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문제 정의
- 본 연구에서는 국내 식물자원 126과 599종 식물의 전초, 뿌리, 열매로부터 methanol로 추출한 조추출물 708종을 수집하고 이들을 이용하여 화장품에 주로 발생하는 Staphylococcus aureus (황색포도상구균), Pseudomonas aeruginosa (녹농균), Candida albicans 등 3종 미생물들에 대한 생육억제 효과를 조사하여 천연 항균성 보존제로서의 이용 가능성을 검토하였다.
제안 방법
- 126과, 599종의 식물에서 뿌리, 잎 등의 부위별로 나누어 methanol로 추출한 조추출물 708종의 조추출물이 화장품에 주로 오염원이 되는 3종 미생물, Staphyloccus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans등의 생육에 미치는 영향을 조사하였다 (Table 2).
- Each microorganism was inoculated in 96-well microplate containing 5,000 ㎍ mL−1 of plant extract and observed after 1-2 days for their growth under light microscope and repeated for 3 times with 3 times of independent replicated experiment.
- Positive control로는 식물체 조추출물 희석액 대신에 nutrient broth나 YPD broth를 첨가하였고 negative control로는 식물체 조추출물 희석액 대신에 멸균증류수를 첨가하였다. 미생물이 접종된 96-well microplate는 건조와 오염을 방지하기 위하여 microplate 뚜껑을 덮은 다음 주방용 랩 (Lock & Lock Co.
- 감압 여과된 methanol 분획은 회전진공농축기 (R-215, BCHI Labortechnik AG, Flawil, Switzerland)를 이용하여 45℃에서 감압 농축한 후 동결 건조 (IlshinBiobase, Dongdoochun, Korea)하여 methanol 조추출물로 조제한 다음 냉동 보관 (−5 ± 1℃)하면서 항균성실험에 사용하였다.
- 미생물 생육억제 활성검정은 96-well microplate (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하였는데, 96-well microplate의 각 홀에 식물체 조추출물 희석액 (1% W/V, 10 ㎎ mL−1) 30 µL와 살균증류수에 희석시킨 미생물 배양체 희석액 (1X104 CFU mL−1) 30 µL를 혼합하여 총 60 µL로 만들어 microplate well에서의 최종적으로 식물체 조추출물 농도를 5,000 ㎍ mL−1 (5 ㎎ mL−1)로 조정하여 식물체 조추출물의 미생물 생육억제 효과를 조사하였다.
- 식물체 추출물에 대한 96-well microplate이용 생육억제 효과 시험은 1회 시험에 3반복이상 실시하였으며 3회 이상 실시하여 일관된 생육억제 효과가 나오는 것을 확인한 다음 항균효과에 대한 결과를 작성하였다.
- 접종된 96-well microplate는 도립현미경 (CKX41, Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 배양 1일 후 부터 미생물의 증식을 관찰하였다.
- 쥐꼬리망초 (Justicia procumbens)를 비롯한 126과, 599종의 식물체 (Table 1)를 상온조건 음지에서 건조한 다음 0.6 ㎜ 이하로 분쇄하여 건조시료를 제조하고, 준비된 건조시료 100 g 을 5 L 삼각플라스크에 넣고 99% methanol 2 L를 부어 실온에서 24시간 두었다. Methanol 추출액은 부흐너깔때기 (Buchner funnel, Daihan Scientific, Seoul, Korea)에 whatman여과지 (#1, Whatman International Ltd.
대상 데이터
- albicans KACC 30003)를 사용하였으며 세균류의 배양용 배지는 Nutrient agar배지 (Difco BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)를 진균류의 배양용 배지는 YPD배지 (Difco BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)를 사용하였다. 시험균주들은 각각의 배지에 접종하여 30℃에서 2-3일간 배양한 다음 5℃냉장고에 보관하였으며 미생물 생육억제 시험 48시간 전에 세균류는 Nutrient broth배지 (Difco BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)에 그리고 진균류는 YPD broth배지 (Difco BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)에 각각 재배양하여 시험에 사용하였다.
- 항균 활성 시험에 사용한 균주는 농촌진흥청 농업유전자원 센터의 KACC (Korean Agricultural Culture Collection (RDA-Genebank Information Center, Jeonju, Korea)로부터 분양받은 미생물을 사용하였는데 그람양성 세균으로는 Staphylococcus aureus (S. aureus, KACC 10768)를 그람음성 세균으로는 Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa, KACC 10185)을 그리고 항진균 활성에는 효모류인 Candida albicans (C. albicans KACC 30003)를 사용하였으며 세균류의 배양용 배지는 Nutrient agar배지 (Difco BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)를 진균류의 배양용 배지는 YPD배지 (Difco BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)를 사용하였다. 시험균주들은 각각의 배지에 접종하여 30℃에서 2-3일간 배양한 다음 5℃냉장고에 보관하였으며 미생물 생육억제 시험 48시간 전에 세균류는 Nutrient broth배지 (Difco BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)에 그리고 진균류는 YPD broth배지 (Difco BD Diagnostics, Sparks, MD, USA)에 각각 재배양하여 시험에 사용하였다.
성능/효과
- 2종의 세균, S. aureus, P. aeruginosa에 대해서 동시에 90%이상의 생육억제 효과를 나타낸 식물 중에서 노박덩굴 (Celastrus orbiculatus)의 잎, 대황 (Rheum undulatum)의 지상부, 누린내풀 (Caryopteris divaricata)의 지상부, 그리고 C. albicans에 생육억제 효과를 나타낸 식물중에서 좀꽝꽝나무 (Ilex crenata var. microphylla)의 잎, 등칡 (Aristolochia manshuriensis)의 줄기, 병풍취 (Cacalia firma)의 지상부, 너도밤나무 (Fagus crenata var. multinervis)의 잎, 호밀(Secale cereale)의 전체부위, 사과나무 (Malus pumila var. dulcissima)의 줄기 등은 한약재에 비해서 가격이 싸고 비교적재배가 쉬우며 생체량이 많고 산야에서 쉽게 자랄 수 있는 종류로 이들 추출물 재료에 대한 경제성은 충분히 확보될 수 있을 것으로 여겨진다.
- S. aureus에 대하여 positive control 대비, 90%이상의 생육 억제 효과를 나타낸 식물추출물은 노박덩굴 (Celastrus orbiculatus)의 잎부위, 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi)의 뿌리, 대황 (Rheum undulatum Linne)의 지상부, 누린내풀 (Caryopteris divaricata)의 지상부 부위를 비롯한 4종이었으며 P. aeruginosa에 대해서는 내장단풍 (Acer palmatum var. nakaii)의 잎부위 추출물을 비롯한 38종으로 나타났다(Table 2).
- S. aureus와 P. aeruginosa에 대해서 동시에 90%이상의 생육억제 효과를 나타낸 식물추출물은 노박덩굴 (Celastrus orbiculatus)의 잎, 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi) 뿌리, 대황 (Rheum undulatum Linne) 지상부, 누린내풀 (Caryopteris divaricata) 지상부 부위로 나타나 (Table 2) 이들 추출물들은 앞으로 항세균제 용도로 활용성이 높을 것으로 생각된다.
- 다만 본 연구에서 황금 (Scutellaria baicalensis)의 메탄올 조추출물은 Staphylococcus aureus와 Pseudomonas aeruginosa에 대해서 생육억제 효과가 나타났으나 Candida albicans에 대해서는 억제효과가 나타나지 않았다.
- parahaemolyticus에 대하여 강한 항균 활성이 보고하였다. 본 연구에서는 지유(Sanguisorba officinalis) 메탄올 추출물이 S. aureus에 대해서 생육억제효과가 없는 것으로 나타났는데 Doh (2010)의 연구에서는 사용된 추출물 농도가 5% 희석농도임에 비해서 본 연구에서 사용된 지유(Sanguisorba officinalis) 메탄올 추출물 희석농도는 Doh (2010)의 연구에 비해서 1/10의 낮은 농도 (0.5%)로 사용되어 생육억제 효과가 나타나지 않은 것으로 판단된다.
- 사람에게 구내염과 질염 등 칸디다증을 유발하는 진균류인 Candida albicans에 대해서 60%이상의 생육억제효과를 나타낸 추출물은 좀꽝꽝나무 (Ilex crenata var. microphylla) 잎, 등칡 (Aristolochia manshuriensis) 줄기, 병풍취 (Cacalia firma) 지상부, 층층나무 (Cornus controversa) 과병, 너도밤나무 (Fagus crenata var. multinervis) 잎, 호밀 (Secale cereale) 전초, 등나무 (Wisteria floribunda) 충낭, 가침박달나무 (Exochorda serratifolia) 줄기, 사과나무 (Malus pumila var. dulcissima) 줄기, 쉬나무 (Evodia daniellii) 잎부위 등 10종으로 나타났다.
- 특히 너도밤나무 (Fagus crenata var. multinervis)의 잎부위 추출물은 90%이상의 증식억제효과를 나타내어 가장 높은 억제효과를 나타내었고 사과나무 (Malus pumila var. dulcissima)의 경우 줄기부위 추출물은 생육억제효과를 나타내었으나 잎부위에서의 추출물은 억제효과가 나타나지 않아 식물체 부위별로 뚜렷한 차이가 나타났다.
후속연구
- Ham 등(2013)에 따르면 S. aureus에 효과적인 항균작용을 나타내는 식물은 탱자나무 (Poncirus trifoliata)의 ethanol 추출물, 홍화 (Carthamus tinctorius)의 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 추출물이라 보고하였는데 본 연구에 사용된 탱자나무 (Poncirus trifoliata)의 methanol 추출물에서는 활성이 나타나지 않았는데 추후 재검토가 필요하다.
- Seong (2006)의 연구에서는 백작약 (Paeonia japonica)의 dichloromethane추출물과 methanol추출물이 C. albicans에 대하여 높은 수준의 항진균 활성을 나타내었고 물 추출물은 항균 활성이 없었고 methanol 추출물보다 dichloromethane 추출물의 항균활성이 높았다고 보고하였는데 본 연구에서 사용된 작약 (Paeonia japonica)에서는 생육억제 효과가 나타나지 않아 Paeonia 근연종간에서 항균활성에 대한 차이점이 실제로 존재하는지는 좀 더 연구가 진행되어야 할 것 같다.
- 본 연구에서는 10종의 식물추출물이 C. albicans에 대하여 상당한 수준의 항진균 활성을 나타내므로 앞으로의 연구를 통하여 사람에 대한 안전성 여부가 규명된다면 화장품에 첨가할수 있는 천연 항진균성 보존제의 소재로 사용될 가능성이 있다고 생각된다.
- 본 연구에서는 Cho 등 (2008)의 연구에서 사용된 3종 식물 추출물에 대한 미생물 생육억제실험이 진행되어 않아 직접적인 비교가 어려우나 본 연구에서 생육억제활성이 나타난 식물 추출물을 조합하여 비교 실험할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- 앞으로 이들 추출물들에 대한 인체 독성의 안전성 실험이 밝혀진다면 화장품첨가용 천연보존제 혹은 다양한 세균 및 진균의 감염에 의해서 유발되는 여러 감염성질환의 치료 및 병원내 감염을 예방하는 천연항균 대체 물질로서 다양하게 사용될 가능성이 있을 것으로 생각되며 앞으로 식물 기원의 천연 살균 물질을 연구하는 연구자에게 이 연구가 참고 자료가 되었으면 한다.
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