극심하고 지속적인 자외선에의 노출은 정상적인 피부구조를 파괴하는 다양한 피부 광노화 과정을 야기한다. 자외선은 인체 피부에서 세포외기질의 구성성분을 분해시키는 기질 분해효소인 matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현을 활성화시키고, 콜라겐 합성은 감소시킴으로써 피부의 탄력과 구조적 치밀도를 약화시켜 궁극적으로 피부주름을 생성한다. 본 연구에서는 이러한 피부 광노화 현상을 완화시키는 소재로서 영실의 효능을 검증하고자 하였다. 먼저 인간 섬유아세포주인 Hs68을 이용하여 영실의 세포증식 촉진효능을 확인하였다. 여기에 더해 영실이 activator protein (AP)-1 전사인자의 억제를 통해 MMP의 발현을 감소시킴을 mRNA 및 단백질 수준에서 검증하였다. 또한, 진피층을 구성하는 타입 I형 콜라겐과 표피-진피 경계부를 단단히 고정시키는 역할을 하는 타입 IV형 콜라겐 역시 영실에 의해 발현이 증가하며, 자외선에 의한 염증반응의 억제에도 영실이 효과적으로 작용하는 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로 본 연구를 통해 영실이 자외선에 의한 피부노화와 주름생성을 효과적으로 개선할 수 있는 가능성을 가짐으로써 항노화, 항염증 및 항주름 소재로서 화장품에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
극심하고 지속적인 자외선에의 노출은 정상적인 피부구조를 파괴하는 다양한 피부 광노화 과정을 야기한다. 자외선은 인체 피부에서 세포외기질의 구성성분을 분해시키는 기질 분해효소인 matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현을 활성화시키고, 콜라겐 합성은 감소시킴으로써 피부의 탄력과 구조적 치밀도를 약화시켜 궁극적으로 피부주름을 생성한다. 본 연구에서는 이러한 피부 광노화 현상을 완화시키는 소재로서 영실의 효능을 검증하고자 하였다. 먼저 인간 섬유아세포주인 Hs68을 이용하여 영실의 세포증식 촉진효능을 확인하였다. 여기에 더해 영실이 activator protein (AP)-1 전사인자의 억제를 통해 MMP의 발현을 감소시킴을 mRNA 및 단백질 수준에서 검증하였다. 또한, 진피층을 구성하는 타입 I형 콜라겐과 표피-진피 경계부를 단단히 고정시키는 역할을 하는 타입 IV형 콜라겐 역시 영실에 의해 발현이 증가하며, 자외선에 의한 염증반응의 억제에도 영실이 효과적으로 작용하는 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로 본 연구를 통해 영실이 자외선에 의한 피부노화와 주름생성을 효과적으로 개선할 수 있는 가능성을 가짐으로써 항노화, 항염증 및 항주름 소재로서 화장품에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
Acute and chronic ultraviolet (UV) irradiation triggers severe skin photoaging processes, which directly disrupt the normal three-dimensional integrity of skin. UV light stimulates the expression of matrix metalloproteinases (MMPs) which degrade constituents of extracellular matrix (ECM) proteins. T...
Acute and chronic ultraviolet (UV) irradiation triggers severe skin photoaging processes, which directly disrupt the normal three-dimensional integrity of skin. UV light stimulates the expression of matrix metalloproteinases (MMPs) which degrade constituents of extracellular matrix (ECM) proteins. These MMPs reduce collagen synthesis and decrease skin elasticity and integrity, resulting in wrinkle formation. In this study, we identified Rosa multiflora hip extract (RME) as an effective anti-photoaging ingredient. First, cell proliferation activity of RME was verified using Hs68 human dermal fibroblast cell line. RME downregulated MMPs expression through the inhibition of activator protein (AP)-1. In addition, type I and IV collagen expressions were increased with RME treatment and UVB-induced inflammatory responses were also reduced after RME treatment. In conclusion, R. multiflora hip extract may effectively improve UVB-induced skin aging and wrinkle formation which may provide as an anti-aging, anti-wrinkle, and anti-inflammation ingredient in cosmetic industry.
Acute and chronic ultraviolet (UV) irradiation triggers severe skin photoaging processes, which directly disrupt the normal three-dimensional integrity of skin. UV light stimulates the expression of matrix metalloproteinases (MMPs) which degrade constituents of extracellular matrix (ECM) proteins. These MMPs reduce collagen synthesis and decrease skin elasticity and integrity, resulting in wrinkle formation. In this study, we identified Rosa multiflora hip extract (RME) as an effective anti-photoaging ingredient. First, cell proliferation activity of RME was verified using Hs68 human dermal fibroblast cell line. RME downregulated MMPs expression through the inhibition of activator protein (AP)-1. In addition, type I and IV collagen expressions were increased with RME treatment and UVB-induced inflammatory responses were also reduced after RME treatment. In conclusion, R. multiflora hip extract may effectively improve UVB-induced skin aging and wrinkle formation which may provide as an anti-aging, anti-wrinkle, and anti-inflammation ingredient in cosmetic industry.
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문제 정의
여러 연구결과들을 통해 영실의 관절염 완화[13], 항염증[14], 통증완화[15]에 대한 효능 등이 알려져 있으나 영실의 광노화에 대한 효과는 현재까지 알려진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 영실의 광노화 억제 효능을 인간 섬유아세포(Hs68)를 이용하여 확인함으로써 영실의 광노화 억제 효능을 검증하고, 이의 화장품소재로서의 가능성을 밝히고자 하였다.
본 연구에서는 영실의 광노화 억제 효능을 다양한 관점에서 접근하고자 하였다. 평가시료의 선택은 우선 영실의 메탄올 추출물로부터 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물을 획득한 다음 이들의 peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)α 및 PPARγ 발현 증가 활성을 확인, 비교하는 과정을 통해 이들 중 가장 뛰어난 활성을 보이는 분획물을 시료로 사용하는 방법을 선택하였다.
인체의 피부에서는 세 가지 PPAR 이성질체인 PPARα, PPARβ/δ, PPARγ가 주로 발현되며, 광노화 과정에서는 UVB 광선에 의해 이들 3가지 이성질체의 발현이 모두 현저하게 감소하게 된다[17]. 이 과정에서 PPAR 활성을 증가시키는 활성화제들의 사용이 피부에서도 효과를 발휘함이 여러 연구를 통해 보고된 바 있어 이에 PPAR 활성을 증가시키는 천연물의 발굴을 목표로 하였다[18,19]. 그 결과 영실 추출물이 PPARα 및 PPARγ 활성을 모두 증가시키는 dual agonist로서 작용함을 발견하였고, 그중에서도 메틸렌클로라이드 분획물이 가장 높은 활성을 보임을 확인하여, 해당 분획물을 이용한 광노화 억제효능 평가를 진행하였다(data not shown).
제안 방법
6 well plate 또는 96 well plate에 접종한 Hs68 섬유아세포가 70 - 80% 정도 찼을 때, 세포 배양 배지를 제거하고 Dulbecco’s phosphate-buffered saline(DPBS)을 이용하여 세포를 헹구어 준 다음 CL-1000M UV crosslinker(UVP, UK)를 이용하여 15 mJ/cm2 농도의 UVB를 조사해 광노화 반응을 유도하였다.
다음으로, 피부의 세포외기질을 구성하는 성분 중 가장 많은 비율을 차지하는 콜라겐에 대한 영실의 효능을 real-time PCR을 통해 확인하였다.
또한 PPAR 활성화제로 작용하는 물질들이 주로 염증반응에 뛰어난 효능을 나타내는데 착안하여, 영실의 염증억제 효능을 검증하였다. 다양한 종류의 pro-inflammatory cytokine 중 본 연구에서는 대표적으로 IL-1β, IL-6, IL-8에 대한 영실의 효과를 평가하였고, 그 결과, 세 가지 cytokine 모두에서 억제효능이 나타남을 확인하였다.
마지막으로 영실이 자외선에 의한 피부의 염증반응에도 억제효능을 나타내는가를 대표적인 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, IL-8의 발현 변화를 통해 확인하였다.
영실의 인간 섬유아세포에 대한 세포독성 여부 및 세포증식 효능을 확인하기 위해 인간 섬유아세포주인 Hs68을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
MMP의 발현을 촉진하는 가장 대표적인 전사인자로는 AP-1이 알려져 있다. 이들 AP-1을 구하는 두 가지 요소인 c-Fos와 c-Jun에 대해 western blot 방법을 이용하여 단백질 발현 변화를 확인하였다.
cells/well 농도의 섬유아세포를 96 well plate에 분주하여 24 h 동안 배양하였다. 이후 UVB 조사군과 비조사군으로 나누어 각각 영실 시료를 처리하고 다시 24 h 동안 추가 배양 후 DPBS로 세포를 헹군 뒤 0.5 mg/mL 농도의 3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT, Sigma, USA)용액을 넣어 4 h 동안 반응시켜 formazan 결정을 생성시켰다. MTT 용액을 제거하고 남은 formazan 결정을 DMSO에 용해하여 ELISA reader로 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
농도의 UVB를 조사해 광노화 반응을 유도하였다. 이후 남아있는 DPBS를 제거하고 영실 시료 또는 vehicle(DMSO)을 포함하는 혈청 미포함 DMEM 배지로 교체한 다음 배양기에서 배양하였다.
평가시료의 선택은 우선 영실의 메탄올 추출물로부터 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물을 획득한 다음 이들의 peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)α 및 PPARγ 발현 증가 활성을 확인, 비교하는 과정을 통해 이들 중 가장 뛰어난 활성을 보이는 분획물을 시료로 사용하는 방법을 선택하였다.
피부의 주름 형성에 가장 주된 역할을 하는 MMP의 증가에 영실이 미치는 영향을 확인하기 위해 mRNA 발현량을 real-time PCR을 통해 측정하였다.
합성한 cDNA로부터 MMP-1, MMP-2, MMP-3, COL1A1, COL4A1, interleukin(IL)-1 β, IL-6, IL-8의 발현량을 확인하기 위해 cDNA를 5배 희석한 다음 해당 유전자의 forward/reverse primer와 SYBR Green master mix (Invitrogen, USA)를 첨가한 다음 StepOne plus real-time PCR system (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 중합반응을 수행하였다.
대상 데이터
Total RNA 농도는 2 µg으로 보정하고, reverse transcription premix(ELPIS-Biotech, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성한 뒤 실험에 사용하였다.
사람 진피 섬유아세포주인 Hs68은 American type culture collection(ATCC, USA)에서 구매하였고, 10%의 fetal bovine serum (FBS)과 1%의 antibiotic/antimicotic(AA)용액이 첨가된 DMEM(Hyclone, USA) 배지를 이용하여 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 세포 배양 배지는 2일 간격으로 새로운 배지로 교체해주었고, 2 - 3일 간격으로 계대 배양을 시행하여 실험에 사용하였다.
위 과정을 3회 반복하여 얻은 농축된 메탄올 추출물을 증류수 2 L에 현탁시킨 후 동량의 메틸렌클로라이드로 3회 추출하였다. 유기층을 모아 무수황산나트륨으로 탈수시킨 후 40 ℃ 이하에서 감압 농축하여 메틸렌클로라이드 분획물 9.26 g을 수득한 다음, 이 분획물을 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma, USA)에 용해시켜 이를 실험의 시료로 사용하였다.
데이터처리
모든 통계값은 3번의 독립적인 실험 결과를 종합하여 t-test 실시를 통해 평가하였다. P 값이 0.
이론/모형
이후 배지를 제거한 다음 control을 제외한 나머지 well에 UVB를 15 mJ/cm2 농도로 조사한 후 FBS 무첨가 배지에 희석시킨 영실 시료를 첨가하여 추가로 2 h 배양하였다. 배양한 세포에 RIPA buffer를 처리하여 단백질을 추출하고 이를 bradford assay 방법으로 정량하였다. 이후 sample buffer와 RIPA buffer를 이용하여 총 단백질량이 20 µg이 되도록 보정한 다음 이를 sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 분리하였다.
성능/효과
MMP의 세 가지 종류인 collagenase, gelatinase, stromelysin에 해당하는 MMP-1, MMP-2, MMP-3의 mRNA 발현량을 측정한 결과, UVB 조사에 의해 MMP-1, MMP-2, MMP-3의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이에 반해 영실 시료를 처리한 군에서는 모든 종류의 MMP 발현이 농도 의존적으로 감소하는 결과를 나타내었다(Figure 2).
가장 우선적으로 섬유아세포에서 영실의 세포증식 및 세포사멸 억제효능을 확인하였고, 그 결과 영실이 정상세포의 증식은 촉진시키면서 자외선에 의해 손상된 세포의 사멸은 억제함을 검증하였다. 또한 Figure 4에 나타난 바와 같이 영실이 콜라겐 합성을 증가시키는 데에도 영향을 미침을 확인하였다.
그 결과 영실 추출물이 PPARα 및 PPARγ 활성을 모두 증가시키는 dual agonist로서 작용함을 발견하였고, 그중에서도 메틸렌클로라이드 분획물이 가장 높은 활성을 보임을 확인하여, 해당 분획물을 이용한 광노화 억제효능 평가를 진행하였다(data not shown).
그 결과, IL-1β와 IL-6, IL-8 모두 UVB를 조사한 군에서 그 발현량이 매우 높은 수준으로 증가함을 보였고, 영실 시료를 처리한 군의 경우에서는 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다.
그 결과, UVB 조사에 의해 c-Fos와 c-Jun, 그리고 이의 인산화된 형태인 p-c-Jun의 단백질 발현이 모두 현저하게 증가하는 모습을 나타내었고, 영실 시료를 처리한 군에서는 이들 발현이 다시 감소하는 것을 확인하였다(Figure 3). 이는 영실에 의한 MMP의 감소가 MMP 생성에 관여하는 상위 인자인 AP-1 전사인자의 활성화 억제를 통해 이루어짐을 의미한다.
다양한 종류의 pro-inflammatory cytokine 중 본 연구에서는 대표적으로 IL-1β, IL-6, IL-8에 대한 영실의 효과를 평가하였고, 그 결과, 세 가지 cytokine 모두에서 억제효능이 나타남을 확인하였다.
AP-1은 세포 형질전환, 성장, 분화, 및 사멸에 관여하는 조절단백질로써, 면역반응과 염증반응에도 관여 함이 알려져 있다[20]. 본 연구에서는 영실이 MMP의 종류인 collagenase, gelatinase, streptomycin에 각각 해당하는 MMP-1, MMP-2, MMP-3 모두에 억제효능을 가짐을 확인하였고, 이것이 MMP를 발현시키는 상위 전사 인자인 AP-1의 활성화 억제를 통해 일어남을 검증함으로써 영실이 콜라겐 분해를 억제하는 효능을 가짐을 확인하였다.
또한 Figure 4에 나타난 바와 같이 영실이 콜라겐 합성을 증가시키는 데에도 영향을 미침을 확인하였다. 이를 토대로 영실이 자외선에 의한 세포손상 회복과 정상세포의 증식 촉진에 작용함으로써 궁극적으로 콜라겐의 합성을 증가시키게 되고, 진피 내의 콜라겐 함량 증가와 표피-진피 치밀도 증가 모두에 영향을 미침을 유추할 수 있었다.
이에 반해 영실 시료를 처리한 군에서는 모든 종류의 MMP 발현이 농도 의존적으로 감소하는 결과를 나타내었다(Figure 2). 이를 통해 영실이 피부 세포외기질을 파괴하는 MMP의 발현을 억제함으로써 효과적으로 피부 광노화를 억제할 수 있을 것으로 유추할 수 있다.
이에 모든 실험결과를 종합해보면, 영실이 세포증식을 촉진하고 세포사멸은 억제시키며, 콜라겐 감소에 관여하는 MMP의 발현 증가 억제 및 콜라겐 합성 촉진에 영향을 미침을 알 수 있었다. 뿐만 아니라 자외선에 의한 염증반응에도 효과적으로 작용함으로써 피부노화와 주름생성을 효과적으로 개선할 수 있는 가능성을 가짐을 유추할 수 있다.
후속연구
뿐만 아니라 자외선에 의한 염증반응에도 효과적으로 작용함으로써 피부노화와 주름생성을 효과적으로 개선할 수 있는 가능성을 가짐을 유추할 수 있다. 결론적으로 영실은 유용한 항노화, 항염증 및 항주름 소재로서 화장품에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
또한 현재 영실의 지표물질 분석을 위해 메틸렌클로라이드 분획물로부터 70% 메탄올과 n-hexane을 이용한 지용성 물질분획 과정을 통해 순수 화합물인 ursolic acid를 분리하는 데 성공하였으며, 향후 이를 이용한 광노화 억제효능 검증을 추가적으로 진행함으로써 ursolic acid가 영실의 효능성분으로 기능하는지를 확인할 예정에 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
다양한 종류의 MMP는 상황에 따라 어떠한 반응을 유발하는가?
세포외기질 단백질의 분해뿐만 아니라 피부장벽 또는 염증에 대한 MMP의 역할 역시 여러 연구를 통해 알려지고 있다. 다양한 종류의 MMP들이 상황에 따라 염증반응을 촉진시키기도 하고 억제시키기도 하는데, 자외선 조사에 의해 광노화 반응이 유도된 경우에는 다양한 pro-inflammatory cytokine들의 발현이 MMP와 함께 증가하는 양상을 보인다[11,12].
여러 연구를 통해 밝혀진 영실의 효능은 무엇인가?
영실은 장미과의 찔레꽃열매를 말린 약재로 한국, 일본, 중국 등에서 전통적으로 감기, 독감, 퇴행성 및 류마티스성 관절염 등에 사용되어왔다. 여러 연구결과들을 통해 영실의 관절염 완화[13], 항염증[14], 통증완화[15]에 대한 효능 등이 알려져 있으나 영실의 광노화에 대한 효과는 현재까지 알려진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 영실의 광노화 억제 효능을 인간 섬유아세포(Hs68)를 이용하여 확인함으로써 영실의 광노화 억제 효능을 검증하고, 이의 화장품소재로서의 가능성을 밝히고자 하였다.
피부가 자외선에 노출되면 MMPs는 어떠한 형태로 발현이 증가하는가?
MMP는 아연을 함유하는 단백질 분해효소로 25가지 종류가 알려져 있는데, 기질특이성의 차이나 세포막에 결합하는지 용해성 단백질로 방출되는지 에 따라 크게 콜라겐분해효소, 젤라틴분해효소, 스트로멜라이신 및 멤브레인형 MMP 로 구분된다[4]. 피부가 자외선에 노출되면 우선 콜라겐분해효소인 MMP-1의 발현이 급격히 증가하면서 진피에 존재하는 타입Ⅰ과 Ⅲ 콜라겐을 절단시켜 콜라겐 단편을 만들고, 다음으로 젤라틴분해효소인 MMP-2와 MMP-9이 이러한 콜라겐 단편들을 더욱 분해시킨다. 스트로멜라이신의 한 종류인 MMP-3의 경우에는 MMP-1, MMP-2, MMP-9의 전구체를 활성화 및 조절함으로써 콜라겐 분해를 더욱 촉진시키는 역할을 한다[6].
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