로, 전세계적으로 연간 약~50-100억 톤이 선박평형수가 이동되고 있다(Endresen et al., 2004).
NR 염색법의 최근 연구에서는 어떤 결과가 보고 되었나?
, 1978). 하지만 최근 Zetsche and Meysman (2012)의 연구에서는 동·식물플랑크톤의 크기에 관계없이 시험에 사용된 모든 종(배양종+자연종)들이 염색이 되었으며, 특히 크기가 큰 규조류인 경우 매우 염색이 잘되는 것으로 보고 되었다. 현재까지 배양종이 아닌 자연 상태의 군집을 이용한 식물플랑크톤 NR 염색법에 관한 연구가 많이 진행 되지 않았으며, 동물플랑크톤을 대상으로도 특정 분류군의 염색 유무에 서로 다른 의견을 보이고 있다(Elliott and Tang, 2009).
선박평형수 운송 과정에서 살아 남은 몇몇 생물들이 어떤 문제를 일으키고 있나?
선박평형수 안에는 동·식물플랑크톤뿐만 아니라 이들의 발아 전 단계인 동물플랑크톤의 알(eggs)과 식물플랑크톤 휴면포자도 포함 되어 있으며, 이들 중 대부분은 운송 과정(ballasting and de-ballasting operation and long voyage time) 및 배출된 후 새로운 환경에 잘 적응하지 못하고 사멸하게 된다(백과 신, 2009). 그러나 현재까지의 많은 연구 결과들은 선박평형수 운송 과정에서 살아 남은 몇몇 생물들이 해당지역의 수서 생태계를 교란시켜 심각한 환경적 및 경제적 문제를 일으키고 있다고 보고 하고 있다(Bax et al., 2003; Pimentel et al.
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