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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 국내 근권 토양에서 효모의 생육을 억제하는 P. fluorescens BB2 균주를 분리하였고, 이 균이 생산하는 항생물질이 효모 Candida의 생육을 효과적으로 억제하며 이 항생물질이 Pseudomonas속 균에서는 아직까지 보고된 바 없는 단백질 성분의 새로운 항생물질임을 밝히고자 한다.
제안 방법
- 한편 ammonium sulfate 침전에 의한 항생물질 농축이 가능한 것은 이 물질이 단백질 성분으로 되어 있음을 보여주는데, 이를 확인하기 위하여 100°C에서 5분 이상 가열하면 효모 생육 억제능이 소실 되고, 단백질 분해효소 trypsin이나 chymotrypsin을 처리한 결과 24시간 내에 역시 소실됨을 알 수 있었다. Ammonium sulfate 처리를 통해 얻은 침전물에 포함된 항생물질의 분자량을 알아 보기 위하여 투석과 Vivaspin (Satorius)을 이용한 원심 분리, 그리고 SDS-PAGE를 실시하였다. MWCO 값이 12 kDa인 투석막을 이용하여 4°C에서 24시간 투석한 다음, 투석막 내부와 외부의 시료를 회전 농축하여 투석 전의 부피로 맞추고, C.
- MWCO 값이 12 kDa인 투석막을 이용하여 4°C에서 24시간 투석한 다음, 투석막 내부와 외부의 시료를 회전 농축하여 투석 전의 부피로 맞추고, C. albicans를 대상으로하여 이중 평판법에 의한 생육 억제 여부를 조사하였다.
- , 2006). N-butanol 추출을 통한 친수성 분획과 소수성 분획을 별도로 농축하였으며, 소수성 분획은 50% ethanol로 녹였고, 친수성 분획과 ammonium sulfate 처리를 통한 침전물은 증류수로 현탁하여 냉장 보관하면서 효모 생육 억제능을 조사하였다. YM 평판에 상기한 2가지 효모와 더불어서 Paffia rhodozyma 효모균, 그리고 그람 양성 세균인 Bacillus cereus ATCC 21366 를 도말한 다음, 농축한 3가지 시료 50 μl를 각각 paper disk에 가하여 생육 억제 여부를 비교한 결과(Fig.
- P. fluorescens BB2의 항생물질 생산을 위해 YM 액체배지에서 30°C, 240 rpm으로 진탕 배양을 하면서 배양시간 별로 균 생장 정도를 600 nm에서의 흡광도로 측정하였으며, 이중 평판법에 따라 한천 농도를 0.5%로하여 제조한 55°C의 1.5 ml YM 상층배지에 미리 전 배양한 C. albicans KCTC 7965 균액 100 μl를 섞어서 YM 평판배지에 붓고 8 mm stainless cylinder를 놓은 다음, 여기에 배양 상등액 50 μl를 가하여 24시간 배양한 후 나타나는 생육 억제환의 직경을 조사하여 Fig. 1과 같은 결과를 얻었다.
- 이 균주들의 항균능력을 보기 위하여 평판배지 중앙에 획선 접종을 하고 30°C에서 1일간 배양한 다음, 양쪽에 세균과 효모 균주들을 접종하고 다시 1일간 배양하면서 생육 억제 여부를 관찰하여 이 중에서 효모 Saccharomyces cerevisiae ATCC 26603과 Candida albicans KCTC 7965 균주의 생육을 효과적으로 억제하는 BB2 균주를 선발하였다.
- 우선 진균류의 생육을 억제하는 세균을 찾기 위해 충북 청주시 미원면의 배추밭에서 근권 토양을 채취하였다. 채취한 시료는 멸균한 0.85% NaCl 용액에 넣어 교반한 후 LB 평판배지(tryptone 1.0 g, yeast extract 0.5 g, NaCl 0.5 g, agar 1.5 g, D.W. 100 ml)와 YM 평판배지(yeast extract 0.3 g, malt extract 0.3 g, peptone 0.5 g, glucose 1.0 g, agar 1.5 g, D.W. 100 ml)에도 말하여 형태적으로 다른 8개의 균주를 순수분리하였다. 이 균주들의 항균능력을 보기 위하여 평판배지 중앙에 획선 접종을 하고 30°C에서 1일간 배양한 다음, 양쪽에 세균과 효모 균주들을 접종하고 다시 1일간 배양하면서 생육 억제 여부를 관찰하여 이 중에서 효모 Saccharomyces cerevisiae ATCC 26603과 Candida albicans KCTC 7965 균주의 생육을 효과적으로 억제하는 BB2 균주를 선발하였다.
- fluorescens BB2 균주가 생산하는 항생물질은 소수성을 띄는 단백질 성분이며 효모 균주들의 생육을 억제하는 특징을 보이는데, 이는 최근 관심을 모으고 있는 antimicrobial peptide (AMPs)에 속하는 것으로 생각된다 (Bahar and Ren, 2013). 특히 항진균성 AMPs들의 항균 기작을 보면 대부분 진균류의 세포벽이나 세포막에 작용하여 막투과성을 변화시키는 amphipathic한 성질을 나타내므로, 본 연구에서도 이를 확인하기 위하여 Vaara와 Vaara (1981)의 방법을 변형하여 적용하였다. 미리 전 배양한 C.
- 항생물질의 농도에 따른 효모 균주의 생육 억제를 보기 위해 전 배양한 C. albicans KCTC 7965 균주를 5 ml의 YM 액체 배지가 들어 있는 T형 tube에 2% 농도로 접종하고 n-butanol 로 농축한 소수성 항생물질을 농도 별로 가한 다음, 30°C, 200 rpm으로 진탕 배양하면서 효모 균주의 생장을 600 nm 파장에서 배양 시간 별로 측정하였다(Fig. 4).
- 효과적으로 항생물질을 생산 하는 조건에서 배양한 다음, 10,000 × g, 15분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 농축하기 위하여 n-butanol을 동량 가하여 추출하거나, ammonium sulfate를 배양액의 60%로 첨가하여 침전을 얻었다(Park et al., 2006).
대상 데이터
- 우선 진균류의 생육을 억제하는 세균을 찾기 위해 충북 청주시 미원면의 배추밭에서 근권 토양을 채취하였다. 채취한 시료는 멸균한 0.
성능/효과
- 효모의 생육을 억제하는 세균을 배추의 근권 토양에서 분리하였다. API 20NE test와 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과 Pseudomonas fluorescens BB2로 동정되었다. P.
- BB2 균주의 단백질성 항생물질은 ammonium sulfate에 의한 침전과 N-butanol 추출에 의해 농축되었으며, 효모의 생육을 억제하는데 Candida albicans KCTC 7965에 대한 minimal inhibitory concentration은 10 μg/ml이었고, 80μg/ml 농도에서는 완전히 억제하였다.
- 1과 같은 결과를 얻었다. P. fluorescens BB2 균주의 생장이 대수기를 지나면서 항생물질의 생산이 보이기 시작하여 24시간에서 최대가 되었고 더 이상 증가하지 않았다. 이것으로 보아 BB2 균주가 생산하는 항생물질은 2차 대사산물임을 알 수 있었으며, LB 배지에서 배양한 경우에는 항생물질 생산이 보이지 않았다.
- YM 배지의 glucose 양을 다양하게 한 경우와 진탕 배양 온도를 달리하여 배양한 결과(Table 1) glucose 농도를 3%로 하고 배양온도는 20°C로 유지하였을 때 최대 15 mm의 생육 억제환을 보였으며, glucose를 첨가하지 않거나 4% 이상인 경우 항생물질 생산이 줄었고, 35°C에서는 glucose 농도에 관계 없이 항생물질 생산이 중지되었다.
- YM 평판에 상기한 2가지 효모와 더불어서 Paffia rhodozyma 효모균, 그리고 그람 양성 세균인 Bacillus cereus ATCC 21366 를 도말한 다음, 농축한 3가지 시료 50 μl를 각각 paper disk에 가하여 생육 억제 여부를 비교한 결과(Fig. 2), 효모 균주들은 모두n-butanol 추출에 의한 소수성 분획과 ammonium sulfate에 의한 침전물에 의해 생육이 억제되었으나, B. cereus ATCC 21366 균주는 반대로 친수성 분획에 의해서만 생육이 억제되었다.
- 따라서 P. fluorescens BB2 균주는 2차 대사산물로 항생물질과 더불어 주변의 철(Fe3+)을 효과적으로 흡수하기 위한 siderophore를 동시에 생산하여 Jung과 Song (2015)이 지적한 바와 같이 주위 미생물들의 생육을 다양한 방법으로 억제하는 특성을 보여서 병원균들이 내성을 갖지 못하게 하는 장점을 가졌다. 이러한 다양한 항진균성 억제력이 근권 토양에서 Pseudomonas 균주들로 하여금 식물병원균을 억제할 수 있는 생물 방제 역할을 가능하게 한다.
- 따라서 P. fluorescens BB2가 생산하는 효모 Candida 생육 억제 항생물질의 MIC (minimal inhibitory concentration)는 10 μg/ml 정도라고 판단된다.
- 분리한 BB2 균주는 API 20NE kit (bioMérieux)를 이용한 동정시험과 16S rRNA유전자 염기서열 분석 결과 Pseudomonas fluorescens일 확률이 99.0% 이상이어서 P. fluorescens BB2로 명명하였다.
- 세균의 생육을 억제하는 n-butanol 친수성 분획은 노랑색을 띄며 자외선 하에서 형광을 나타내는 것으로 보아 pyoverdin 과 유사한 siderophore로 판단하였다. 실제로 chrome azurol Sagar assay (Schwyn and Neilands, 1987)를 통하여 주황색의 halo가 형성됨을 정성적으로 확인하였으며, 수용성인 특성으로 볼 때 catechol형이 아닌 hydroxamate형의 siderophore로 추정된다.
- 세포막을 통한 crystal violet의 흡수를 조사한 결과 효모 C. albicans에 대한 소수성 항생물질 60 μg/ml의 농도에서는 대조군에 비해 막 투과성이 약 9% 증가하였다.
- fluorescens BB2 균주의 생장이 대수기를 지나면서 항생물질의 생산이 보이기 시작하여 24시간에서 최대가 되었고 더 이상 증가하지 않았다. 이것으로 보아 BB2 균주가 생산하는 항생물질은 2차 대사산물임을 알 수 있었으며, LB 배지에서 배양한 경우에는 항생물질 생산이 보이지 않았다. YM 배지의 glucose 양을 다양하게 한 경우와 진탕 배양 온도를 달리하여 배양한 결과(Table 1) glucose 농도를 3%로 하고 배양온도는 20°C로 유지하였을 때 최대 15 mm의 생육 억제환을 보였으며, glucose를 첨가하지 않거나 4% 이상인 경우 항생물질 생산이 줄었고, 35°C에서는 glucose 농도에 관계 없이 항생물질 생산이 중지되었다.
- 이상과 같은 결과를 종합하면, P. fluorescens BB2 균주가 생산하는 항생물질은 효모 균주의 세포막 투과도를 변화시켜 정상적인 생육을 억제하는 소수성 단백질이다. 이와 같은 방식의 항진균성 항생물질들은 대부분 소수성 peptide로 구성되며, 그 길이가 짧을수록 항균효과가 뛰어난 것으로 보고되어 있는데(Bahar and Ren, 2013), BB2 균주가 생산하는 항생물질은 크기가 비교적 큰 단백질이므로 구조를 변화시켜서 활성을 높이는 과정을 거친다면 더욱 유용한 천연물 항생제가 될 것으로 기대한다.
- 이상과 같이 조사된 P. fluorescens BB2 균주가 생산하는 항생물질은 소수성을 띄는 단백질 성분이며 효모 균주들의 생육을 억제하는 특징을 보이는데, 이는 최근 관심을 모으고 있는 antimicrobial peptide (AMPs)에 속하는 것으로 생각된다 (Bahar and Ren, 2013). 특히 항진균성 AMPs들의 항균 기작을 보면 대부분 진균류의 세포벽이나 세포막에 작용하여 막투과성을 변화시키는 amphipathic한 성질을 나타내므로, 본 연구에서도 이를 확인하기 위하여 Vaara와 Vaara (1981)의 방법을 변형하여 적용하였다.
- 한편 ammonium sulfate 침전에 의한 항생물질 농축이 가능한 것은 이 물질이 단백질 성분으로 되어 있음을 보여주는데, 이를 확인하기 위하여 100°C에서 5분 이상 가열하면 효모 생육 억제능이 소실 되고, 단백질 분해효소 trypsin이나 chymotrypsin을 처리한 결과 24시간 내에 역시 소실됨을 알 수 있었다.
- 5% NaCl로 현탁하여 다시 10분간 진탕하였고, 상등액만 취하여 590 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 항생물질을 첨가하지 않은 대조군을 포함하여 효모 세포의 색소 흡수와 방출 정도를 비교한 결과 Fig. 5와 같이 항생물질 농도가 높아질수록 세포막의 투과도를 변화시켜 세포 내로 들어간 색소가 다시 배지로 빠져 나와서 MIC의 6배 농도에서는 대조군과 비교하여 흡수율이 약 9% 증가하는 것으로 나타났다. 이는 Lee와 Kim (2014)이 C.
후속연구
- 3(1)에서 보는 바와 같이 크기가 12 kDa 이상의 투석막 내부 시료는 억제를 보이지만 크기가 작은 외부의 시료는 효과가 없는 것으로 나타났으며, MWCO 값이 30 kDa인 Vivaspin 원심 분리관에 농축한 항생물질 용액을 넣고 5,000 × g로 1시간 원심분리하여 얻은 시료 중에서 분자량 30 kDa 이상의 시료가 효모의 생육을 억제하는 것으로 보아 항생물질의 분자량은 30 kDa 이상인 것으로 추정된다. 또한, 효모에 항균활성을 보이는 시료는 SDS-PAGE에 의한 분자량 측정 결과 Fig. 3(2)와 같이 약 35 kDa과 14.5 kDa의 크기를 가지는 2가지 단백질을 포함하는데, Vivaspin 원심 분리 결과 얻은 30 kDa 이상의 시료가 효모 생육을 억제하였으므로 BB2 균주가 생산하는 항생물질은 약 35 kDa의 단백질로 판단되나, 너무 크기가 크고 투석한 시료에 대한 SDS-PAGE 결과 14.5 kDa의 단백질도 같이 나타나므로 이 단백질들의 세부적인 구조와 기능에 대한 추가적인 조사가 필요하다.
- fluorescens BB2 균주가 생산하는 항생물질은 효모 균주의 세포막 투과도를 변화시켜 정상적인 생육을 억제하는 소수성 단백질이다. 이와 같은 방식의 항진균성 항생물질들은 대부분 소수성 peptide로 구성되며, 그 길이가 짧을수록 항균효과가 뛰어난 것으로 보고되어 있는데(Bahar and Ren, 2013), BB2 균주가 생산하는 항생물질은 크기가 비교적 큰 단백질이므로 구조를 변화시켜서 활성을 높이는 과정을 거친다면 더욱 유용한 천연물 항생제가 될 것으로 기대한다.
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