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문제 정의
- 본 연구는 국가 식품 영양성분 자료구축을 위하여 국내 다소비, 다빈도 이용식품과 단순 가공단계별로 선정한 조리가공식품 등의 비타민 D 함량을 조사하고자 하였다. 비타민 D 함량 분석은 external standard 방법을 이용하여 6-way switching system HPLC/UVD 및 LC-MS/MS로 분석하였다.
- 본 연구에서는 국내에서 상용되는 식품 중 우리나라에서 생산량이 가장 많고 소비가 가장 많이 되는 농수산식품 자원과 단순가공 단계별로 선정한 조리가공 식품에 함유되어 있는 비타민 D 함량 분석을 실시함으로써 국민영양평가의 기초 자료로 활용되고 있는 식품성분표 구축에 도움이 되고자 하였다.
제안 방법
- 함량을 2반복하여 분석하였다. 가식부에 따라 사과와 포도는 껍질을 포함한 것과 포함하지 않은 것으로 나누어서, 파파야는 미숙, 적숙, 완숙 등으로 나누어 분석을 실시하였다. 채소류 중 달래, 돌나물, 고비, 참두릅, 참죽나물, 마늘쫑, 세발나물, 깻잎, 근대, 당근, 피망, 파프리카, 고구마 줄기, 고구마잎, 브로콜리, 삼채, 양파, 흙토마토, 적겨자잎, 콜라비, 브루셀스트라우트, 고추잎, 갯기름나물, 호박, 보리순을 섭취 방법에 따른 단순가공처리 단계별로 생것, 데친 것, 찐 것, 삶은 것, 말린 것, 숙건 등으로 나누어서 2반복하여 비타민 D2 및 D3 함량을 분석하였다.
- 이렇게 선정된 시료들은 2013년 농촌진흥청이 국가 표준 식품성분표 제 9개정판을 발간하기 위한 연구사업의 일환으로 선정한 것이다. 곡류 및 곡류 가공품 44종(일반 곡류 4종, 밀 가공품 7종, 과자류 17종, 면류 10종, 시리얼류 7종), 채소류 68종(달래, 돌나물, 고비, 참두릅, 참죽나물, 마늘쫑, 세발나물, 깻잎, 근대, 당근, 피망, 파프리카, 고구마 줄기, 고구마잎, 브로콜리, 삼채, 양파, 흙토마토, 적겨자잎, 콜라비, 브루셀스트라우트, 고추잎, 갯기름나물, 호박, 보리순의 생것, 데친 것, 찐 것 등의 가공단계별 선정), 과일류 24종(포도, 키위, 살구, 블루베리, 수박, 사과, 파파야, 패션프르트, 후르츠 칵테일), 서류 24종(돼지감자, 감자, 고구마, 토란의 생것, 찐것, 삶은 것, 구운 것 등의 가공단계별 선정), 견과류 및 종실류 11종(아몬드, 밤, 흰깨, 검정깨, 들깨의 마른 것, 볶은 것 등의 가공단계별 선정), 버섯류 6종(표고, 느타리, 느티만가닥버섯)을 농산물 대형마트, 일반 대형마트, 농산물 시장의 순서로 확보하였다. 확보된 시료는 국립농업과학원 기능성식품과에서 전 처리 및 단순 가공 처리하여 균질화 과정을 거쳐 동결 후 배송되면, 배송된 시료는 －20℃ 냉동고에서 저장하여 분석에 사용하였다.
- 과일류 중 살구, 블루베리, 수박, 패션프르트, 키위(골드, 그린), 사과, 파파야, 포도(캠벨얼리, 거봉, 청포도) 및 과일가공품 후르츠 칵테일의 비타민 D2 및 D3 함량을 2반복하여 분석하였다. 가식부에 따라 사과와 포도는 껍질을 포함한 것과 포함하지 않은 것으로 나누어서, 파파야는 미숙, 적숙, 완숙 등으로 나누어 분석을 실시하였다.
- 버섯류 중 표고버섯, 상황버섯, 느타리버섯, 느티만가닥버섯의 비타민 D2 및 D3 함량을 분석하였다(Table 8). 목이버섯과 표고버섯 마른 것에서 D2가 검출되었는데, 건목이버섯에서는 363.
- 분석에 사용된 6-way switching valve는 Agilent Technologies의 1200 series이고, 컬럼은 전 처리, 농축, 분석 컬럼으로 C8(4.6×150 mm, 5 μm), C18(2.1×100 mm, 2.6 μm), C18(4.6×250 mm, 4 μm)을 사용하여 분석하였다(Table 3).
- 비타민 D2와 비타민 D3의 검출 유무를 판단하기 위하여 고속 액체 크로마토그래프/질량분석기(Liquid chromatography/tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)를 이용하였다. 고속 액체 크로마토그래프는 Agilent Technologies의 1290 Infinity series를 사용하였고, 질량분석기로는 동사의 6430 Triple Quad MS를 사용하였다.
- 서류 중 돼지감자, 감자(수미, 대지, 보라, 로즈), 고구마(밤, 호박), 토란과 견과류 및 종실류 중 아몬드, 밤, 흰깨, 검정깨, 들깨의 비타민 D2 및 D3 함량을 2회 반복하여 분석하였다. 이들은 섭취 방법에 따른 단순가공처리 단계별로 생것, 마른것, 삶은것, 찐것, 구운것, 볶은것 등으로 나누어 분석하였다.
- 시험용액 200 μL를 HPLC에 주입하여, 전 처리 컬럼에서 1차 분리하고, 8.5~10.5분 동안의 이동상을 농축 컬럼에 농축하였으며, 농축된 용액이 분석용 컬럼에 주입되어, UV/Vis detector 264 nm에서 검출된 비타민 D2와 D3의 피크의 면적으로 비타민 D 함량을 구하였다.
- 그러나 식품에 따라 matrix가 다양하여 HPLC 정량 시 비타민 D2 및 D3와 동일한 검출시간을 갖는 피크 또한 검출되는 감도가 높아져, 비타민 D가 아닐 것으로 사료되는 시료에서도 동 시간에 피크가 검출됨에 따라 이를 확인할 새로운 방법이 요구되었다. 이에 비타민 D를 정성함에 있어 선택성과 감도가 우수한 LC-MS/MS 방법을 이용하여 분석을 실시하였다. 채소류(참두릅, 참죽나물 등)의 비타민 D 분석 시 HPLC chro- matogram 상에는 비타민 D2와 동일한 검출시간을 갖는 피크가 관찰되었다(Fig.
- 잔류물에 메탄올 2 mL를 가하여 녹여 이를 0.45 μm syringe filter(Nylon, GE water & process Technologies)로 여과한 후, LC-MS/MS와 6-way switching system HPLC/UVD 분석을 통하여 비타민 D2와 비타민 D3 함량을 각각 정량하였다.
- 정량은 자외부 검출기가 장착되어 있는 high performance liquid chromatograph(HPLC, 1100 series, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 분석을 수행하였다. 분석에 사용된 6-way switching valve는 Agilent Technologies의 1200 series이고, 컬럼은 전 처리, 농축, 분석 컬럼으로 C8(4.
- 정확성과 정밀성은 시판되고 있는 SRM 1849a(infant/adult nutritional formula)를 3회 반복 분석한 분석치와 NIST에서 제시한 인증값(vitamin D3 reference value=11.1±1.7 μg/100 g)을 비교하여 회수율과 상대표준편차로 나타내었고, 검출한계는 각 분석물질 주변 피크의 신호/잡음(signal/noise, S/N)의 비율이 3.3에 해당하는 각각의 농도를 검출한계로 하였으며, S/N의 비율이 10에 해당하는 각각의 농도를 정량한계로 계산하였다.
- 직선성은 비타민 D2와 D3 표준용액을 10, 20, 50, 100, 200, 500 ng/mL의 농도가 되도록 메탄올로 희석한 후, 6-way switching system HPLC/UVD에 주입하여 얻어진 피크면적으로부터 검량선을 작성하고, 직선성(R 2>0.98)을 구하였다.
- 가식부에 따라 사과와 포도는 껍질을 포함한 것과 포함하지 않은 것으로 나누어서, 파파야는 미숙, 적숙, 완숙 등으로 나누어 분석을 실시하였다. 채소류 중 달래, 돌나물, 고비, 참두릅, 참죽나물, 마늘쫑, 세발나물, 깻잎, 근대, 당근, 피망, 파프리카, 고구마 줄기, 고구마잎, 브로콜리, 삼채, 양파, 흙토마토, 적겨자잎, 콜라비, 브루셀스트라우트, 고추잎, 갯기름나물, 호박, 보리순을 섭취 방법에 따른 단순가공처리 단계별로 생것, 데친 것, 찐 것, 삶은 것, 말린 것, 숙건 등으로 나누어서 2반복하여 비타민 D2 및 D3 함량을 분석하였다. 과일 류와 채소류 모두에서 비타민 D는 검출되지 않았다(Table 6).
- 6×250 mm, 4 μm)을 사용하여 분석하였다(Table 3). 표준물질을 전 처리 컬럼에 주입하여 비타민 D2와 D3가 검출되는 시간을 측정하고, 검출기에 도달하는 전/후 1분 동안을 분취 시간으로 설정하였다. 시험용액 200 μL를 HPLC에 주입하여, 전 처리 컬럼에서 1차 분리하고, 8.
- 5분 동안의 이동상을 농축 컬럼에 농축하였으며, 농축된 용액이 분석용 컬럼에 주입되어, UV/Vis detector 264 nm에서 검출된 비타민 D2와 D3의 피크의 면적으로 비타민 D 함량을 구하였다. 표준품은 비타민 D2와 비타민 D3를 10 mg씩 메탄올에 녹이고, 이를 10, 20, 50, 100, 200, 500 ng/mL의 농도가 되도록 희석하여 검량선을 작성하였다.
대상 데이터
- (cholecalciferol) 추출을 위하여 사용된 ethanol, n-hexane 및 기기분석에 사용된 methanol, acetonitrile은 특급시약(HPLCgrade)을 사용하였다. 검량선을 얻기 위한 비타민 D2(99.0%, Dr. Ehrenstorfer, Augsburg, Germany)와 비타민 D3(99.7%, Dr. Ehrenstorfer, Augsburg, Germany)는 각각 표준품을 구입하여 사용하였다.
- 의 검출 유무를 판단하기 위하여 고속 액체 크로마토그래프/질량분석기(Liquid chromatography/tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)를 이용하였다. 고속 액체 크로마토그래프는 Agilent Technologies의 1290 Infinity series를 사용하였고, 질량분석기로는 동사의 6430 Triple Quad MS를 사용하였다. 칼럼은 Phenomenex의 Kinetex C18(4.
- 본 실험에서 시료들로부터 비타민 D2(ergocalciferol)와 비타민 D3(cholecalciferol) 추출을 위하여 사용된 ethanol, n-hexane 및 기기분석에 사용된 methanol, acetonitrile은 특급시약(HPLCgrade)을 사용하였다. 검량선을 얻기 위한 비타민 D2(99.
- 본 연구에서 사용된 시료는 국민건강영양조사를 통해 생산되는 국민건강통계(2010~2012)를 참고로 하여 국내 다소비, 다빈도 이용식품과 통계청의 농림어업 총 조사 등을 활용하여 선정한 다소비 작목 중 주요 작목의 품종별로 샘플링되었고, 샘플링된 작목은 다시 단순 가공 단계별로 나누어 선정하였다. 이렇게 선정된 시료들은 2013년 농촌진흥청이 국가 표준 식품성분표 제 9개정판을 발간하기 위한 연구사업의 일환으로 선정한 것이다.
- 곡류 및 곡류 가공품 44종(일반 곡류 4종, 밀 가공품 7종, 과자류 17종, 면류 10종, 시리얼류 7종), 채소류 68종(달래, 돌나물, 고비, 참두릅, 참죽나물, 마늘쫑, 세발나물, 깻잎, 근대, 당근, 피망, 파프리카, 고구마 줄기, 고구마잎, 브로콜리, 삼채, 양파, 흙토마토, 적겨자잎, 콜라비, 브루셀스트라우트, 고추잎, 갯기름나물, 호박, 보리순의 생것, 데친 것, 찐 것 등의 가공단계별 선정), 과일류 24종(포도, 키위, 살구, 블루베리, 수박, 사과, 파파야, 패션프르트, 후르츠 칵테일), 서류 24종(돼지감자, 감자, 고구마, 토란의 생것, 찐것, 삶은 것, 구운 것 등의 가공단계별 선정), 견과류 및 종실류 11종(아몬드, 밤, 흰깨, 검정깨, 들깨의 마른 것, 볶은 것 등의 가공단계별 선정), 버섯류 6종(표고, 느타리, 느티만가닥버섯)을 농산물 대형마트, 일반 대형마트, 농산물 시장의 순서로 확보하였다. 확보된 시료는 국립농업과학원 기능성식품과에서 전 처리 및 단순 가공 처리하여 균질화 과정을 거쳐 동결 후 배송되면, 배송된 시료는 －20℃ 냉동고에서 저장하여 분석에 사용하였다.
이론/모형
- 7 mL/min으로 흘려주었다. MS/MS는 양이온 모드에서 검출하였는데, 최적의 검출을 위하여 4,000 V의 capillary voltage, 350℃의 gas temperature, 11 L/min의 gas flow 등(Table 1)과 비타민 D2와 비타민 D3의 precursor ion, product ion, fragmentor, collision energy 등에 대한 최적의 조건을 Table 2와 같이 설정하여 다중반응탐색법(multiple reaction monitoring; MRM) 모드를 적용하여 정성을 실시하였다.
- 본 실험의 유효성 검증은 CODEX guideline에 따라 직선성 (linearity), 정확성(accuracy), 정밀성(precision), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantitation, LOQ) 및 회수율(recovery)을 측정하였다(Codex Alimentarius Commission 1993). 직선성은 비타민 D2와 D3 표준용액을 10, 20, 50, 100, 200, 500 ng/mL의 농도가 되도록 메탄올로 희석한 후, 6-way switching system HPLC/UVD에 주입하여 얻어진 피크면적으로부터 검량선을 작성하고, 직선성(R 2>0.
- 본 연구는 국가 식품 영양성분 자료구축을 위하여 국내 다소비, 다빈도 이용식품과 단순 가공단계별로 선정한 조리가공식품 등의 비타민 D 함량을 조사하고자 하였다. 비타민 D 함량 분석은 external standard 방법을 이용하여 6-way switching system HPLC/UVD 및 LC-MS/MS로 분석하였다. 곡류 및 곡류가공품 44종, 채소류 68종, 과일류 24종, 서류 24종, 견과류 및 종실류 11종, 버섯류 6종을 분석한 결과, 곡류 가공품 중 시리얼류의 경우 7종 모두에서 비타민 D3가 검출되었는데, 그 범위는 1.
- 비타민 D2와 비타민 D3의 함량분석을 위하여 알칼리 비누화법을 수행한 후 동시 추출하였다(Ministry of Food and Drug Safety 2014). 먼저 균질화된 시료 1~3 g을 갈색 비누화플라스크에 정밀히 취한 후, 피로갈롤ㆍ에탄올(1→10) 용액 40 mL를 첨가하여 약하게 sonication을 수행하였다.
성능/효과
- 지금까지 비타민 D 분석은 시료를 검화하고, n-hexane으로 추출하여 6-way switching system HPLC를 이용하여 분석하여왔다. 6-way switching system HPLC를 이용하여 주입량이 늘어나고, 이에 따라 HPLC의 검출 감도가 높아져 식품 속에 미량으로 함유되어 있는 비타민 D의 정량이 용이해졌다. 그러나 식품에 따라 matrix가 다양하여 HPLC 정량 시 비타민 D2 및 D3와 동일한 검출시간을 갖는 피크 또한 검출되는 감도가 높아져, 비타민 D가 아닐 것으로 사료되는 시료에서도 동 시간에 피크가 검출됨에 따라 이를 확인할 새로운 방법이 요구되었다.
- 2). 감자류(수미, 대지, 보라, 로즈)에서는 HPLC chromatogram 상에서 비타민 D3와 동일한 검출시간을 갖는 피크가 관찰되었으나(Fig. 3), 이 또한 LC-MS/ MS 확인 결과, 비타민 D3 표준품과 Product ion 비율 불일치로 비타민 D3가 아닌 것으로 판단되었다(Fig. 4). 이처럼 다양한 식품군의 matrix에 따라 비타민 D와 동일한 검출시간을 갖는 위 피크가 관찰될 때 LC-MS/MS 방법이 검출과 불검출을 판별해 내는 유효한 분석법으로 사료된다.
- 곡류 및 곡류가공품 44종, 채소류 68종, 과일류 24종, 서류 24종, 견과류 및 종실류 11종, 버섯류 6종을 분석한 결과, 곡류 가공품 중 시리얼류의 경우 7종 모두에서 비타민 D3가 검출되었는데, 그 범위는 1.882~4.856 μg/100 g의 수준이었으며, 건목이버섯에서는 363.85 μg/100 g, 건표고버섯에서는 199.42 μg/100 g이 각각 검출되었다.
- 함량의 평균값은 Table 5와 같다. 곡류 중 찰기장쌀(생것)과 메 조(생것), 메조(찐것)는 비타민 D2와 D3 모두 불검출로 나타났고, 밀 가공품 중 도정한 밀, 밀가루(강력, 중력, 박력), 부침 가루, 튀김가루, 빵가루 모두 비타민 D2와 D3가 불검출로 나타났다. 시중 판매되는 다소비 과자류 17종도 비타민 D2와 D3가 모두 불검출이었고, 소면, 국수, 칼국수, 당면의 면류도 모두 불검출로 나타났다.
- 1). 그러나 LC-MS/MS 확인 결과, 비타민 D2 표준품과 Product ion 비율 불일치로 비타민 D2가 아닌 것으로 판단되었다(Fig. 2). 감자류(수미, 대지, 보라, 로즈)에서는 HPLC chromatogram 상에서 비타민 D3와 동일한 검출시간을 갖는 피크가 관찰되었으나(Fig.
- 비타민 D2와 D3 표준용액 10, 20, 50, 100, 200, 500 ng/mL 농도 범위에서 검량선을 작성한 결과, 상관계수(R2)는 1.0000으로 우수한 직선성을 나타내었다. 비타민 D2와 D3의 LOD 및 LOQ는 비타민 D2의 경우 각각 0.
- 곡류 중 찰기장쌀(생것)과 메 조(생것), 메조(찐것)는 비타민 D2와 D3 모두 불검출로 나타났고, 밀 가공품 중 도정한 밀, 밀가루(강력, 중력, 박력), 부침 가루, 튀김가루, 빵가루 모두 비타민 D2와 D3가 불검출로 나타났다. 시중 판매되는 다소비 과자류 17종도 비타민 D2와 D3가 모두 불검출이었고, 소면, 국수, 칼국수, 당면의 면류도 모두 불검출로 나타났다. 반면에 시리얼류에서는 7종 모두에서 비타민 D3가 검출되었는데, 그 범위는 1.
- 버섯에는 비타민 D2의 전구체인 ergosterol이 많이 존재하는데, 버섯이 적당량의 햇빛을 받아 건조되면 즉, 자외선을 받게 되면 비타민 D2(ergocalciferol)로 전환된다. 이렇게 전환된 비타민 D2가 표고버섯보다는 목이버섯에서 그 함량이 더 높은 것으로 확인되었다. 국가표준식품성분표(Rural Development Administration 2006)에는 느타리버섯의 경우에도 비타민 D2가 소량 존재하는 것으로 보고되었으나, 본 연구에서 불검출된 것은 버섯의 수확시기, 재배 조건, 건조 조건 등에 영향을 받은 것으로 생각된다.
- 표준참고물질 SRM 1849a(vitamin D3 reference value=11.1±1.7 μg/100 g)를 반복 분석한 결과, 회수율은 92.79% 이었으며, 반복측정에 따른 C.V.(coefficient variation)는 10%미만이었다(Table 4).
후속연구
- 그러나 아직도 식품 중에 들어있는 비타민 D에 관한 자료는 매우 제한되어 있다. 국민의 건강한 식생활을 위하여 식품 중에 들어있는 비타민 D의 함량을 제공할 수 있다면 국민 영양조사 시 비타민 D의 섭취량을 보다 정확하게 알 수 있으며, 또한 단체 급식 시 식단 작성에 큰 도움이 될 것으로 생각된다.
- 6-way switching system HPLC를 이용하여 주입량이 늘어나고, 이에 따라 HPLC의 검출 감도가 높아져 식품 속에 미량으로 함유되어 있는 비타민 D의 정량이 용이해졌다. 그러나 식품에 따라 matrix가 다양하여 HPLC 정량 시 비타민 D2 및 D3와 동일한 검출시간을 갖는 피크 또한 검출되는 감도가 높아져, 비타민 D가 아닐 것으로 사료되는 시료에서도 동 시간에 피크가 검출됨에 따라 이를 확인할 새로운 방법이 요구되었다. 이에 비타민 D를 정성함에 있어 선택성과 감도가 우수한 LC-MS/MS 방법을 이용하여 분석을 실시하였다.
- 현재 식품성분표가 수록하고 있는 식품의 영양성분에 관한 데이터는 여러 산학연에서 산발적으로 연구가 이루진 것이며, 이에 대한 검증이 이루어지지 않은 데이터가 대부분이다. 이를 기초 자료로 활용하는 차기 연구 결과들은 신뢰도가 저하되는 결과를 초래할 수 있어, 신뢰도 높은 국가 표준 식품성분표 개발이 선행되어야 할 것이다. 또한 한국의 지역별 다양한 기후 특징은 동일한 작물일지라도 각 지역과 계절에 따라 함유성분이 다른 식품으로 생산될 수 있기 때문에, 식품 성분의 다양성을 반영할 수 있는 시료의 샘플링 전략이 필요하다.
- 또한 한국의 지역별 다양한 기후 특징은 동일한 작물일지라도 각 지역과 계절에 따라 함유성분이 다른 식품으로 생산될 수 있기 때문에, 식품 성분의 다양성을 반영할 수 있는 시료의 샘플링 전략이 필요하다. 즉, 동일한 식품명을 가지고 있다고 하더라도 생산지역, 제조방법 등에 따라 성분 함량 차이를 나타낼 수 있으므로, 우리나라 국민이 실제 섭취하는 대표 식품에 대한 성분 함량 분석 자료를 구축할 필요가 있다고 하겠다.
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