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문제 정의
- , 2015). 본 연구에서는 감태의 EtOAc 분획 추출물과의 병용에 의한 ciprofloxacin의 E. faecalis에 대한 항균활성의 synergy 효과를 FIC assay로 평가하였다. Table 6에 나타난 것과 같이 감태 EtOAc 분획 추출물(8 µg/mL)을 병용 사용하였을 때 0.
- , 2011). 이에 본 연구에서는 ciprofloxacin과 감태 EtOAC 분획 추출물 간의 병용에 의한 항생제 항균활성의 synergy 효과에 대한 연구를 진행 하였다.
- , 2015). 이에 본 연구에서는 갈조류, 녹조류, 홍조류를 포함한 해조류 추출물의 주요 식중독 원인균인 E. faecalis에 대한 항균 활성과 항생제에 대한 내성을 가지고 있는 E. faecalis균들에 대한 해조류 추출물의 첨가에 의한 기존 항생제의 항균력 회복에 대한 연구를 하였다.
- , 2015). 이에 본 연구에서도 disc diffusion assay와 MIC assay를 통해 E. faecalis에 대한 강한 항균 효과를 가지고 감태의 EtOAC 분획 추출물과 항생제간의 병용에 의한 antibacterial synergy effect에 대한 연구를 진행하였다. 이를 위하여 먼저 E.
제안 방법
- Disc diffusion assay를 이용하여 E. faecalis에 대한 15종의 해조류 MeOH 추출물의 항균활성을 검토하였다. Table 1에 나타낸 것처럼, 갈조류 추출물이 홍조류나 녹조류 추출물 보다 항균활성이 상대적으로 좋았으며 이는 해조류 추출물의 식중독 세균 및 병원성 세균에 대한 항균활성에 대해 연구한 Eom et al.
- E. faecalis 표준균주 및 분리균주의 항생제 감수성 실험은 BBL™ Sensi-Disc™ Susceptibility Test Discs (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 실시하였다.
- 각각의 분획물은 진공상태인 45°C에서 진공회전농축기(Eyela Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 증발시켰다.
대상 데이터
- 해조류 추출물 및 항생제의 항균활성은 정성분석법으로 disc diffusion assay에 따라 MHA 배지를 가지고 clear zone의 크기로 측정 하였고, 정량분석은 MHB 배지를 가지고 CLSI의 minimum inhibitory concentration(MIC) assay에 따라 측정 하였다(CLSI, 2008). E. faecalis에 대한 항생제의 MIC assay에 사용된 gentamicin과 ciprofloxacin은 Sigma-Aldrich사(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO)에서 구입하였다.
- The type bacterial strain used in this study was obtained from the Korean Collection for Type Cultures (KCTC) and clinical isolates were provided by the Gyeongsang National University Hospital. 1 Seaweed methanolic extracts (5 mg/disc) were loaded onto a disc (6 mm in diameter).
- The type bacterial strain used in this study was obtained from the Korean Collection for Type Cultures (KCTC) and clinical isolates were provided by the Gyeongsang National University Hospital. 1 Seaweed methanolic extracts (5 mg/disc) were loaded onto a disc (6 mm in diameter).
- ethyl acetate (EtOAc; 1.0 L×3), 그리고 n-butanol(BuOH; 1.0 L×3) 용액으로 분획하였다.
- 해조류는 건조된 상태의 제품을 시장에서 구입하여 물로 충분히 세척하여 탈염시킨 후 60°C에서 건조시켰다. 본 연구에 사용된 해조류는 감태(Ecklonia cava), 대황(Eisenia bicyclis), 고리매(Scytosiphon lomentaria), 미역(Undaria pinnatifida), 곰피 (Ecklonia stolonifera), 톳(Hitzikia fucales), 다시마(Laminaria japonica), 모자반(Sargassum fulvellum), 패(Ishige okamurae), 갈파래(Ulva lactuca), 구멍 갈파래(Ulva perutsa), 잎 파래(Enteromorpha linza), 청각(Codium fragile), 돌가사리(Chondracanthus tenellus) 및 부채 까막살(Carpopeltis prolifera) 등 15종이다. 건조 된 해조류는 분쇄기(HMF-1000A; Hanil Elec tronics, Seoul, Korea)를 통해 파우더 상태로 분쇄하였다.
- 본 연구에서 주 재료로 사용된 감태는 2013년 2월 제주 앞바다에서 채취된 감태를 구입하여 -80°C에서 냉동보관 중인 것을 사용하였다.
- 본 연구에서는 KCTC 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, Daejeon, Korea)에서 분양 받은 표준균주 E. faecalis KCTC 3206와 경상대학병원(Gyeongsang National University Hospital, Jinju, Gyeongnam, Korea)에서 분양 받은 7종의 분리균주(E. faecalis P107, P130, P227, P684, P690, P1499 및 P2088)를 사용하였다. 종균 배양을 위해서 tryptic soy broth (TSB; Difco, Detroit, MI)와 nutrient broth (NB; Difco)를 사용하였으며 disc diffusion assay는 Mueller Hinton agar(MHA; Difco)를 minimum inhibitory concentration(MIC) 측정에는 Mueller Hinton broth(MHB; Difco)를 사용하였다.
- 하지만, E. faecalis 균주들에 대한 gentamicin의 MIC 값은 gentamicin 의 MIC breakpoint value인 500-1,024 µg/mL 보다 모두 낮기 때문에 본 연구에서 사용된 분리균주들은 gentamicine 감수성 균주인 것으로 분석 되었다(Hällgren et al., 2011).
- 해조류는 건조된 상태의 제품을 시장에서 구입하여 물로 충분히 세척하여 탈염시킨 후 60°C에서 건조시켰다.
데이터처리
- 실험분석에서 얻어진 값은 SPSS 12.0(SPSS Inc., Chicago, IL)을 이용하여 통계분석 하였고 P<0.05의 유의수준에서 평가하였다.
이론/모형
- E. faecalis 균주들에 대한 두 항생제의 항균력을 MIC assay로 정량 분석하였다. 표준균주인 KCTC 3206 균주는 ciprofloxacin과 gentamicin에 대한 MIC 값이 각각 0.
- E. faecalis에 대한 해조류 추출물과 항생제간의 항균 시너지 효과는 fractional inhibitory concentration(FIC) assay(Hsieh et al., 1993; Meletiadis et al., 2010)를 이용한 checkerboard 방법으로 다음 방정식에 따라 계산 하였다.
- faecalis에 대한 강한 항균 효과를 가지고 감태의 EtOAC 분획 추출물과 항생제간의 병용에 의한 antibacterial synergy effect에 대한 연구를 진행하였다. 이를 위하여 먼저 E. faecalis 표준균주와 7종의 분리균주에 대하여 다양한 항생제에 대한 항생제 감수성을 disc diffusion assay을 통해 분석 하였다. 표준균주인 E.
- faecalis P107, P130, P227, P684, P690, P1499 및 P2088)를 사용하였다. 종균 배양을 위해서 tryptic soy broth (TSB; Difco, Detroit, MI)와 nutrient broth (NB; Difco)를 사용하였으며 disc diffusion assay는 Mueller Hinton agar(MHA; Difco)를 minimum inhibitory concentration(MIC) 측정에는 Mueller Hinton broth(MHB; Difco)를 사용하였다.
- 해조류 추출물 및 항생제의 항균활성은 정성분석법으로 disc diffusion assay에 따라 MHA 배지를 가지고 clear zone의 크기로 측정 하였고, 정량분석은 MHB 배지를 가지고 CLSI의 minimum inhibitory concentration(MIC) assay에 따라 측정 하였다(CLSI, 2008). E.
성능/효과
- faecalis KCTC 3206와 분리균주에 대해 가장 좋은 항균활성을 나타났다(Table 1). 5 mg의 감태 추출물이 본 연구에 사용된 8종의 E. faecalis 균주에 대해 10.5 mm-12.5 mm 의 clear zone을 형성하는 것으로 나타났으며, 이는 감태 MeOH추출물이 다른 해조류보다 E. faecalis에 대한 항균물질을 보다 많이 함유하고 있다는 것을 의미한다.
- E. faecalis에 대한 감태 추출물의 항균활성에 대한 후속 연구를 위해 유기용매를 이용하여 분획을 하였고, 여러 분획 추출물 중에서 EtOAc 분획 추출물이 disc diffusion assay에서 E. faecalis에 대해 가장 좋은 항균활성을 보였다(5 mg/disc: clear zone 14.0 mm-15.5 mm) (Table 2). 또한 MIC assay를 이용한 감태 추출물 및 분획물의 항균활성에 대한 정량 분석 결과도 disc diffusion assay의 결과와 마찬가지로 EtOAc 분획 추출물이 모든 E.
- faecalis 균주들의 증식을 억제할수 있었다. 결과적으로 ciprofloxacin을 단독 사용하였을 때 보다 8-32배 낮은 농도로 E. faecalis균의 생육을 억제할 수 있는 것으로 분석 되었다(P107, P227 및 P1499 균주의 경우 8 배; P684 균주의 경우 16배; P2088 균주의 경우 32배). 이러한 결과를 바탕으로 FIC value를 계산해 본 결과 ∑FICmin, ∑FICmax 및 ∑FIC 중간값이 각각 0.
- 또한 MIC assay를 이용한 감태 추출물 및 분획물의 항균활성에 대한 정량 분석 결과도 disc diffusion assay의 결과와 마찬가지로 EtOAc 분획 추출물이 모든 E. faecalis 균주에 대해 128 µg/mL로 가장 낮게 나타났다(Table 3).
- 본 연구 결과는 과거에 많이 검토 되었던 육상자원 유래의 생리활성물질에 관한 연구의 한계에서 벗어나 해양생물자원의 생리활성물질에 대한 검토로써 의미가 있으며 항생제가 아닌 천연물을 통해 주요 식중독 세균인 E. faecalis의 생육 억제뿐만 아니라 항생제 내성을 가지고 있는 multiple drug resistance E. faecalis에 대한 효과적인 제어 방법으로 감태 유래 추출물을 기존의 항생제와 병용 사용함으로써 항생제 남용에 따른 항생제 내성균의 출현 억제뿐만 아니라 잠재적인 치료제로도 이용될 수 있다는 것을 보여주었다. 이러한 결과는 식품 공정에서 E.
- (2015)의 연구 결과와도 일치하였다. 본 연구에 사용한 15종의 해조류 추출물 중에서 감태 MeOH 추출물이 E. faecalis KCTC 3206와 분리균주에 대해 가장 좋은 항균활성을 나타났다(Table 1). 5 mg의 감태 추출물이 본 연구에 사용된 8종의 E.
- 이러한 결과를 바탕으로 FIC value를 계산해 본 결과 ∑FICmin, ∑FICmax 및 ∑FIC 중간값이 각각 0.188, 0.508-0.563 및 0.266-0.344로 나타났다(Table 6).
- 표준균주인 KCTC 3206 균주는 ciprofloxacin과 gentamicin에 대한 MIC 값이 각각 0.0625 µg/mL과 0.125 µg/mL로 다른 분리균주들의 경우는 두 항생제에 대하여 4-64 µg/mL로 분석되었다(Table 5).
후속연구
- faecalis에 대한 효과적인 제어 방법으로 감태 유래 추출물을 기존의 항생제와 병용 사용함으로써 항생제 남용에 따른 항생제 내성균의 출현 억제뿐만 아니라 잠재적인 치료제로도 이용될 수 있다는 것을 보여주었다. 이러한 결과는 식품 공정에서 E. faecalis의 감염의 문제를 해결하는데 기여할 수 있을 것이라 생각되며 추후 정제과정 등을 거쳐 생리활성물질에 대해 더 심도 있는 연구를 진행하여 다양한 의약적 측면에서의 요구에 부응할 수 있을 것이라고 생각된다.
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