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문제 정의
- 본 연구에서는 발효 서목태 엑기스 및 음료 추출물의 비만에 의한 항산화 활성을 비교 및 분석하여 기능성 식품에서 비만에 대한 항산화 효과에 기초 자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- 각각의 그룹은 정상 군(NOR: 생수 투여 + 정상식이), 대조 군(CON: 생수 투여 + 60% high fat diet), (FRN-E: 100% 발효 서목태 엑기스 투여 + 60% high fat diet), (FRNB: 8% 발효 서목태 엑기스 투여 + 60% high fat diet)으로 표기하여 실험하였다(Table 1). 10 일간 적응기간을 가진 후, 44 일간 급식하고 55 일째 되는 날 CO2로 마취하고 개복하여 장기의 상태를 확인하였고, 하대정맥에서 혈액을 채취하였으며, 4 엽의 간을 모두 적출한 뒤 식염수로 세척하여 여분의 혈액을 제거하였다. 그리고 혈액은 윈심분리 한 후 혈청을 획득하여 실험에 사용하기 전에 −74ºC에 보관하였고, 간 또한 −74ºC에 보관하여 실험에 사용하였다.
- SOD 효소 활성의 측정은 Beauchamp와 Fridovich법3)의 변형된 방법에 따라 0.2 M K-phosphate buffer (pH 7.4)를 6720 µl, 1 mM xanthine 100 µl, 1% sodium deoxychlorate 300 µl, 1.5 mM KCN 300 µl, 0.2 mM cytochrome C 1500 µl를 넣은 혼합액에 sample 80 µl를 넣고, xanthine oxidase 원액 10 µl를 넣은 후 Elisa (Microtiter plate reader, Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA., USA)를 이용하여 550 nm에서의 흡광도 변화를 2 분 동안 측정하였다.
- 실험동물은 8 주령이고 몸무게가 175 g Sprague-dawley(SD)계 암컷을 (주)셈타코코리아로부터 구입하여 사용하였다. 각 실험에 쓰이는 RAT은 매일 일정한 시간에 시료를 투여하였고(Table 1), 또한 체중을 매일 일정한 시각에 측정하였다(Fig. 1).
- 각각 10,000, 1,000, 500, 100 µg/ml이 되도록 희석한 후 희석액 800 µl에 1 N Folin-ciocalteu's phenol reagent (Sigma, USA) 100 µl을 첨가하여 잘 혼합하고 실온(25ºC)에서 3 분간 방치하였다.
- 쥐들은 난괴법(randomized complete block design)에 의해 4 군으로 각 군당 6 마리로 나누어 실험하였다. 각각의 그룹은 정상 군(NOR: 생수 투여 + 정상식이), 대조 군(CON: 생수 투여 + 60% high fat diet), (FRN-E: 100% 발효 서목태 엑기스 투여 + 60% high fat diet), (FRNB: 8% 발효 서목태 엑기스 투여 + 60% high fat diet)으로 표기하여 실험하였다(Table 1). 10 일간 적응기간을 가진 후, 44 일간 급식하고 55 일째 되는 날 CO2로 마취하고 개복하여 장기의 상태를 확인하였고, 하대정맥에서 혈액을 채취하였으며, 4 엽의 간을 모두 적출한 뒤 식염수로 세척하여 여분의 혈액을 제거하였다.
- cerevisiae로 각각 발효를 했을 때, 비슷한 소거능을 보였지만 비발효 일 때보다는 높은 소거능을 나타냈다. 이에 따라 본 연구에서는 발효한 서목태를 사용하였다.
- 쥐의 활동성을 주기 위해 12 시간 낮과 밤의 주기로 Auto control system기기(SS-2200, SYSTRONICS, KOREA)를 사용하여 온도 24 ± 2ºC와 습도 60 ± 5%로 유지하여 54 일간 사육하였다. 쥐들은 난괴법(randomized complete block design)에 의해 4 군으로 각 군당 6 마리로 나누어 실험하였다. 각각의 그룹은 정상 군(NOR: 생수 투여 + 정상식이), 대조 군(CON: 생수 투여 + 60% high fat diet), (FRN-E: 100% 발효 서목태 엑기스 투여 + 60% high fat diet), (FRNB: 8% 발효 서목태 엑기스 투여 + 60% high fat diet)으로 표기하여 실험하였다(Table 1).
- 쥐의 활동성을 주기 위해 12 시간 낮과 밤의 주기로 Auto control system기기(SS-2200, SYSTRONICS, KOREA)를 사용하여 온도 24 ± 2ºC와 습도 60 ± 5%로 유지하여 54 일간 사육하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 에탄올에 녹인 Gallic acid를 최종농도가 0, 50, 100, 150, 200, 250 µg/ml이 되도록 하여 725 nm에서 흡광도를 측정하여 표준검량곡선을 작성하였으며, 총 폴리페놀 함량은 µg gallic acid equivalents(GAE)/ml로 나타내었다.
- 으로 측정하였다. 측정하기에 앞서 효소의 효율에 따라 결과가 달라지므로 희석 배율을 정하여 선 측정 후 일정 희석배율에서 가장 좋은 효과가 보이는 희석배율을 선택하여 측정한다. 1.
- 항산화활성의 대표적인 지표인 radical 소거활성(radical scavenging activity)은 Blois4)의 방법을 변형하여 발효 서목태 엑기스에 대한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)의 전자공여능으로 측정하였다. 즉, 추출물의 농도별 희석액 50 µl에 0.
- , USA)를 이용하여 550 nm에서의 흡광도 변화를 2 분 동안 측정하였다. 효소의 활성도는 superoxide dismutase standard (Sigma Co., USA)를 표준액으로 사용하여 비교 측정하였다.
대상 데이터
- (주)셈타코에서 고지방 식이를 구입 하였으며 식이의 조성은 Table 2와 같다.
- 단백질의 정량은 Lowry법21)으로 750 nm에서 흡광도를 측정하였고, 표준 단백질 시료로 Bovine Serum Albumin (BSA)을 사용하였다.
- 찐 서목태 열수 추출물은 30ºC에서 48 시간 동안 발효한 후, 120ºC에서 멸균하였다. 발효물은 미세 모슬린 천을 이용하여 여과한 후 여과된 추출액을 실험에 사용하였다(yield: 2% w/w, dry weight).
- 실험동물은 8 주령이고 몸무게가 175 g Sprague-dawley(SD)계 암컷을 (주)셈타코코리아로부터 구입하여 사용하였다. 각 실험에 쓰이는 RAT은 매일 일정한 시간에 시료를 투여하였고(Table 1), 또한 체중을 매일 일정한 시각에 측정하였다(Fig.
- 실험에 사용된 발효 서목태 엑기스는 (주)할머니청국장에서 제공받았다. 발효 서목태는 전통 발효 방법을 사용하였으며 발효과정은 다음과 같다.
- 이 반응액을 실온(25ºC)에서 30 분간 방치한 후 96 well plate reader 기기(AT/Infinite M200, Tecan)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정한 후, 아래와 같은 식으로 DPPH radical 소거율을 계산하였다. 양성대조군으로 3,5-di-tert-4-butylhydro-xytoluene (BHT, Sigma, USA)를 사용하였다.
- , USA)하였다. 표준 시약으로는 1,1,4,4-tetra-ethoxy-propane를 사용하였다.
데이터처리
- All the values were expressed as means ± S.D. (n = 6), a,b,c,d,e are different (P < 0.01) group by one-way ANOVA followed by Duncan’s post hoc test.
- 본 실험에 대한 모든 실험 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었고, 통계적 유의성은 IBM SPSS Statistics Ver. 20 (IBM, NY, USA)를 이용한 one-way ANOVA로 검정하였으며, 사후 검증으로 Duncan’s post-hoc test과 t-test를 실시하였고 유의성은 p < 0.01과 p < 0.001로 하였다.
이론/모형
- CAT 효소 활성 측정은 Aebi법1)으로 측정하였다. 측정하기에 앞서 효소의 효율에 따라 결과가 달라지므로 희석 배율을 정하여 선 측정 후 일정 희석배율에서 가장 좋은 효과가 보이는 희석배율을 선택하여 측정한다.
- 실험에 사용된 발효 서목태 엑기스는 (주)할머니청국장에서 제공받았다. 발효 서목태는 전통 발효 방법을 사용하였으며 발효과정은 다음과 같다. 먼저 서목태를 수돗물로 세척하고 5 시간 동안 수돗물에서 방치했다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법9)을 응용하였다. 각각 10,000, 1,000, 500, 100 µg/ml이 되도록 희석한 후 희석액 800 µl에 1 N Folin-ciocalteu's phenol reagent (Sigma, USA) 100 µl을 첨가하여 잘 혼합하고 실온(25ºC)에서 3 분간 방치하였다.
성능/효과
- CAT는 정상군이 0.57 ± 0.06 nmol/mg protein, 대조군은 0.38 ± 0.01 nmol/mg protein, 발효 서목태 엑기스 섭취군은 0.57 ± 0.08 nmol/mg protein, 발효 서목태 음료 섭취군은 0.56 ± 0.02 nmol/mg protein로, 발효 서목태 엑기스 섭취군과 발효 서목태 음료 섭취군이 대조군에 비해 94.7~100% 증가하여 정상군으로의 회복을 나타냈다.
- 의 연구에서 메밀, 보리, 밀 및 호밀의 DPPH radical 소거능을 연구한 결과, 메밀이 가장 높은 소거능을 보였으며 고농도로 갈수록 높은 소거능을 나타냈다. 또한 L. rhamnosus와 S. cerevisiae로 각각 발효를 했을 때, 비슷한 소거능을 보였지만 비발효 일 때보다는 높은 소거능을 나타냈다. 이에 따라 본 연구에서는 발효한 서목태를 사용하였다.
- 발효 서목태 엑기스의 DPPH radical 소거효과는 각각 22.18 ± 0.63%, 10.65 ± 2.47%, 4.93 ± 0.63%, 3.56 ± 0.17%이며, 발효 서목태 음료에서는 각각 6.37 ± 0.54%, 3.77 ± 0.73%, 2.87 ± 0.15%, 1.80 ± 1.20%로 발효 서목태 엑기스가 발효 서목태 음료보다 DPPH radical 소거효과가 높았으며, 농도 의존적으로 감소하였다.
- 발효 서목태 엑기스의 총 폴리페놀 함량은 각각 229.08 ± 0.73 µg/ml, 36.84 ± 0.57 µg/ml, 18.74 ± 0.05 µg/ml, 12.11 ± 0.37 µg/ml이며, 발효 서목태 음료에서는 각각 77.01 ± 0.60 µg/ml, 35.76 ± 0.41 µg/ml, 12.74 ± 0.08 µg/ml, 10.02 ± 0.06 µg/ml로 발효 서목태 엑기스가 발효 서목태 음료보다 폴리페놀의 함량이 더 높았으며, 농도가 높을수록 폴리페놀 함량이 높았다.
- 25%로 물 추출물을 제외한 모든 추출물에서 유의성 있게 감소함을 보였다. 본 연구에서의 비만 유도 흰쥐의 MDA량이 더 감소하였으므로 사포닌보다 서목태가 지질과산화 억제에 더 효과가 있을 것으로 예측된다.
- 06 U/mg protein으로 40% 증가했다. 본 연구에서의 비만 유도 흰쥐의 SOD 활성이 더 높았으므로 대두보다 서목태가 간에서의 SOD 활성에 상승 효과가 있을 것으로 예측된다.
- 정상군이 22.32 ± 1.13 nmol/mg protein로 나타났고 대조군은 35.05 ± 1.23 nmol/mg protein, 발효 서목태 엑기스 섭취군은 23.57 ± 1.12 nmol/mg protein, 발효 서목태 음료 섭취군은 23.77 ± 1.14 nmol/mg protein로 발효 서목태 섭취군의 MDA 수치가 대조군에 비해 88.6~90.1% 감소하여 정상군에 가까운 수치를 보였다.
- 정상군이 86.33 ± 0.58 nmol/mg protein로 나타났고 대조군은 70.33 ± 0.58 nmol/mg protein, 발효 서목태 엑기스 섭취군은 79.20 ± 7.26 nmol/mg protein, 발효 서목태 음료 섭취군은 84.22 ± 9.40 nmol/mg protein로 발효 서목태 섭취 군의 SOD 수치가 대조군에 비해 55.4~86.8% 증가하여 정상군으로의 회복을 보였다.
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