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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 L. casei로 발효시킨 톳 추출물을 이용하여 LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 대식세포에서 NO 생성 억제와 염증관련인자의 발현에 미치는 영향을 검토하여 발효 톳의 항염증 소재로서의 이용 가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- PCR 산물은 TAE buffer (Biosesang, Korea)를 전해질로 사용한 1.5% agarose gel을 이용하여 10분간 전기영동한 후, Ethidium bromide (EtBr, AMRESCO, USA) 용액에 담궈 30분 동안 염색한 후 UV (Davinch-Chemi imager™, CAS-400SM, Wako Co., Osaka, Japan) 하에서 확인하였다.
- RAW 264.7세포를 96-well plates에 1×103 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 시료를 농도별로 처리하였으며 NO 생성을 유도하기 위해 LPS (1 µg/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- fusiformis for 1 h and following by treating with LPS (1 µg/mL) for 24 h. The nitrite content of culture media was analyzed. a-dMeans with the different letters in the each sample are significantly different (p<0.
- 발효가 완료된 톳 발효액을 진공농축기 (R-200, Buchi, Switzerland)를 이용하여 농축시킨 후, 동결건조 (FD8518, Ilshin BioBae, Korea)하여 발효 톳 건조시료를 얻었다. 건조시료에 10배량 (w/v)의 70% 에탄올을 첨가한 후, 80℃ 에서 4시간씩 2회 추출을 수행하였으며 진공농축기를 이용하여 농축시켜 추출물을 얻었다.
- 발효가 완료된 톳 발효액을 진공농축기 (R-200, Buchi, Switzerland)를 이용하여 농축시킨 후, 동결건조 (FD8518, Ilshin BioBae, Korea)하여 발효 톳 건조시료를 얻었다. 건조시료에 10배량 (w/v)의 70% 에탄올을 첨가한 후, 80℃ 에서 4시간씩 2회 추출을 수행하였으며 진공농축기를 이용하여 농축시켜 추출물을 얻었다.
- COX-1은 정상적인 생체기능에 적용되어 인체에 유익한 prostaglandins 형성에 관여하는 효소인 반면, COX-2는 염증 유발 자극인자들에 의해 활성화되어 통증과 염증을 유발시키는 prostaglandins의 분비에 작용한다 [14-16]. 발효톳 에탄올 추출물의 NO 생성 억제 효과가 염증 관련 유전자의 발현조절과 관련이 있는지 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다 (Fig. 2). 유전자 발현에 큰 변화를 보이지 않은 L.
- 발효톳 에탄올 추출물의 RAW 264.7세포에 대한 세포독성은 MTT assay를 통하여 확인하였다 (Fig. 1(a)).
- 이들 중 TNFα는 endotoxin shock에 관련된 중요한 인자로 과발현되면 치명적인 독성을 유발하여 패혈증의 원인이 되는 것으로 알려지고 있다 [18]. 발효톳 에탄올 추출물이 pro-inflammatory cytokine의 유전자 발현에 미치는 효과를 RT-PCR을 통하여 확인하였다(Fig. 3). L.
- 발효톳 추출물의 NO 생성억제 활성을 알아보기 위해 RAW 264.7세포에서 LPS로 자극을 유도하고 시료를 농도별 (10, 100, 500 µg/mL)로 처리하여 24시간 후 NO 생성량을 측정하였다 (Fig.
- 상기와 동일한 조건에서 배양한 RAW 264.7 세포를 Trizol reagent (Invitrogen Co., CA, USA)를 이용하여 total RNA를 추출, 정량하였다. 분리된 RNA (2 µg)는 37℃ 에서 1시간동안 역전사 반응을 실시하여 cDNA를 합성하였다.
- MTT (1 mg/mL) 용액을 가하고 동일한 배양 조건에서 4시간 더 배양하였다. 이때 생성된 formazan crystal은 DMSO에 녹여서 ELISA Reader (Multiskan GO, Thermo Scientific, Finland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율 (%)을 다음과 같이 계산하였다.
- 톳의 분해성을 높여 유용성분의 활성을 증진시키고자 유산균 L. casei을 이용한 발효 공정을 도입하여 유산균 발효에 따른 항염증 활성을 L. casei 접종군과 L. casei 무접종군으로 나누어 비교하였다. 그 결과, L.
- 합성된 cDNA에 COX-2, iNOS, IL-1β, IL-6와 TNFα primer를 첨가하였으며 internal control로 β-actin을 사용하였다 (Table 1).
대상 데이터
- 마우스 대식세포인 RAW 264.7세포는 10% fetal bovine serum (FBS, Atlas, Fort Collins, CO, USA) 및 1% penicillin (Sigma-Aldrich, St. Lousi, MO, USA)을 포함한 phenol red-free Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 발효균주로는 Lactobacillus casei ((주) 메디오젠, Jecheon, Korea)를 실험에 사용하였다. L.
- 본 실험에 사용한 톳 (Hizikia fusiformis)은 2013년 파라제주(Jeju, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 탈염된 톳 건조물 을 초미세 기류식 분쇄기 (KMS-200, Korea)로 분쇄한 다음 밀봉하여 4℃에 보관하면서 사용하였다.
- Lousi, MO, USA)와 1:1로 혼합하여 15분 동안 실온에 방치한 후, ELISA Reader (Multiskan GO, Thermo Scientific, Finland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO양은 표준물질인 sodium nitrate (NaNO2)를 표준용액으로 사용하여 계산하였다.
데이터처리
- 실험결과는 평균×표준편차 (Mean×Standard deviation, SD)로 표시하였으며, SPSS+ /WIN 12.0 (Statistical Package for Social Science, version 12.0) 통계 프로그램을 이용하여 통계적 유의성을 검토하였다.
- 집단간의 유의성을 검정하기 위해 일원배치 분산분석 (Oneway Analysis of Variance: ANOVA)을 통해 분석하였고, 사후검증은 Duncan's multiple range test를 실시하여 p<0.05 수준에서 검증하였다.
이론/모형
- casei는 MRS 액체배지를 이용하여 30℃에서 정치 배양하였다. 발효액은 이전 연구방법에 따라 제조하였다[9]. 톳 분말10 g에 5% (w/v)로 되게 ddH2O를 첨가한 후, 탄소원으로 1% glucose의 농도로 첨가하여 121℃의 가압 조건에서 30분간 멸균하였다.
- 세포독성은 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay를 이용하여 측정하였다. RAW 264.
성능/효과
- RAW 264.7세포에 발효톳 에탄올 추출물을 농도별 (10, 100, 500 µg/mL)로 처리한 결과, L. casei 접종군 및 L. casei 무접종군 모두 90% 이상의 생존율을 보여 RAW 264.7세포에 대한 독성이 나타나지 않음을 확인하였으며, 이 농도에서 발효톳 추출물의 염증 억제 활성을 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
- 그 결과, L. casei 무접종군은 LPS에 의해 유도된 NO생성과 TNFα의 발현을 억제하여 톳 발효 추출물 그 자체로도 염증 억제 효과를 보임을 확인하였다.
- 특히, NO 생성과 직접적으로 연관된 iNOS의 발현이 두 그룹간 큰 차이를 보인 점은 유산균 발효가 전사수준에서 iNOS 유전자를 조절하여 NO 생성을 효과적으로 억제한다는 것을 시사한다. 또한, proinflammatory cytokine에 보인 뛰어난 억제효과는 L. casei를 이용한 발효가 염증 억제에 효과가 있는 유효 성분의 추출률을 높여줄 수 있음을 보여준다. 본 연구를 바탕으로 향후 개선된 발효 조건을 확립하여 항염증 활성 물질 개발 연구에 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 기대되며, 톳 발효 추출물을 기능성 소재로 개발하기 위해서 항염증 억제 기전에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 반면, L. casei 접종군은 TNFα, IL-1β와 IL-6 발현 모두 농도 의존적으로 저해하였으며, 500 µg/mL 농도에서는 L. casei 무접종군에 비해 L. casei 접종군의 TNFα, IL-1β와 IL-6 발현이 현저히 억제되어 발효톳 에탄올 추출물이 pro-inflammatory cytokine 생성을 저해하는 것을 확인하였다.
- 유전자 발현에 큰 변화를 보이지 않은 L. casei 무접종 군에 비하여 L. casei 접종군은 COX-2의 발현을 농도 의존적으로 저해하였으며, 특히 500 µg/mL의 농도에서 iNOS와 COX-2의 발현을 현저히 억제하였다.
- 특히, L. casei 접종군은 L. casei 무접종군에 비해 10, 100, 500 ìg/mL의 처리 농도에서 각각 1.4배, 1.3배, 2.1배의 NO 생성 저해 효과를 보였다.
- casei 접종군은 위 인자들의 발현을 유의적으로 저해시켰다. 특히, NO 생성과 직접적으로 연관된 iNOS의 발현이 두 그룹간 큰 차이를 보인 점은 유산균 발효가 전사수준에서 iNOS 유전자를 조절하여 NO 생성을 효과적으로 억제한다는 것을 시사한다. 또한, proinflammatory cytokine에 보인 뛰어난 억제효과는 L.
후속연구
- casei를 이용한 발효가 염증 억제에 효과가 있는 유효 성분의 추출률을 높여줄 수 있음을 보여준다. 본 연구를 바탕으로 향후 개선된 발효 조건을 확립하여 항염증 활성 물질 개발 연구에 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 기대되며, 톳 발효 추출물을 기능성 소재로 개발하기 위해서 항염증 억제 기전에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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