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문제 정의
- 또한 수용성 다당성분은 항염증 활성이 있는 것으로 보고되어 있으며[8, 13], 본 연구진의 기 연구에서 번행초 분획물이 항균, 항산화 및 항당뇨 기능이 있음을 보고한 바 있다[2, 3, 10]. 따라서 본 연구에서는 번행초에 대한 기능성 연구의 일환으로 염증이 유도된 RAW264.7 세포에 번행초 추출물 및 분획물을 처리하여 항염증 효능을 검증하였으며, Sarcoma-180을 복강에 투여한 마우스에서 종양에 대한 생명연장 효과를 측정하여 그 결과를 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 번행초의 추출물과 분획물의 항염증 효과 및 항암 활성에 대해 연구하였다. 번행초의 항염증 활성은 1 μg/ml LPS로 유도되는 NO 및 IL-1β의 생성이 억제됨을 통해 확인되었다.
- 67%의 수명 연장 효과가 관찰되었다. 이상의 결과는 번행초를 이용하여 효과적인 항염증 및 항암제 개발을 위한 사전조사로써 중요한 결과를 제공한다.
제안 방법
- 수명 연장 시험은 마우스를 무작위로 10마리씩 나누어 대조군, MeOH 처리군 및 다당류 처리군으로 나누고 이들 마우스 복강에 Sarcoma-180(3 × 106)을 주입한 후, 각 추출물을 100 mg/kg/day 용량으로 400 μl의 PBS에 희석하여 경구투여하였다. 3일 간격으로 30일까지 체중을 측정하였고, 생존일수 중앙치(median survival time, MST)로 다음 식과 같이 연명률(increase in life span, % ILS)을 계산하였다.
- Nitric oxide(NO) 생성량 측정은 Griess 시약을 이용하여 산화물인 NO2− 농도를 측정함으로써 확인하였다.
- 한편 예로부터 위암 등 항암 효과가 있는 것으로 알려진 번행초의 항암효과를 조사하기 위해 혈액암 세포주, 폐암 세포주 및 복수암에 대한 억제 활성을 조사한 결과, 혈액암과 폐암 세포의 증식에는 거의 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(unpublished data). 마우스 실험을 통한 복수암에 대한 효능은 마우스를 3개의 그룹으로 분류하고 Sarcoma-180을 주사하여 복수암을 유발시킨 뒤, 번행초 추출물을 경구투여하면서 수명 연장효과를 조사하였다(Fig. 3). 대조군은 종양 증식에 의한 체중 증가가 시료 처리군에 비해 빠른 것으로 조사되었으며, 평균수명은 18일이었고 20일에 모두 죽는 것으로 나타났다.
- 7 세포 5 × 104에 추출물을 농도별로 첨가하고 30분간 전처리한 후 1 μg/ml의 LPS를 처리하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양하였다. 배양 상층액에 동량의 Greiss 시약 첨가하여 10분간 반응시킨 후, 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, nitrite의 농도는 sodium nitrite의 표준 곡선과 비교하여 계산하였다.
- 번행초 건초 1 kg를 methanol(MeOH)과 1:3 비율로 혼합하여 실온에서 6시간 동안 진탕하여 3회 반복 추출하였고, 회전진공 농축하여 MeOH(70.0 g) 추출물을 얻었다. 유기용매 계통분획법에 따라 hexane(HX, 14.
- 번행초 추출물 및 분획물의 항염증 효능 측정을 위해 0.1−100 μg/ml 농도로 세포 생존도를 측정한 결과, 영향이 없는 것으로 확인되었으며 활성을 보이는 최저농도인 10 μg/ml을 실험농도로 설정하였다.
- 수명 연장 시험은 마우스를 무작위로 10마리씩 나누어 대조군, MeOH 처리군 및 다당류 처리군으로 나누고 이들 마우스 복강에 Sarcoma-180(3 × 106)을 주입한 후, 각 추출물을 100 mg/kg/day 용량으로 400 μl의 PBS에 희석하여 경구투여하였다.
- 0 g) 추출물을 얻었다. 유기용매 계통분획법에 따라 hexane(HX, 14.35 g), dichloromethane(DCM, 8.97 g), ethylacetate(EA, 6.99 g), 그리고 butanol(BuOH, 5.15 g) 순으로 용매 분획하여 분획물을 순차적으로 얻었다. 여과과정에서 MeOH에 녹지 않는 다당류(58.
- 적당한 비율로 희석한 세포 배양 상층액과 biotin이 부착된 2차 항체 100 μl/well를 분주하고 일정시간 상온에서 반응시킨 뒤 avidin-peroxidase 100 μl/well와 2,2’'-azino-bis를 첨가하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 즉, 1차 항체 goat anti-human cytokine을 50 μl/well로 분주하고 4℃에서 overnight 한 다음, 10% FBS가 첨가된 PBS로 blocking하였다.
대상 데이터
- RAW264.7 세포, 인간 혈액암계열 세포주 HL-60, 폐암계열 세포주 A-549 및 종양세포 Sarcoma-180은 한국세포주은행(서울대학교 의과대학 암연구소)에서 구입하였다. 세포배양은 sodium bicarbonate(NaHCO3, 2 g/l), 10,000 units/ml penicillin G sodium, 10,000 units/ml streptomycin sulfate, 25 μg/ml amphotericin B, 50 μM 2-mercaptoethanol(2-ME), 10% fetal bovine serum(FBS)가 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하였다.
- 세포배양은 sodium bicarbonate(NaHCO3, 2 g/l), 10,000 units/ml penicillin G sodium, 10,000 units/ml streptomycin sulfate, 25 μg/ml amphotericin B, 50 μM 2-mercaptoethanol(2-ME), 10% fetal bovine serum(FBS)가 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하였다.
- 실험동물은 (주)대한바이오링크(충청북도, 음성군, 한국)에서 생후 6주령의 암컷 ICR 마우스를 공급받아 폴리카보네이트 사육상자(18 × 20 cm)당 5개체의 밀도를 유지하였고 온도 21 ± 2℃, 습도 55 ± 10%의 환경에서 실험동물용 고형사료와 여과된 멸균 정제수를 충분히 공급하면서 낮과 밤의 주기를 12시간씩 조절하여 가능한 스트레스를 받지 않도록 사육하였다.
이론/모형
- 또한 사이토카인 생성량 측정을 위해 동일한 조건에서 RAW264.7 세포를 배양하였고, 배양액 내의 염증성 사이토카인 interleukin(IL)-1β, IL-6, tumor necrosis factor(TNF)-α 및 granulocytes macrophage-colony stimulating factor(GM-CSF)의 양은 효소항체법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- 대조군은 종양 증식에 의한 체중 증가가 시료 처리군에 비해 빠른 것으로 조사되었으며, 평균수명은 18일이었고 20일에 모두 죽는 것으로 나타났다. MeOH 처리군은 대조군에 비해 종양 증식속도가 느렸고 평균수명은 가장 긴 23일이었으며, 다당류 처리군의 종양 증식 속도는 가장 느린 것으로 확인되었다. 18일을 기점으로 체중이 서서히 감소하였고 25일경 모두 죽었으며, 평균수명은 21.
- RAW264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도되는 염증 매개인자인 NO 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 1 μg/ml의 LPS 처리시 증가된 NO는 다당류보다는 MeOH 추출물에 의해 생성이 억제됨이 관찰되었으며, 특히 HX 분획물에 의해 현저히 감소되는 것으로 확인되었다(Fig. 1).
- 7 세포에서 다당류 추출물을 처리한 후 생성이 감소되었다. 나아가 HX 분획물은 GM-CSF의 생성을 강력하게 억제하는 것으로 확인되었다. 또한 Sarcoma 180을 미리 주사한 ICR 마우스에 MeOH과 다당 추출물을 100 mg/kg/day 복강내 투여시 16.
- 3). 대조군은 종양 증식에 의한 체중 증가가 시료 처리군에 비해 빠른 것으로 조사되었으며, 평균수명은 18일이었고 20일에 모두 죽는 것으로 나타났다. MeOH 처리군은 대조군에 비해 종양 증식속도가 느렸고 평균수명은 가장 긴 23일이었으며, 다당류 처리군의 종양 증식 속도는 가장 느린 것으로 확인되었다.
- 또한 HX 분획물은 대식세포 증식을 조절하는 GM-CSF의 생산을 억제하는데 가장 효과적으로 작용하였으며, TNF-α의 생성도 DCM 분획물과 같이 유의하게 조절하는 것으로 확인되었다. 따라서 번행초 추출물은 염증반응의 초기 단계부터 만성염증에 이르기까지 관여하는 사이토카인의 분비를 조절하는 것으로 확인되었다. 오미자 HX 분획물에서 항염증 및 면역증강에 효능이 있는 α-iso-cubebene이 분리되어 보고되고 있으며, lignans 등 활성 성분의 함량도 높은 것으로 보고되고 있는 바[4], 본 연구에서도 HX 분획물에서 활성이 높은 것으로 나타났다.
- 또한 HX 분획물은 대식세포 증식을 조절하는 GM-CSF의 생산을 억제하는데 가장 효과적으로 작용하였으며, TNF-α의 생성도 DCM 분획물과 같이 유의하게 조절하는 것으로 확인되었다.
- 나아가 HX 분획물은 GM-CSF의 생성을 강력하게 억제하는 것으로 확인되었다. 또한 Sarcoma 180을 미리 주사한 ICR 마우스에 MeOH과 다당 추출물을 100 mg/kg/day 복강내 투여시 16.67%의 수명 연장 효과가 관찰되었다. 이상의 결과는 번행초를 이용하여 효과적인 항염증 및 항암제 개발을 위한 사전조사로써 중요한 결과를 제공한다.
- 또한 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, TNF-α 및 GM-CSF 분비를 조절하는 효과는 다당류 추출물이 LPS에 의해 유도된 IL-6의 생성을 현저하게 억제하였으며, TNF-α에 대해서도 다른 분획물에 비해 다소 높은 생성 억제효능을 보였다(Fig. 2).
- 일반적으로 버섯 유래의 항암성 고분자 다당류는 잘 알려져 있으며, 암세포에 직접 작용하기보다 면역기능을 증강시킴으로써 부작용이 거의 없는 것으로 알려져 있다[11]. 번행초의 다당 성분은 in vitro에서 위궤양 및 위암세포에 대한 효과가 보고되어 있으나, 본 연구에서 경구투여시 마우스에서 항암효과를 실증적으로 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 번행초의 추출물과 분획물의 항염증 효과 및 항암 활성에 대해 연구하였다. 번행초의 항염증 활성은 1 μg/ml LPS로 유도되는 NO 및 IL-1β의 생성이 억제됨을 통해 확인되었다. IL-6 및 TNF-α도 1 μg/ml LPS로 자극된 RAW264.
- 황금 열수추출물과 고삼 에탄올 추출물은 각각 40 μg/ml, 20 μg/ml의 농도에서 NO 생성을 약 40% 저해하는 것으로 보고되고 있으나[6, 16], 번행초의 HX 분획물은 10 μg/ml의 저농도에서 약 60% 억제하는 것으로 나타나 염증매개인자로서 중요한 작용을 하는 NO 생성을 보다 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 또한 분리된 cerebrosides와 steryl glucoside는 위궤양에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다[15]. 그러므로 본 연구에서는 부종 억제효과를 보이는 항염증 활성를 입증하기 위하여 구체적인 연구를 진행하였으며 이러한 결과는 번행초의 HX 분획물과 다당성분에 상기 언급한 항염증 등 활성 물질도 다수 함유되어 있기 때문인 것으로 판단된나, 활성물질에 대한 추가적인 자세한 연구가 필요하다.
- 최근 연구 개발되는 항암제는 대부분 복약 순응도를 높이기 위해 경구제로 투여되고 있는 추세이므로, 본 연구를 토대로 번행초 추출물을 이용하여 보다 다양한 인체암에 대해 in vivo 실험을 통해 정확한 효능을 검증할 필요성이 있으며, 특히 번행초는 오래 전부터 식용으로 사용되고 있으므로 경구제제로도 개발 가능하다. 또한 건강식품으로의 개별인증을 함으로써 다양한 제제화도 가능할 것으로 판단된다.
- 최근 연구 개발되는 항암제는 대부분 복약 순응도를 높이기 위해 경구제로 투여되고 있는 추세이므로, 본 연구를 토대로 번행초 추출물을 이용하여 보다 다양한 인체암에 대해 in vivo 실험을 통해 정확한 효능을 검증할 필요성이 있으며, 특히 번행초는 오래 전부터 식용으로 사용되고 있으므로 경구제제로도 개발 가능하다. 또한 건강식품으로의 개별인증을 함으로써 다양한 제제화도 가능할 것으로 판단된다.
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