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문제 정의
- 이렇듯 여러 방면에서 뛰어난 생리활성을 나타내는 천연소재들과 관련하여 개개의 성분에 대한 연구는 일부 추진되어 있으나, 이들로부터 분리한 색소 성분 및 복합물의 생리활성을 규명하기 위한 연구는 아직 부족한 실정이므로 본연구에서는 개별 천연색소 성분들과 이들을 혼합한 복합물의 생리활성 검증을 통해 혼합 사용시 활성의 변화 정도를 확인하고자 하였다.
가설 설정
- 2)Each value represents mean±SD (n=3).
- 2)Means with superscript (*) in the same sample are significantly different at p<0.01.
제안 방법
- α-Glucosidase 저해활성은 효소액을 첨가하지 않은 실험구의 흡광도 및 시료 무첨가구의 흡광도를 각각 측정하여 그 비로부터 저해활성을 산출하였으며, 이때 양성대조군으로 acarbose를 사용하였다.
- 양성 대조구로는 농도별로 희석한 acarbose를 사용하여 동일하게 실험하였다. 반응액은 540 nm에서 흡광도를 측정하고 대조군과 비교해 저해율(%)을 계산하였다.
- 선정된 3종 시료의 혼합물 4종(아선약+오배자, 아선약+정향, 오배자+정향, 아선약+오배자+정향)에 대해서는 콜레스테롤 흡착활성, COX-2 저해활성,α-glucosidase 및 α-amylase 저해활성을 측정하였다.
- 2 mL을 가하여 희석시켰다. 양성 대조구로는 농도별로 희석한 acarbose를 사용하여 동일하게 실험하였다. 반응액은 540 nm에서 흡광도를 측정하고 대조군과 비교해 저해율(%)을 계산하였다.
- 천연색소 7종에 대하여 in vitro상에서 혈행개선 효과를 검증하기 위하여 1 mg/mL의 농도에서 콜레스테롤 흡착활성과 COX-2 저해활성을 평가한 결과와 천연색소 분말 7종 중 항산화활성, 콜레스테롤 흡착활성 및 COX-2 저해활성측정 결과를 고려하여 그 활성이 우수하였던 아선약, 오배자, 정향을 선별하여 이들을 동량으로 혼합한 아선약+오배자, 아선약+정향, 오배자+정향, 아선약+오배자+정향 혼합물을 제조하여 콜레스테롤 흡착활성 및 COX-2 저해활성을 측정하여 Table 3에 나타내었다.
- 천연색소 추출물 및 혼합물의 콜레스테롤 흡착활성은Soh 등(23)의 방법을 응용하여 kit시약(AM 202-k, AsanPharm., Seoul, Korea)으로 측정하였다. 시료액 1 mL에 콜레스테롤(300 mg/dL) 50 μL를 가하여 25℃에서 20분간 반응시킨 후 0.
- 천연색소 혼합물의 생리활성을 검증하고자 하고자 천연색소 7종에 대하여 ABTS 라디칼 소거활성과 DPPH 라디칼 소거활성, 콜레스테롤 흡착활성 및 COX-2 저해활성을 측정하였으며, 활성이 우수하였던 시료 3종(아선약, 오배자,정향)을 선별하였다. 선정된 3종 시료의 혼합물 4종(아선약+오배자, 아선약+정향, 오배자+정향, 아선약+오배자+정향)에 대해서는 콜레스테롤 흡착활성, COX-2 저해활성,α-glucosidase 및 α-amylase 저해활성을 측정하였다.
- 천연식물 유래 색소 추출물 중 항산화활성, 콜레스테롤흡착능 및 COX-2 저해활성이 우수하였던 시료 3종(아선약,오배자, 정향)을 선별하여 각각의 α-glucosidase 저해활성과 이들 혼합물 4종(아선약+오배자, 아선약+정향, 오배자+정향, 아선약+오배자+정향)의 α-glucosidase 저해활성을 측정하였다(Table 5).
- 추출물을 제조하기 위하여 각각의 건조 시료 1 kg에 10 L의 물을 가한 후 catalase(BiotouchⓇCAT200, AB Enzymes, Rajamäki, Finland) 및 alcalase(AlacalaseⓇ,Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)를 1% 농도로 첨가하고 45℃에서 10시간 동안 반응시킨 다음 80℃로 조절된 추출기(Cosmos 660, Kyungseo, Incheon, Korea)를 이용하여 2시간동안 추출하였다.
대상 데이터
- 아카시아(Acacia, Robinia pseudoacacia L.), 코치닐(Cochineal, Dactylopius coccus costa), 아선약, 포도(Grape,Vitis vinifera L.)과피, 감(Persimmon, Diospyros kaki), 오배자 및 정향으로 부터 색소 성분을 추출 분리하여 사용하였다. 추출물을 제조하기 위하여 각각의 건조 시료 1 kg에 10 L의 물을 가한 후 catalase(BiotouchⓇCAT200, AB Enzymes, Rajamäki, Finland) 및 alcalase(AlacalaseⓇ,Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)를 1% 농도로 첨가하고 45℃에서 10시간 동안 반응시킨 다음 80℃로 조절된 추출기(Cosmos 660, Kyungseo, Incheon, Korea)를 이용하여 2시간동안 추출하였다.
- 이러한 차원에서 본 연구진은 천연색소 자원들을 소재로 하여 이들의 항산화, 소화효소 억제 활성 및 항비만 활성연구를 추진한 바 있으며(11,14) 선행연구를 통해 항산화 활성 및 항비만 활성이 상대적으로 우수한 천연색소 소재 7종을 선별하였다. 이들 소재 중 아선약(catechu, Uncaria gambir Roxburgh)은 국내에서는 영, 정조 이후부터 흑색을 물들이는 원료로 궁중에서 주로 사용하여 왔으며, 자외선, 산소, 효소 등에 의해 발색이 되는 특성이 있어 염색직물의변퇴 우려가 없는 천연염재로 각광을 받고 있고(15), 항균활성이 우수하며, 폴리페놀 성분들이 해독작용, 혈중 콜레스테롤 저하 및 항암 활성을 지니는 것으로 알려져 있다(14).
데이터처리
- COX-2 저해활성(%)은 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 평균±표준편차로 나타내었다.
- 각 시료군에 대한 유의차 검정은 분산분석을 한 후 p<0.05수준에서 Duncan's multiple test에 따라 분석하였다.
- 각 실험은 3회 반복 실험한 결과에 대하여 SPSS(14.0,SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 통계처리 하였으며, 각각의 시료에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- ABTS 라디칼 소거활성은 Re 등(21)의 방법에 따라 7mM의 ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.4 mM이 되도록 용해시킨 다음 암실에서 12~16시간 동안 반응시킨 후 증류수를 가하여 415 nm에서 흡광도가 1.5가 되도록 조정하여 사용하였다. ABTS 용액에 동량의 시료액을 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 다음 415 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- COX-2 저해활성은 COX inhibitor screening assay kit(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 측정하였다. 1.
- DPPH 라디칼 소거활성은 Blois(22)의 방법에 따라DPPH에 대한 전자공여 활성으로 나타내었다. 즉, 에탄올에 5 mg/100 mL의 농도로 용해한 DPPH 용액을 동량으로 혼합하여 충분히 교반한 다음 상온에서 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- α-Glucosidase 저해활성은 아선약 분말이 가장 높았고, 아선약이 첨가된 혼합물의 활성이 더 높았다.
- DPPH 라디칼 소거활성은, 최고농도인 125 μg/mL 농도에서도 9.34±0.53~79.62±0.66%로 그 절대값은 ABTS 라디칼 소거활성보다는 낮았으나, 아선약, 오배자, 정향 및 이들의 1:1 혼합물의 라디칼 소거활성이 여타시료에 비해 높아ABTS 라디칼 소거활성과 같은 경향이었고, 시료의 농도와 활성은 양의 상관관계를 나타내었다.
- 단일 시료군중 아선약의 α-glucosidase 저해활성이 가장 우수하였으며,아선약이 첨가된 혼합물도 70% 이상의 높은 저해활성을 나타내었다.
- 또한 혼합물 4종의 α-amylase 저해활성은 단일물의 활성보다 오히려 더 낮아 31.25 μg/mL 농도에서 2종류의 색소 분말을 혼합한 혼합물의 활성은 19.22±0.70~20.04± 2.32%였으나 3종을 모두 혼합하였을 때 활성은 17.63±1.76%였고, 62.5 μg/mL 농도에서는 16.99±0.95%로 활성이 더 낮았다.
- 모든 시료가 첨가 농도를 62.5 μg/mL로 하였을 때보다 더 낮은 농도인 31.25 μg/mL에서 활성이 더 높아 시료의 첨가농도와 활성이 비례관계에 있지 않았다.
- 본 연구에 사용된 천연색소 분말 7종을 1mg/mL 농도로 제조하여 COX-2 저해활성을 측정한 결과(Table 3) 아카시아 분말의 활성이 가장 낮아 41.73±3.39%였고, 여타 시료들의 활성은 49.73±2.68~57.45±2.38%로,이들 시료간에 유의적인 차이는 없었다.
- 시료 7종의 콜레스테롤 흡착활성은 13.19±1.50~82.40±0.95%의 범위였는데, 정향의 활성이 가장 높았고, 다음으로 아선약(66.71±0.21%), 아카시아(64.44±1.65%), 오배자(54.62±0.75%)의 순으로 활성이 높았다.
- 25 μg/mL 농도에서 90% 이상으로 높았다. 시료들을 서로 혼합함으로써 ABTS 라디칼 소거활성은 증가하였는데, 상대적으로 활성이 낮은 시료들끼리 혼합하였을 때는 그 활성의 증가폭이 적지만 활성이 높은 시료와 혼합할 때는 더 큰 폭으로 활성이 증가하였다. 즉, 31.
- 시료의 ABTS 라디칼 소거활성은 농도와 비례하여 증가하는 경향이었으며, 7종의 색소 시료 중 아선약, 오배자, 정향이 31.25 μg/mL의 농도에서 85% 이상으로 여타 시료에 비해 활성이 높았다.
- 시료의 농도가 높을수록 α-glucosidase 저해활성도 증가하였으며, 31.25 μg/mL 농도에서도 모든 시료의 활성은 65% 이상으로 양성 대조군으로 이용한 acarbose(57.82±0.48%) 보다 활성이 더 높았다.
- 아선약, 오배자 및 정향을 각각 1:1로 혼합한 아선약+오배자, 아선약+정향, 오배자+정향의ABTS 라디칼 소거활성은 31.25 μg/mL 농도에서 90% 이상으로 높았다.
- 아선약, 오배자, 정향과 이들의 혼합물을 31.25 μg/mL,62.5 μg/mL에서 α-amylase 저해활성을 측정한 결과(Table 4), 양성 대조군인 acarbose의 활성은 15.625 μg/mL의 농도에서도 43.14±2.18%로 우수하였으나 천연색소 분말 및 이들의 복합물의 활성은 2배 높은 농도에서도 25% 이하였다.
- 아선약, 오배자,정향 혼합물 4종에 대한 COX-2 저해활성은 58.63±3.11~62.25±2.74%의 범위였으며, 이들 혼합물간의 활성은 통계적인 유의차가 없었다.
- 아선약의 DPPH 라디칼 소거활성은 125 μg/mL 농도에서 78.64±0.90% 였는데, 활성이 유사한 범위인 오배자(77.70±0.26%)와 혼합하였을 때는 78.43±0.69%로 활성이 증가하지 않아 서로 활성의 증가에 대한 상승효과가 없었으나 활성이 낮은 코치닐(9.34±0.53%)과 혼합함으로써 혼합물의 활성은 코치닐 단독 사용시에 비해 약 7.1배 증가하였다.
- 66%로 그 절대값은 ABTS 라디칼 소거활성보다는 낮았으나, 아선약, 오배자, 정향 및 이들의 1:1 혼합물의 라디칼 소거활성이 여타시료에 비해 높아ABTS 라디칼 소거활성과 같은 경향이었고, 시료의 농도와 활성은 양의 상관관계를 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때본 연구에 사용된 천연색소 시료들은 유리 라디칼보다는 양이온 라디칼의 소거에 더 효과적인 것으로 판단된다. 아선약의 DPPH 라디칼 소거활성은 125 μg/mL 농도에서 78.
- 즉, 31.25 μg/mL 농도에서 활성이 11.30±0.64%로 낮은 코치닐의 경우 감(21.45±0.65%)과 혼합하였을 때 ABTS 라디칼 소거활성은 13.74±0.31% 였으나 아선약과 혼합하였을 때는 69.44±0.63%로 월등히 활성이 증가하여 혼합되는 시료에 따라 활성이 영향을 받음을 알 수 있었다.
- 선정된 3종 시료의 혼합물 4종(아선약+오배자, 아선약+정향, 오배자+정향, 아선약+오배자+정향)에 대해서는 콜레스테롤 흡착활성, COX-2 저해활성,α-glucosidase 및 α-amylase 저해활성을 측정하였다. 천연색소 시료들은 DPPH 라디칼 소거활성에 비해 ABTS 라디칼 소거활성이 더 우수하였으며, 콜레스테롤 흡착활성은 정향이 유의적으로 높았고, COX-2 저해활성은 아카시아 분말이 유의적으로 낮았으며, 여타 시료간에는 유의적인 활성의 차이가 없었다. α-Amylase 저해활성은 아선약과 오배자에서 높았으나, 혼합물들에서는 서로간에 유의적인 차이가 없었다.
- 70%로 세 가지 색소를 모두 혼합한 시료군 보다 15% 정도 활성이 더 낮았다. 콜레스테롤 흡착 활성이 우수한 정향이 첨가된 혼합물의 활성이 여타 혼합물에 비해 더 높아 정향이 혼합물 중에서 콜레스테롤 흡착활성 강화에 크게 기여하며 혼합물의 조성 조건에 따라서는 활성이 상이함을 알 수 있었다. 따라서 시료 단독으로 보다는 이들을 적절히 혼합하여 활용할 경우 생체 내 항산화, 혈행개선 등의 생리활성에서 시너지효과를 나타낼 수 있을 것으로 생각된다.
- 하지만 아선약과 오배자를 동량으로 혼합한 시료군의 활성은 57.85±1.70%로 세 가지 색소를 모두 혼합한 시료군 보다 15% 정도 활성이 더 낮았다.
- 혼합물의 콜레스테롤 흡착활성은 아선약+정향(76.65±0.36%)과 오배자+정향(75.81±0.55%) 혼합물이 75% 이상의 높은 활성을 나타내었으며,다음으로 세 가지 시료를 모두 혼합한 혼합물의 활성은 71.98±0.95%로 활성이 높았다.
후속연구
- 당뇨의 치료를 위해서 인슐린 분비 촉진제, 간에서의 포도당 신생합성 억제제, 인슐린감작제, 소화관에서 포도당 흡수 지연에 관여하는 α-glucosidase 저해제가 경구 혈당 강화제로 사용되고 있는데, α-glucosidase 저해제 중의 하나인 acarbose는 장기 복용 시 복부팽만감, 구토, 설사와 같은 부작용이 유발되기도 하므로(32,36), 천연에서 α-glucosidase 저해활성이 우수한 소재와 발굴은 지속적인 연구를 요하고 있는데, 본 연구에서 선발된 아선약, 오배자, 정향 및 이들의 혼합물은 모두 동일 농도의 acarbose에 비해 높은 α-glucosidase 저해 활성을 나타내므로 좋은 항당뇨 활성 소재로서 충분히 그 가치가 있을 것으로 사료된다.
- 콜레스테롤 흡착 활성이 우수한 정향이 첨가된 혼합물의 활성이 여타 혼합물에 비해 더 높아 정향이 혼합물 중에서 콜레스테롤 흡착활성 강화에 크게 기여하며 혼합물의 조성 조건에 따라서는 활성이 상이함을 알 수 있었다. 따라서 시료 단독으로 보다는 이들을 적절히 혼합하여 활용할 경우 생체 내 항산화, 혈행개선 등의 생리활성에서 시너지효과를 나타낼 수 있을 것으로 생각된다. Lee 등(31)은 홍마늘 추출물과 혼합물 2.
- α-Glucosidase 저해활성은 아선약 분말이 가장 높았고, 아선약이 첨가된 혼합물의 활성이 더 높았다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 천연색소의 생리활성은 혼합물로 조성하여 활용할 때 시너지 효과를 얻을 수 있으나, 조합되는 물질간의 상호작용에 따라 활성의 증감 정도는 상이하므로 이에 대해서는 앞으로 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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