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문제 정의
- 본 연구에서는 전통 천연염색에서 주로 사용되어져온 천연염료 중에서 산화적 스트레스를 경감 소재로 활용할 수 있는지에 대한 기초연구를 수행하였으며, 폴리페놀성 색소화합물을 합유하고 있는 10종의 식물(소목, brazilein; 소리쟁이, emodin; 오배자, pyrogallol tannin; 황련, berberine+alkaloid; 황백, berberine; 천초근, pseudopurpurin;빈랑, tannin; 자근, shikonin; 울금, curcumin; 치자, crocin)로부터 열수추출물과 정유성분을 함유하고 있는 플로럴워터의 항산화 활성에 대한 가치와 유용성에 대한 연구를 수행하였다.
- 이 연구의 목적은 전통적으로 사용되고 있는 천연염색의 원료인 천연염료, 즉 천연색소의 열수추출물과 플로랄워터의 항산화 활성을 확인하는 것이다. 항산화 활성은 총 페놀함량 분석과 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능, 단일항산소 억제 효과로 확인하였다.
제안 방법
- 6×10-5 M DPPH를 methanol에 녹인 후, DPPH 라디칼 용액 900 μL와 시료 100 μL를 혼합한 후 5분간 반응시킨 후 분광광도계(UV-1800, Shimadzu)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 평가하였다.
- 다양한 천연색소 열수추출물에 대한 단일항산소 억제효과를 검증하기 위하여 광증감 반응(type-II photosensitization)에 의해 발생되는 단일항산소의 억제 효과를 분석하였다. 0.
- 시료의 농도별 DPPH 라디칼 소거능(전자공여능, %)을 도식화하여 전자공여능 50%일 때의 시료 농도를 50% inhibition concentration(IC50)로 나타내었다.
- 본 연구에서 사용되어진 원료 식물(소목, 소리쟁이, 오배자, 황련, 황백, 천초근, 빈랑, 자근, 울금, 치자)는 2014년 3월에 경북 영천시에서 구입하여 사용하였으며, 시료의 학명, 일반명 및 사용된 부위에 대해서는 Table 1에 나타내었다. 열수추출물과 플로럴워터 2종류의 시료를 준비하기 위하여 증류장치를 변형하여(Clevenger type apparatus) 건조된 시료 20 g에 2 L의 증류수를 넣고 3시간 동안 추출하였으며 이때 발생되는 증기를 플로럴워터 시료로 사용하였으며 남아 있는 추출액을 다시금 2 L로 부피를 맞춘 후 Whatman No. 2 여과지로 여과하여 고형분을 제거하고 동결건조하여 사용하였다. 실험에 사용된 용매 및 시약은 Dukan(GR grade), Sigma-Aldrich Co.
- 즉 시료 100 μL와 Folin-Ciocalteu 시약 50 μL, 20% Na2CO3 850 μL를 혼합한 후 2시간 동안 암실에서 보관한 후, 분광광도계(UV-1800 Shimadzu, Koyto, Japan)를 이용하여 765 nm에서 측정하였다.
- 즉 시료 100 μL와 Folin-Ciocalteu 시약 50 μL, 20% Na2CO3 850 μL를 혼합한 후 2시간 동안 암실에서 보관한 후, 분광광도계(UV-1800 Shimadzu, Koyto, Japan)를 이용하여 765 nm에서 측정하였다. 총 페놀 함량은 gallic acid를 이용하여 표준검량선을 작성하여 총 폴리페놀 함량을 시료 1 mg 중의 mg gallic acid로 계산하였다. Gallic acid의 농도는 10∼500 mg/mL가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 765 nm에서 흡광도를 평가하여 작성하였다.
대상 데이터
- 시료는 150 W halogen-lamp(Osram, Augsburg, Germany)로부터 백색광(λ>400 nm, 100 W/m-2)에 4분간 노출되어졌으며, 모든 분석은 25℃에서 이루어졌다. 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다.
- 본 연구에서 사용되어진 원료 식물(소목, 소리쟁이, 오배자, 황련, 황백, 천초근, 빈랑, 자근, 울금, 치자)는 2014년 3월에 경북 영천시에서 구입하여 사용하였으며, 시료의 학명, 일반명 및 사용된 부위에 대해서는 Table 1에 나타내었다. 열수추출물과 플로럴워터 2종류의 시료를 준비하기 위하여 증류장치를 변형하여(Clevenger type apparatus) 건조된 시료 20 g에 2 L의 증류수를 넣고 3시간 동안 추출하였으며 이때 발생되는 증기를 플로럴워터 시료로 사용하였으며 남아 있는 추출액을 다시금 2 L로 부피를 맞춘 후 Whatman No.
이론/모형
- ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) 라디칼 소거활성을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolorization assay 방법(12)에 의하여 측정하였는데, 7 mM ABTS와 2.4 mM potassium persulfate를 섞어 12시간 이상 암소에 방치하여 청록색의 ABTS 라디칼을 형성시켜 냉장 보관하였으며, radical stock solution은 734 nm에서 흡광도 값이 0.70(±0.02)이 되도록 에탄올로 희석하였다.
- Brand-Williams 등의 방법(11)에 따라 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성을 평가하였다. 6×10-5 M DPPH를 methanol에 녹인 후, DPPH 라디칼 용액 900 μL와 시료 100 μL를 혼합한 후 5분간 반응시킨 후 분광광도계(UV-1800, Shimadzu)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 평가하였다.
- Rose bengal(RB)의 광증감 반응에 의해 생성된 단일항산소를 측정하기 위하여 imidazole-RNO bleaching 방법(13)을 이용하였다. 단일항산소 분석은 2 μM rose bengal, 5 mM imidazole 그리고 4 μM RNO를 녹인 20 mM Tris-succinate buffer(pH 6.
- 추출된 시료의 총 폴리페놀 함량을 평가하기 위해 Folin-Ciocalteu법(10)을 이용하였다. 즉 시료 100 μL와 Folin-Ciocalteu 시약 50 μL, 20% Na2CO3 850 μL를 혼합한 후 2시간 동안 암실에서 보관한 후, 분광광도계(UV-1800 Shimadzu, Koyto, Japan)를 이용하여 765 nm에서 측정하였다.
성능/효과
- 다양한 천연색소 열수추출물에 대한 단일항산소 억제효과를 검증하기 위하여 광증감 반응(type-II photosensitization)에 의해 발생되는 단일항산소의 억제 효과를 분석하였다. 0.15 mg/mL 시료 처리에 따른 단일항산소 억제 효과는 Fig. 3에 나타내었는데, 단일항산소 억제 효과는 소목, 소리쟁이, 오배자, 빈랑에서 유의성을 보였으며 이러한 결과는 앞서 기술한 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능의 결과 유사하게 나타났다.
- 3가지 방법에 의해 얻어진 결과 동일하게 오배자, 소목, 소리쟁이, 빈랑 4종류의 천연색소 열수추출물에서 우수한 항산화 활성을 보이는 것으로 확인되었으며 특히 오배자는 ascorbic acid의 DPPH 라디칼 소거능 IC50(10.5 μg/mL)와 비교해 볼 때 매우 우수한 항산화활성을 나타내었다.
- 각 시료의 열수추출물의 TPC는 0.002∼0.3 mg GA/mg extract의 범위를 나타내었는데 그중 오배자 추출물(EE)이 0.3 mg GA/mg extract로 다른 색소 추출물에 비해 월등히 높은 수준으로 분석되었다.
- 5 μg/mL 만큼 높은 우수한 항산화력을 가지는 것을 확인하였다. 단일항산소 억제 효과 역시 오배자, 소목 추출물에서 각각 0.21, 0.12 mg/mL을 나타내어 높은 소거 활성을 띄는 것으로 강한 빛에 의해 야기되는 활성산소의 피해로부터 생물체를 보호해주는 것을 알 수 있었다. 총 페놀 함량도 열수추출물에서 높은 수준을 나타내었다.
- 총 페놀 함량도 열수추출물에서 높은 수준을 나타내었다. 반면, 플로라워터의 항산화 활성은 열수추출물 대비 미비한 효과를 보였으나 황련, 황벽천초근의 경우 열수추출물 보다 우수한 결과를 나타내었다. 플로라워터의 경우 액상시료를 첨가하여 수행되는 실험 방법에 의해 정량적 수치를 명확히 나타내기 어렵기 때문에 연구방법적 측면에서 개선이 필요할 것으로 판단된다.
- 1 mL) 처리시 DPPH 소거 활성은 빈랑에서 가장 우수한 결과가 나왔으며 그 다음으로 천초근, 황련, 황백, 소목의 순으로 열수추출물과는 다른 결과를 보였다. 비교 물질로 주로 사용되는 ascorbic acid 0.1 mg/mL 처리시와 비교해 볼때 오배자, 소목 열수추출물의 DPPH 라디칼 소거능력은 상당히 높은 수준의 항산화력을 가지는 것을 확인하였다.
- 항산화 활성은 총 페놀함량 분석과 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능, 단일항산소 억제 효과로 확인하였다. 열수추출물에서 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내는 IC50 값은 0.0085～3.5 mg/mL를 나타내어 일부 색소 추출물의 DPPH 소거 활성이 우수하다는 것을 알 수 있었다. 특히 오배자, 소목 추출물이 8.
- 이와 같이 ABTS 라디칼 탈색반응은 이미 생성된 자유라디칼의 제거 정도를 흡광도로 나타내어 ABTS 라디칼의 소거활성능을 측정하는 방법으로 ABTS 라디칼 탈색반응이 1분 안에 종료되므로 단시간 측정할 수 있고, 소수성과 친수성 모두에 적용 가능하다(17). 천연색소 열수추출물 및 플로럴워터의 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 Fig. 2에 나와 있는바와 같이, 열수추출물 (0.1 mg/mL) 및 10% 플로랄워터 (0.1 mL) 처리시의 ABTS 라디칼 소거능은 DPPH 소거능에서의 결과와 동일하게 오배자, 소목, 소리쟁이에서 가장 우수한 활성을 나타내는 것으로 확인이 되었다. 또한 DPPH 라디칼 저해 활성이 ABTS 라디칼 저해 활성보다 높게 나온 경향을 볼 수 있는데 이는 ABTS 라디칼이 DPPH 라디칼 보다 좀 더 강력한 산화물질이기 때문인 것으로 사료된다(18).
- DPPH는 화학적으로 안정화된 자유라디칼을 가지고 있는 물질로 ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는데, 이것은 다양한 천연 소재로부터 항산화물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다(16). 천연색소로부터 얻어진 열수추출물과 플로럴워터의 전자 공여능을 측정한 결과는 Fig. 1과 같은데, 색소 시료의 열수추출물 0.1 mg/mL 농도에서 DPPH 라디칼을 오배자 100%, 소목 100%, 소리쟁이 76.6%, 빈랑 63.8%, 천초근 33.4%, 황련 12.2%, 황백 7.2, 자근 7.2%를 소거하는 것으로 나타났으며, 10% 플로러워터 (0.1 mL) 처리시 DPPH 소거 활성은 빈랑에서 가장 우수한 결과가 나왔으며 그 다음으로 천초근, 황련, 황백, 소목의 순으로 열수추출물과는 다른 결과를 보였다. 비교 물질로 주로 사용되는 ascorbic acid 0.
- 12 mg/mL을 나타내어 높은 소거 활성을 띄는 것으로 강한 빛에 의해 야기되는 활성산소의 피해로부터 생물체를 보호해주는 것을 알 수 있었다. 총 페놀 함량도 열수추출물에서 높은 수준을 나타내었다. 반면, 플로라워터의 항산화 활성은 열수추출물 대비 미비한 효과를 보였으나 황련, 황벽천초근의 경우 열수추출물 보다 우수한 결과를 나타내었다.
- 특히 오배자, 소목 추출물이 8.5 μg/mL, 19.1 μg/mL로 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었는데, 비교 물질로 주로 사용되는 ascorbic acid의 10.5 μg/mL 만큼 높은 우수한 항산화력을 가지는 것을 확인하였다.
- 이 연구의 목적은 전통적으로 사용되고 있는 천연염색의 원료인 천연염료, 즉 천연색소의 열수추출물과 플로랄워터의 항산화 활성을 확인하는 것이다. 항산화 활성은 총 페놀함량 분석과 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능, 단일항산소 억제 효과로 확인하였다. 열수추출물에서 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내는 IC50 값은 0.
후속연구
- 플로라워터의 경우 액상시료를 첨가하여 수행되는 실험 방법에 의해 정량적 수치를 명확히 나타내기 어렵기 때문에 연구방법적 측면에서 개선이 필요할 것으로 판단된다. 결론적으로 일부 천연색소 추출물은 생물체의 산화적 스트레스로부터 야기되는 활성산소를 억제하는 중요한 역할을 하며, 보다 심도 깊은 연구를 진행한다면 새로운 생물 소재로 활용성이 높을 것으로 사료된다.
- 5 μg/mL)와 비교해 볼 때 매우 우수한 항산화활성을 나타내었다. 뿐만 아니라 빛에 의해 야기되는 단일항산소 소거능 결과로 보아 강한 광에 노출되었을 때 일어날 수 있는 생체기관의 광피해로부터 생명체를 보호하는 중요한 반응을 할 것이라고 판단한다. 향후 in vivo 실험 및 순물질 정제를 통해 심도 깊은 연구가 진행되어야 할 것으로 판단되며.
- 향후 in vivo 실험 및 순물질 정제를 통해 심도 깊은 연구가 진행되어야 할 것으로 판단되며. 식품산업, 향장산업 및 의약산업에 적용한다면 활용성이 높을 것으로 사료된다.
- 이러한 천연색소는 온도, 빛, 산화제, 환원제, 산도 및 보관성 등과 같은 요인에 의해 영향을 받을 수 있어 아직까지는 합성색소에 비해 산업적 적용성이 낮다고 할 수 있다. 일반적으로 천연에서 유래된 색소는 섬유 및 종이 염색에 사용하는 것으로 알고 있었으나 이들 색소성분의 다양한 기능성 및 안전성에 대한 연구를 통해 새로운 천연 항산화제로서의 가치 연구가 필요하다.
- 뿐만 아니라 빛에 의해 야기되는 단일항산소 소거능 결과로 보아 강한 광에 노출되었을 때 일어날 수 있는 생체기관의 광피해로부터 생명체를 보호하는 중요한 반응을 할 것이라고 판단한다. 향후 in vivo 실험 및 순물질 정제를 통해 심도 깊은 연구가 진행되어야 할 것으로 판단되며. 식품산업, 향장산업 및 의약산업에 적용한다면 활용성이 높을 것으로 사료된다.
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