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문제 정의
- FDA와 CMFDA의 생사판별방법이 유사하여 농도별로 교차 주입(중복염색:double staining)하여 최적의 염색효율을 알아보고자 하였다. FC(FDA농도고정, CMFDA의 농도변화)실험구는 1.
- 본 연구는 해양에서 자연 상태의 동·식물플랑크톤의 군집을 대상으로 Evan blue, Aniline blue 그리고 CMFDA의 염색방법을 적용하여 생물생사판별이 가능한지 여부를 평가함과 아울러, 가장 적절한 염색농도범위를 파악하기 위해서 농도구배 및 교차 염색법(FDA+CMFDA)으로 가장 효율적인 평가방법을 모색하고자 노력하였다.
가설 설정
- 선박평형수 처리장치를 통과한 처리수의 해양생물에 대한 생사판별은 다음과 같은 사항을 충족하는 것이 중요하다. 첫째, 염색 방법이 간단명료해야 한다. IMO-D2에 의하면, 선박평형수 처리장치를 통과한 생물의 생사판별은 6시간 이내로 간단하면서 신속 정확하게 수행되어야 한다.
제안 방법
- 특히 대부분의 규조류는 80%를 넘는 염색효율이 관찰되었고, 그 중 Chaetoceros 속의 80-90%의 염색효율을 나타냈으며, Leptocylindrus danicus, Pseudo-nitzschia sp., Skeletonema costatum, Thalassionema frauenfeldii, Thalassionema nitzschioides 는 100%에 준하는 염색효과를 관찰하였다. 반면, 와편모조류 Ceratium 속은 부분적으로 염색이 되거나 염색이 되지 않는 세포들이 다수확인되어 전체 50% 미만의 염색효율을 보였다.
- FC(FDA농도고정, CMFDA의 농도변화)실험구는 1.7 mL의 micro-tube에 대상생물이 들어 있는 해수 1 mL 을 넣고 여과해수에 400로 희석한 용액을 1:40으로 반응시킨 FDA를 25 µL씩 동일하게 주입하고 CMFDA working solution 용액을 5, 10, 20, 40, 100 µL 로 농도구배로 두어 염색정도를 평가하였다[4].
- 네트로 채집한 시료 1 mL 에 Aniline blue의 working solution을 농도구배를 1, 10, 20, 50, 100 µL로 넣고 15분간 암실에서 반응시킨 뒤 광학 현미경에서 관찰 및 사진을 촬영하였다.
- 네트로 채집한 시료 1 mL 에 Evans blue의 working solution을 1, 10, 20, 50, 100, 200 µL의 농도구배로 각각 넣고, 15분간 실온 암실에서 반응시킨 뒤 광학현미경에서 관찰 및 사진 촬영하였다.
- 반대로, CF(CMFDA농도고정, FDA의 농도변화) 실험구는 1.7 ml의 micro-tube에 대상생물이 들어 있는 해수 1 mL 을 넣고 CMFDA를 10 µL씩 동일하게 주입한 뒤 여과해수에 400배로 희석한 FDA를 5, 10, 25, 50, 100 µL 농도로 주입하여 염색 효율을 파악하였다[Table 1].
- 백과 신[6]에 의하면, FDA염색방법은 다른 염색법과 비교하여 높은 염색 효율을 나타내었고, 본 연구에서도 선행연구의 결과를 바탕으로 보다 효율적인 생사판별법을 찾아내기 위해서 상대적으로 염색효율이 높으면서 유사한 염색방법인 CMFDA와 중복염색하여 평가하였다. FDA와 CMFDA를 농도별로 중복염색(double staining) 하여 염색효율을 알아본 결과는 Table 2 와 Figure 4에 나타내었다.
- 여기서 working solution은 여과해수에 희석하는 순간 CMFDA시약이 반응하기 때문에 염색할 때마다 일정량 여과해수에 분주 희석하여 농도를 100 µM로 만들어 사용하였고, 시료 1 mL에 CMFDA최종농도가 1µM과 5µM이 되도록 염색하여 평가하였다. 생물생사판별은 형광현미경(excitation: 365nm, emission: 445/450nm)에서 관찰 및 사진 촬영하였다.
- 여기서 working solution은 여과해수에 희석하는 순간 CMFDA시약이 반응하기 때문에 염색할 때마다 일정량 여과해수에 분주 희석하여 농도를 100 µM로 만들어 사용하였고, 시료 1 mL에 CMFDA최종농도가 1µM과 5µM이 되도록 염색하여 평가하였다.
- 채집 후 환경 변화에 따른 동·식물플랑크톤의 스트레스를 최소화하기 위해 실험실 온도를 해수 온도 (표층 수온: 20℃)와 유사한 상태로 유지 시킨 후 빠른 시간 내에 염색하여 분석하였다.
- 특히 죽은 부유생물을 확보하기 위해서 채집된 네트시료를 15 mL 튜브에 일정량 (10 mL) 넣고, 60 ℃ 에서 3시간 정도 사멸시킨 시료와 중성포르말린(1%)로 사멸시켜 각각 평가하였다.
- 특히, 선박평형수 처리 장치의 적합성을 확인하기 위하여, 처리된 시험수내 기준은 대장균 250 cfu 100 mL–1, 비브리오와 같은 위협 및 유해 균주는 1cfu 100 mL–1 이하로 지정하였고, 10-50 µm 크기의 생물(주로 식물플랑크톤)은 10 cells mL–1 미만으로, 그리고 >50 µm 크기그룹(동물플랑크톤)은 10 inds m–3 미만으로 각각 지정하였다[1, 3].
대상 데이터
- 생사판별에 이용한 동·식물플랑크톤은 거제시 장목면에 위치한 한국해양과학기술원 남해연구소 부두에서 2014년 10월에서 12월에 걸쳐 채집하였다.
- 식물플랑크톤은 망목이 20 μm의 네트로 채집하였고, 동물플랑크톤은 200 μm 네트를 이용해서 저층에서 표층까지 수직 인양하여 채집하였다.
- 식물플랑크톤은 망목이 20 μm의 네트로 채집하였고, 동물플랑크톤은 200 μm 네트를 이용해서 저층에서 표층까지 수직 인양하여 채집하였다. 채집된 시료는 250 mL 과 500 mL 채수병(PC bottle)에 각각 옮겨 담고, 실험실로 운반하였다. 채집 후 환경 변화에 따른 동·식물플랑크톤의 스트레스를 최소화하기 위해 실험실 온도를 해수 온도 (표층 수온: 20℃)와 유사한 상태로 유지 시킨 후 빠른 시간 내에 염색하여 분석하였다.
성능/효과
- 특히 규조류 중에서 Thalassionema 속의 대부분은 CMFDA에 대해 95% 이상의 높은 염색효율을 나타냈으며, Pseudo-nitzschia sp., Asterionella glacialis, Cylindrotheca closterium 종은 적색 형광의 간섭이 심하게 나타나 녹색 형광필터에서는 명확하게 구분 할 수 없었다. 또한 중성 포르말린으로 사멸시킨 플랑크톤은 사멸 시간에 관계없이 CMFDA에 따른 염색반응이 나타나지 않았다.
- 특히 중복염색에서도 Chaetoceros spp., Skeletonema costatum에서 적색 형광이 간섭하는 현상이 나타났으며, 그중 Chaetoceros 속의 일부종은 적색 형광의 간섭이 강하게 나타나는 것을 관찰하였다. Steinberg et al.
- 아울러, 체인을 형성하는 규조류중 세포내 엽록소가 파괴되거나, 소실된 세포에서는 녹색형광이 발하지 않아 생물의 생사를 명확하게 구분할 수 없었다. 60 ℃ 드라이 오븐에서 15분간 방치하여 사멸시킨 시료와 포르말린으로 고정하여 사멸시킨 시료를 염색한 뒤 형광을 확인한 결과, 각각의 사멸된 시료에서는 형광이 관측되지 않았다. 특히 규조류 중에서 Thalassionema 속의 대부분은 CMFDA에 대해 95% 이상의 높은 염색효율을 나타냈으며, Pseudo-nitzschia sp.
- Aniline blue 10-20 µL 의 농도에서는 전체 개체수 90% 이상의 염색율을 나타냈으나, 염색되는 정도가 명확하지 않았고, 종별로 염색반응이 다르게 나타났다.
- CMFDA 염색의 최종농도 1 µM에서 전체 식물플랑크톤의 군집의 53.3% 염색효율을 보였고, 5 µM에서는 72.1%로 높게 나타났다.
- Evans blue농도별로 염색한 결과, 가장 낮은 1 µL의 Evans blue working solution을 주입한 실험구에서는 염색반응이 일어나지 않았고, 동일하게 살아있는 생물에도 염색이 나타나지 않은 것으로 보아 극히 낮은 농도에서는 생사판별이 불가능하다는 것을 알 수 있었다.
- FDA를 25 µL 일정량 주입한 FC 실험군에서는 CMFDA를 10 µl 주입한 FC Treatment_2에서 98%로 가장 높은 염색효율을 보였으며, CMFDA를 10 µl로 일정량 주입한 CF(CF treatment_3)에서도 FC 실험군과 유사하게 86.7%로 높은 염색효율을 나타내었다.
- 3]. 결과적으로 CMFDA로 염색하여 녹색 형광필터로 관찰하였을 경우, 명확한 녹색이 나타났고, 이는 대상생물의 세포내 물질에 염색된 결과로 판단되며, 이를 근거로 생물의 생사판별이 가능하였다.
- 아울러, Figure 1F와 같이 사멸된 세포중 세포내부 물질이 세포외벽으로 용출된 것은 염색이 되지 않았고, 이는 세포가 이미 사멸되었음에도 불구하고, 염색이 되지 않기 때문에 염색결과의 오류를 야기할 수 있다. 결과적으로 동물과 식물플랑크톤을 동시에 생사를 판별하는 기법을 규명하는 것은 쉽지 않았으며, 특히 죽은 생물을 염색하여 평가하는 Evan blue와 Aniline blue의 방법은 오히려 생물의 생사를 과소평가할 가능성이 높기 때문에 선박평형수 처리장치 개발 후 USCG Phase II에 근거한 평가법으로 적합하지 않을 것으로 사료된다.
- 결과적으로 본 연구에서 식물플랑크톤과 원생생물을 대상으로 생물의 생사판별을 확인한 결과, FDA와 CMFDA 의 중복염색 실험에서 나타났고, 최적의 농도구배는 FDA 25 µL와 CMFDA 10 µL에서 95% 이상으로 관찰되었다.
- Aniline blue 10-20 µL 의 농도에서는 전체 개체수 90% 이상의 염색율을 나타냈으나, 염색되는 정도가 명확하지 않았고, 종별로 염색반응이 다르게 나타났다. 규조류 중에서도 Ditylum brightwellii 와 Asterionella glacialis 종은 염색효율이 각각 57%와 33%로 나타내었으며, Chaetoceros 속은100% 염색되었다. Aniline blue염색법에서도 Evans blue와 유사하게 50 µL이상의 농도에서는 염색농도가 너무 강하여 현미경으로 생물염색을 구분할 수 없었다[Fig.
- 또한, Evans blue working solution의 농도가 10-50 µL에서는 살아있는 동물플랑크톤 시료에 대해 전체 개체수의 10% 미만이 염색율을 나타내었고, 100 µL 이상의 농도에서는 높은 염색농도의 영향으로 바탕(background) 전체가 파란색으로 보여 생물의 염색정도를 명확하게 판단할 수 없었다.
- 추후 상기의 농도 구배에서 생물의 생사판별을 수행하면 USCG phase II의 선박평형수 처리장치의 개발에서도 효율적인 평가가 가능하다고 판단된다. 반면, Evan blue와 Aniline blue 의 방법은 광학현미경 하에서 관찰하는 이점이 있으나, 살아있는 생물에서도 부분적으로 염색되어 선박평형수 처리장치의 성능을 평가하는 방법으로는 적합하지 않을 것으로 사료되었다.
- , Skeletonema costatum, Thalassionema frauenfeldii, Thalassionema nitzschioides 는 100%에 준하는 염색효과를 관찰하였다. 반면, 와편모조류 Ceratium 속은 부분적으로 염색이 되거나 염색이 되지 않는 세포들이 다수확인되어 전체 50% 미만의 염색효율을 보였다. 100 µL농도에서는 Evans blue 농도가 너무 높아 현미경으로 염색특성을 구분할 수 없었다.
- IMO-D2에 의하면, 선박평형수 처리장치를 통과한 생물의 생사판별은 6시간 이내로 간단하면서 신속 정확하게 수행되어야 한다. 상기 5가지 방법은 염색이 간단하고 염색 후 반응 시간 또한 약 15분 정도 이내로 적절할 것으로 판단된다. 둘째, 대상생물을 염색한 후 일정 시간 이상 지속 되어야 한다.
- 둘째, 대상생물을 염색한 후 일정 시간 이상 지속 되어야 한다. 셋째, 대상 생물에 대한 염색 효율이 높아야 한다. 이것이 가장 중요한 항목으로 생물의 염색이 부분적으로 되거나 같은 종임에도 불구하고 염색 유무가 명확하지 않으면 생사판별시 매우 큰 혼란을 야기할 수 있다.
- 아울러, 식물플랑크톤과 같은 독립영양세포는 엽록소에서 고유의 자체 형광을 발하므로, 만약 이중염색에서조차 생사판별이 명확하게 이루이지지 않은 규조류의 일부 종에 관해서는 엽록소기원의 자체 형광을 발하는 것을 이용하게 되면, 생물생사판별이 가능하다. 이와 같이 FDA+CMFDA의 2중염색법에 더하여 엽록소 기원 자체 형광을 종합적으로 평가하면, 98%이상의 높은 효율로 생물의 생사판별이 가능할 것으로 판단된다. 다시 말하면, FDA+CMFDA에서도 염색되지 않고, 엽록소가 소실되어 형광을 발하지 않는 생물은 세포의 기능을 잃을 가능성이 높다.
- 죽은 식물플랑크톤 염색은 Evans blue working solution을 20 µL농도에서 최적의 염색효율을 보였고, 특히 최적농도에서도 종별로 종특이적인 염색효과를 나타내었다[Fig. 1].
- 하지만 본 연구의 FDA + CMFDA이중 염색방법에서는 상대적으로 높은 생사판별 효율을 보였고, 규조류의 일부종을 제외하면, 대체적으로 생물의 생사판별을 할 수 있는 좋은 염색방법이라고 사료된다. 아울러, 식물플랑크톤과 같은 독립영양세포는 엽록소에서 고유의 자체 형광을 발하므로, 만약 이중염색에서조차 생사판별이 명확하게 이루이지지 않은 규조류의 일부 종에 관해서는 엽록소기원의 자체 형광을 발하는 것을 이용하게 되면, 생물생사판별이 가능하다.
후속연구
- 결과적으로 FDA+CMFDA의 이중염색법은 모든 해양부유생물에게 완벽하게 적용할 수 있는 생사판별법은 아니지만, 상대적으로 극히 높은 염색효율(>95%)을 보이고 있으므로, 자가영양생물에서 발하는 형광을 혼합하여 평가하면 생물의 생사를 최대효율로 평가 할 수 있을 것으로 기대된다.
- 아울러, 다양한 생물을 평가한 결과 살아있는 생물은 74%-90%의 염색효율을 보고하였고, 이는 본 연구의 결과와 유사하였다. 결과적으로 부유성 플랑크톤의 종특이적으로 생물의 생사판별이 어려운 것은 여기 CMFDA을 활용한 연구에서도 다른 염색 시약과 유사하게 생사판별의 한계를 보였다.
- 특히, IMO협약 이후 향후 8년간 9만척의 선박에 대해 처리장치설비가 강제적으로 장착되어야 한다. 결과적으로 선박평형수 처리장치 개발업체의 입장에서는 많은 선박에 제품을 공급하기 위해서 처리장치모듈의 단순화 및 생산능력을 확충하는 것이 무엇보다 시급할 것이다. 하지만, 선박평형수 처리설비를 개발하는 과정에서 해양미소 생물이 정확하게 처리되고 있는지 여부를 평가할 수 있는 방법론 정립이 미흡하여 산업계의 부정적인 영향을 줄 수 있다.
- 결과적으로 본 연구에서 식물플랑크톤과 원생생물을 대상으로 생물의 생사판별을 확인한 결과, FDA와 CMFDA 의 중복염색 실험에서 나타났고, 최적의 농도구배는 FDA 25 µL와 CMFDA 10 µL에서 95% 이상으로 관찰되었다. 추후 상기의 농도 구배에서 생물의 생사판별을 수행하면 USCG phase II의 선박평형수 처리장치의 개발에서도 효율적인 평가가 가능하다고 판단된다. 반면, Evan blue와 Aniline blue 의 방법은 광학현미경 하에서 관찰하는 이점이 있으나, 살아있는 생물에서도 부분적으로 염색되어 선박평형수 처리장치의 성능을 평가하는 방법으로는 적합하지 않을 것으로 사료되었다.
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