To prevent and treat the osteoporotic fracture, more attention should be paid in old age patients. Osteoclast which has ability to bone resorption is originated from hematopoietic cell line and plays a key role osteoporotic bone loss. Rubi Fructus has been widely used in Oriental medicine. Extracts ...
To prevent and treat the osteoporotic fracture, more attention should be paid in old age patients. Osteoclast which has ability to bone resorption is originated from hematopoietic cell line and plays a key role osteoporotic bone loss. Rubi Fructus has been widely used in Oriental medicine. Extracts of the leaves and fruit of Rubus species have been used in various countries as natural remedies to treat diabetes, infections, colic, and burns. However, the effect of extract of Rubi Fructus (fruit of Rubus coreanus Miq.) in osteoclast differentiation remains unknown. Thus, we evaluated the effect of Rubi Fructus on receptor activator of nuclear factor-kB ligand (RANKL)-induced osteoclast differentiation. Here we found that Rubi Fructus significantly inhibited osteoclast differentiation induced by RANKL. Rubi Fructus suppressed the activation of p38 pathway and NFkB in bone marrow macrophages (BMMs) treated with RANKL. Also, Rubi Fructus significantly inhibited the mRNA expression of c-Fos, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), osteoclast-associated receptor (OSCAR), nuclear factor of activated T cells (NFAT)c1 and cathepsin K in BMMs treated with RANKL. Particularly, Rubi Fructus greatly inhibited the protein expression of c-fos and NFATc1. especially in the case of NFATc1 expression, a master transcription factor of the differentiation of osteoclasts is very important step for osteoclastogenesis. Taken together, our results demonstrated that Rubi Fructus may be useful treatment option of bone-related disease such as osteoporosis and rheumatoid arthritis.
To prevent and treat the osteoporotic fracture, more attention should be paid in old age patients. Osteoclast which has ability to bone resorption is originated from hematopoietic cell line and plays a key role osteoporotic bone loss. Rubi Fructus has been widely used in Oriental medicine. Extracts of the leaves and fruit of Rubus species have been used in various countries as natural remedies to treat diabetes, infections, colic, and burns. However, the effect of extract of Rubi Fructus (fruit of Rubus coreanus Miq.) in osteoclast differentiation remains unknown. Thus, we evaluated the effect of Rubi Fructus on receptor activator of nuclear factor-kB ligand (RANKL)-induced osteoclast differentiation. Here we found that Rubi Fructus significantly inhibited osteoclast differentiation induced by RANKL. Rubi Fructus suppressed the activation of p38 pathway and NFkB in bone marrow macrophages (BMMs) treated with RANKL. Also, Rubi Fructus significantly inhibited the mRNA expression of c-Fos, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), osteoclast-associated receptor (OSCAR), nuclear factor of activated T cells (NFAT)c1 and cathepsin K in BMMs treated with RANKL. Particularly, Rubi Fructus greatly inhibited the protein expression of c-fos and NFATc1. especially in the case of NFATc1 expression, a master transcription factor of the differentiation of osteoclasts is very important step for osteoclastogenesis. Taken together, our results demonstrated that Rubi Fructus may be useful treatment option of bone-related disease such as osteoporosis and rheumatoid arthritis.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
국내에서나 해외에서 복분자를 이용한 파골세포 분화에 관한 연구는 아직까지 보고된 바가 없으며 기존에 보고된 조골세포의 기능을 향상시키는 작용보다 파골세포 분화 억제 기능이 골다공증의 치료에 효과적일 수 있기 때문에 본 연구를 진행하였다.
RANKL에 의해 발현되는 c-Fos는 NFATc1의 발현을 유도한다. 따라서 본 저자는 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현에 복분자 추출물의 효과를 검증하기 위하여 western blotting을 시행하였다. RANKL을 처리한 후 12시간과 24시간에서 c-Fos의 단백 발현이 유의하게 증가되었으며, NFATc1의 발현은 48시간에 증가되었다.
. 본 저자는 RANKL에 의해 유도되는 여러 가지 유전자 발현에 복분자 추출물이 미치는 효과를 실험하였다. RANKL로 파골세포 분화를 자극한 파골세포에서 c-Fos, NFATc1등의 주요 전사 인자의 발현이 증가하였고, 또한 TRAP, OSCAR, Catheps K의 발현도 증가하였으나, RANKL과 복분자 추출물을 동시에 처리한 실험군에서는 파골세포 분화에 중요한 주요 유전자 등의 발현이 억제 되었다(Fig.
파골세포는 골 흡수 작용을 하는 세포로서 파골세포 분화의 억제는 골 흡수 억제를 나타낸다. 본 저자는 복분자 추출물이 파골세포의 분화에 미치는 영향을 알아보고자 실험을 시행하였다. 복분자의 효과를 검증하기 위해 대식세포에 M-CSF와 RANKL을 첨가하고 복분자 추출물을 농도별로 처리하여 4일간 배양하였다.
천연물인 복분자 추출물은 세포의 독성 없이 파골세포의 분화를 억제시켰다. 이는 파골세포 분화의 주요 경로를 억제하여 나타나는 것으로 부작용 없는 골다공증 치료제가 필요한 상황에서 복분자가 좋은 후보 물질이 될 수 있는 가능성을 제시하였다. 특히 복분자는 국내에서 흔하게 접하는 후보 물질로서 유용성을 더욱 입증하여 산업화 하는 데에도 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
저자는 복분자 추출물에 의한 파골세포 분화 억제 작용기전을 규명하기 위해 RANKL에 의해 전달되는 주요 신호전달체계에 복분자 추출물이 미치는 영향을 실험하였다. 대식세포를 복분자 추출물로 전 처리 하고 RANKL을 시간별로 처리한 다음 MAPKs의 인산화를 측정하였다.
제안 방법
분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF (30 ng/ml)가 포함된 α-minimum essential medium (α-MEM)배지 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 대식세포 (bone marrow macrophage, BMM)로 사용하여 실험하였다. 대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL (50 ng/ml)을 처리하여 배양하면서 복분자 추출물을 대식세포에 농도별로 각각 0.
5주령 ICR 생쥐를 경추 탈골법으로 희생시킨 후 대퇴골과 경골을 분리하고 1 ml 주사기를 이용하여 뼈의 속질을 수세하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF (30 ng/ml)가 포함된 α-minimum essential medium (α-MEM)배지 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 에서 3일간 배양하였다.
그라고 1차 항체 및 2차 항체를 처리했다. TBS-T 완충용액으로 PVDF막을 세척하여 enhanced chemiluminescence를 이용해 단백질 발현을 관찰했다.
각각의 세포에서 TRIzol (Invitrogen) 용액으로 제조사의 방법에 따라 RNA를 분리한 후 분리한 RNA 1 μg은 oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor와 Superscript II reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 합성하였다.
3일 후, 부착된 세포를 대식세포 (bone marrow macrophage, BMM)로 사용하여 실험하였다. 대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL (50 ng/ml)을 처리하여 배양하면서 복분자 추출물을 대식세포에 농도별로 각각 0.5, 1, 10 micro-liter 처리하였다. 배양 4일 후, 배양한 세포를 TRAP 용액 (Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포를 성숙된 파골세포로 간주하고 숫자를 세었다.
저자는 복분자 추출물에 의한 파골세포 분화 억제 작용기전을 규명하기 위해 RANKL에 의해 전달되는 주요 신호전달체계에 복분자 추출물이 미치는 영향을 실험하였다. 대식세포를 복분자 추출물로 전 처리 하고 RANKL을 시간별로 처리한 다음 MAPKs의 인산화를 측정하였다. RANKL에 의해 자극된 파골세포에서 p38, JNK, ERK의 증가가 관찰되었으나 복분자 추출물 군에서 p38의 발현이 감소하였고 I-κB의 발현이 지속되었다.
5, 1, 10 micro-liter 처리하였다. 배양 4일 후, 배양한 세포를 TRAP 용액 (Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포를 성숙된 파골세포로 간주하고 숫자를 세었다.
1B). 복분자 추출물에 의한 TRAP 양성 파골 세포 분화의 억제가 세포독성과 관련 있는지 규명하기 위해 MTT 검사를 실시하였다. 다핵성 파골세포로의 분화를 억제하는 농도의 복분자 추출물은 세포의 독성을 나타내지 않았다(Fig.
본 저자는 복분자 추출물이 파골세포의 분화에 미치는 영향을 알아보고자 실험을 시행하였다. 복분자의 효과를 검증하기 위해 대식세포에 M-CSF와 RANKL을 첨가하고 복분자 추출물을 농도별로 처리하여 4일간 배양하였다. 복분자 추출물을 처리하지 않은 대조군은 TRAP 양성 다핵성 파골세포로 분화 되었지만 복분자 추출물을 처리한 실험군은 복분자 추출물 농도가 증가함에 따라 TRAP 양성 다핵성 파골세포로의 분화가 억제되었고(Fig.
분리된 단백질은 PVDF 막 (Amersham Biosciences)으로 옮기고 PVDF 막은 5% non-fat dry milk를 처리하여 비 특이 단백질이 붙는 것을 방지하기 하였다. 그라고 1차 항체 및 2차 항체를 처리했다.
대상 데이터
복분자를 물로 추출하여 감압 농축한 후 72시간 동안 동결건조하여 얻었다. Human RANKL과 M-CSF는 Peprotech (London, UK)사에서 구입하였고, XTT assay kit는 Roche (Indianapolis, IN, USA)사에서 구입하였다. Phospho (p)-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38, I-κB 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)사의 제품을 사용하였다.
Phospho (p)-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38, I-κB 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)사의 제품을 사용하였다.
Phospho (p)-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38, I-κB 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)사의 제품을 사용하였다. c-Fos 와 NFATc1 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사에서 구입하였다.
데이터처리
정량적인 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다. 통계적인 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.
통계적인 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.05이하인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하여 별표(*)로 표시하였다.
성능/효과
본 저자는 RANKL에 의해 유도되는 여러 가지 유전자 발현에 복분자 추출물이 미치는 효과를 실험하였다. RANKL로 파골세포 분화를 자극한 파골세포에서 c-Fos, NFATc1등의 주요 전사 인자의 발현이 증가하였고, 또한 TRAP, OSCAR, Catheps K의 발현도 증가하였으나, RANKL과 복분자 추출물을 동시에 처리한 실험군에서는 파골세포 분화에 중요한 주요 유전자 등의 발현이 억제 되었다(Fig. 2).
RANKL에 의해 자극된 파골세포에서 p38, JNK, ERK의 증가가 관찰되었으나 복분자 추출물 군에서 p38의 발현이 감소하였고 I-κB의 발현이 지속되었다.
따라서 본 저자는 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현에 복분자 추출물의 효과를 검증하기 위하여 western blotting을 시행하였다. RANKL을 처리한 후 12시간과 24시간에서 c-Fos의 단백 발현이 유의하게 증가되었으며, NFATc1의 발현은 48시간에 증가되었다. 그러나 복분자 추출물을 처리한 실험군에서는 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현이 현저히 억제 되었다(Fig.
RANKL을 처리한 후 12시간과 24시간에서 c-Fos의 단백 발현이 유의하게 증가되었으며, NFATc1의 발현은 48시간에 증가되었다. 그러나 복분자 추출물을 처리한 실험군에서는 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현이 현저히 억제 되었다(Fig. 3).
또한 이러한 c-fos, NFATc1등 전사인자의 발현 이전에 신호 전달 체계인 mitogen-activated protein kinase (MAPK)의 활성을 실험하여 복분자 추출물이 p38의 발현이 감소시키고, I-κB의 발현이 지속시킴을 확인하였다.
복분자의 효과를 검증하기 위해 대식세포에 M-CSF와 RANKL을 첨가하고 복분자 추출물을 농도별로 처리하여 4일간 배양하였다. 복분자 추출물을 처리하지 않은 대조군은 TRAP 양성 다핵성 파골세포로 분화 되었지만 복분자 추출물을 처리한 실험군은 복분자 추출물 농도가 증가함에 따라 TRAP 양성 다핵성 파골세포로의 분화가 억제되었고(Fig. 1A), 성숙한 파골세포의 숫자도 의미있게 억제 되었다(Fig. 1B). 복분자 추출물에 의한 TRAP 양성 파골 세포 분화의 억제가 세포독성과 관련 있는지 규명하기 위해 MTT 검사를 실시하였다.
하지만 부작용에 대한 결과가 축적되지 않았고 사용시 비용이 문제점으로 남아있다. 복분자 추출물이 RANKL 자극에 의한 파골세포 분화의 신호전달에 c-fos, nuclear factor of activated T cells (NFAT)c1의 전사인자의 발현이 억제 하였는데 이는 복분자가 파골세포 분화의 핵심 기전을 억제하는 작용이 있음을 의미한다. 또한 이러한 c-fos, NFATc1등 전사인자의 발현 이전에 신호 전달 체계인 mitogen-activated protein kinase (MAPK)의 활성을 실험하여 복분자 추출물이 p38의 발현이 감소시키고, I-κB의 발현이 지속시킴을 확인하였다.
종합적으로 본 실험을 통해 복분자가 골 흡수 역할을 담당하는 파골세포의 분화을 억제하는데 p38 경로와 I-κB의 지속 발현을 통하여 파골세포 분화에 핵심적인 NFATc1 의 발현을 억제하고 골 흡수 기능을 억제함을 알 수 있었다. 본 실험과 더불어서 향후 파골세포의 분화뿐 아니라 파골세포의 생존과 전구 세포의 융합에 미치는 복분자의 역할을 명확히 규명하기 위한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
파골세포는 조혈모세포에서 기원하여 단핵구/대식세포의 과정을 거쳐 세포 끼리 융합을 통해 성숙한 파골세포로 분화되어 골 흡수 가능을 수행하는데, 본 연구 결과에서 복분자가 파골 세포 분화 억제 작용을 통해 골 흡수를 억제하여 골다공증의 예방 및 치료에 응용될 수 있는 물질로서의 가능성을 보여주었다. 특히 파골세포 분화에는 receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)에 의한 세포 자극이 필수적으로 알려져 있다.
후속연구
종합적으로 본 실험을 통해 복분자가 골 흡수 역할을 담당하는 파골세포의 분화을 억제하는데 p38 경로와 I-κB의 지속 발현을 통하여 파골세포 분화에 핵심적인 NFATc1 의 발현을 억제하고 골 흡수 기능을 억제함을 알 수 있었다. 본 실험과 더불어서 향후 파골세포의 분화뿐 아니라 파골세포의 생존과 전구 세포의 융합에 미치는 복분자의 역할을 명확히 규명하기 위한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
이는 파골세포 분화의 주요 경로를 억제하여 나타나는 것으로 부작용 없는 골다공증 치료제가 필요한 상황에서 복분자가 좋은 후보 물질이 될 수 있는 가능성을 제시하였다. 특히 복분자는 국내에서 흔하게 접하는 후보 물질로서 유용성을 더욱 입증하여 산업화 하는 데에도 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
골다공증에 가장 많이 사용되고 있는 약제는?
최근 칼슘이 포함된 영양제를 복용하는 폐경 후 환자가 많으나 칼슘의 복용만으로는 저하된 골밀도의 증가를 기대하기는 어렵다4). 그러므로 골다공증이 생겨 골절의 위험이 높은 환자들에게 골밀도를 올릴 수 있는 전문적인 약물 치료가 필요하며 이 중 가장 많이 임상에서 사용되고 있는 약제가 Bisphosphonate 계열의 약물이다.
골다공증의 치료 물질로 복분자가 가능성이 있는 이유는?
골 관련 연구에서 복분자 성분이 조골세포의 기능을 증가시키고 파골세포의 세포 사멸을 유도한다는 보고가 있어 복분자가 골다공증에 유익한 역할을 할 수 있는 가능성을 확인하였다11). 세포 사멸 유도 작용과는 별개로 파골세포 분화 억제 작용은 골다공증 연구에 매우 중요한데, 이러한 여러 가지 효과를 가지고 있는 복분자의 추출물을 골다공증의 치료에 응용할 수 있는지의 여부 및 관련 기전을 알기 위해 저자 등은 파골세포의 분화에 미치는 복분자의 영향을 실험하였다.
골다공증성 골절의 특징은?
골다공증에 의한 골절은 인구의 고령화가 진행 되면서 사회 문제화 되고 있다. 골다공증성 골절은 통증뿐만이 아니라 운동의 제한을 가져와 삶의 질을 현저히 저하시키므로 예방이 중요하며 폐경이후 여성에서 골다공증이 있을 경우 골절을 경험하는 확률이 높다1). 특히 고관절의 골절은 골절이후 사망률이 증가하므로 고령의 환자에서는 미끄러지거나 넘어지지 않도록 주의하여야 한다2).
참고문헌 (20)
Melton, L.J.3rd, Atkinson, E.J., O'Connor, M.K., et al. Bone density and fracture risk in men. J Bone Miner Res 13: 1915, 1998.
Lata, P.F., Elliott, M.E. Patient assessment in the diagnosis, prevention, and treatment of osteoporosis. Nutr Clin Pract 22(3):261-275, 2007.
Nishikawa, M., Akatsu, T., Katayama, Y., Yasutomo, Y., Kado, S., Kugal, N., Yamamoto, M., Nagata, N. Bisphosphonates act on osteoblastic cells and inhibit osteoclast formation in mouse marrow cultures. Bone 18: 9-14, 1996.
Kwak, H.B., Kim, J.H., Kim, D.J., Kwon, Y.M., Oh, J., Kim, Y.K. Effect of water extract of deer antler in osteoclast differentiation. Korean J Oriental Physiology & pathology. 22: 891-895, 2008.
Shin, T.Y., Kim, S.H., Lee, E.S., Eom, D.O., Kim, H.M. Action of Rubus coreanus extract on systemic and local anaphylaxis. Phytother Res. 16(6):508-513, 2002.
Do, S.H., Lee, J.W., Jeong, W.I., Chung, J.Y., Park, S.J., Hong, I.H., Jeon, S.K., Lee, I.S., Jeong, K.S. Bone-protecting effect of Rubus coreanus by dual regulation of osteoblasts and osteoclasts. Menopause. 15(1):676-683, 2008.
Galibert, L., Tometsko, M.E., Anderson, D.M., Cosman, D., Dougall, W.C. The involvement of multiple tumor necrosis factor receptor (TNFR)-associated factors in the signaling echanisms of receptor activator of NF- $\kappa{B}$ , a member of the TNFR superfamily. J. Biol. Chem. 273: 34120-34127, 1998.
Korczowska, I., Olewicz-Gawlik, A. Does low-dose and short-term glucocorticoids treatment increase the risk of osteoporosis in rheumatoid arthritis female patients Clin Rheumatol. 27(5):565-572, 2008.
Park, J.H., Oh, S.M., Lim, S.S., et al. Induction of heme oxygenase-1 mediates the anti-inflammatory effects of the ethanol extract of Rubus coreanus in murine macrophages. Biochem Biophys Res Commun. 351: 146-152, 2006.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.