당뇨 처방에 근거한 생약재의 α-Glucosidase 활성 저해 효과 및 이를 활용한 미백 소재 평가법 Effect of Medicinal Herb Prepared through Traditional Antidiabetic Prescription on α-Glucosidase Activity and Evaluation Method for Anti-Melanogenesis Agents Using α-Glucosidase Activity원문보기
본 연구에서는 선정한 생약재 및 복합처방단의 ${\alpha}$-glucosidase 저해 활성을 알아보았으며, 이 방법이 미백 소재 스크리닝을 위한 유용한 평가법인지를 알아보았다. 한의학과 민간에서 당뇨의 개선 및 치료 효과가 우수하다고 알려진 생약재 및 처방 중 죽력, 귀전우, 적양, 연자육, 마인, 청심연자음의 ${\alpha}$-glucosidase 활성 저해 효과는 식후 혈당조절제인 acarbose와 비교하여 볼 때 우수한 효과를 나타내었다. 미백 효과가 알려진 연자육을 함유한 청심연자음 hydrolyzed EtOAc layer는 $100{\mu}g/mL$ 농도에서 약 50% 멜라닌 생성 저해 효과를 보였다. 또한 청심연자음 hydrolyzed EtOAc layer는 ${\alpha}$-glucosidase 활성 저해 효과가 우수하였으나 mushroom tyrosinase 활성 저해 효과는 나타나지 않았다. 이로써 청심연자음 hydrolyzed EtOAc layer는 ${\alpha}$-glucosidase 활성을 저해시켜 tyrosinase의 glycosylation을 저해함으로써 멜라닌 생성 억제 효과가 나타나는 것으로 생각된다. 이상의 결과로 볼 때 ${\alpha}$-glucosidase 활성 억제 효과가 있으면서 당뇨병에 효과가 있는 생약재들은 N-linked glycoprotein인 tyrosinase의 glycosylation을 저해하여 tyrosinase의 세포 내 이동이나 활성을 억제함으로써 멜라닌 생성을 억제할 것으로 사료되며, 본 연구에서 선정된 생약재들은 당뇨병 치료를 위한 목적뿐만 아니라 화장품에서 새로운 미백 소재로서의 활용가치가 있을 것으로 판단된다. 또한 미백에 효과가 있는 소재 스크리닝을 위해 현재 널리 사용되고 있는 mushroom tyrosinase 활성 저해 효과와 다른 접근 방법으로써 ${\alpha}$-glucosidase 활성 측정 방법도 하나의 평가법으로 유용할 것으로 생각된다.
본 연구에서는 선정한 생약재 및 복합처방단의 ${\alpha}$-glucosidase 저해 활성을 알아보았으며, 이 방법이 미백 소재 스크리닝을 위한 유용한 평가법인지를 알아보았다. 한의학과 민간에서 당뇨의 개선 및 치료 효과가 우수하다고 알려진 생약재 및 처방 중 죽력, 귀전우, 적양, 연자육, 마인, 청심연자음의 ${\alpha}$-glucosidase 활성 저해 효과는 식후 혈당조절제인 acarbose와 비교하여 볼 때 우수한 효과를 나타내었다. 미백 효과가 알려진 연자육을 함유한 청심연자음 hydrolyzed EtOAc layer는 $100{\mu}g/mL$ 농도에서 약 50% 멜라닌 생성 저해 효과를 보였다. 또한 청심연자음 hydrolyzed EtOAc layer는 ${\alpha}$-glucosidase 활성 저해 효과가 우수하였으나 mushroom tyrosinase 활성 저해 효과는 나타나지 않았다. 이로써 청심연자음 hydrolyzed EtOAc layer는 ${\alpha}$-glucosidase 활성을 저해시켜 tyrosinase의 glycosylation을 저해함으로써 멜라닌 생성 억제 효과가 나타나는 것으로 생각된다. 이상의 결과로 볼 때 ${\alpha}$-glucosidase 활성 억제 효과가 있으면서 당뇨병에 효과가 있는 생약재들은 N-linked glycoprotein인 tyrosinase의 glycosylation을 저해하여 tyrosinase의 세포 내 이동이나 활성을 억제함으로써 멜라닌 생성을 억제할 것으로 사료되며, 본 연구에서 선정된 생약재들은 당뇨병 치료를 위한 목적뿐만 아니라 화장품에서 새로운 미백 소재로서의 활용가치가 있을 것으로 판단된다. 또한 미백에 효과가 있는 소재 스크리닝을 위해 현재 널리 사용되고 있는 mushroom tyrosinase 활성 저해 효과와 다른 접근 방법으로써 ${\alpha}$-glucosidase 활성 측정 방법도 하나의 평가법으로 유용할 것으로 생각된다.
For the purpose of investigating the in vitro antidiabetic activity of a medicinal herb and herb mixture extracts prepared through traditional antidiabetic prescription, this study examined ${\alpha}$-glucosidase inhibitory activity. Tyrosinase, a type I membrane glycoprotein, is synthesi...
For the purpose of investigating the in vitro antidiabetic activity of a medicinal herb and herb mixture extracts prepared through traditional antidiabetic prescription, this study examined ${\alpha}$-glucosidase inhibitory activity. Tyrosinase, a type I membrane glycoprotein, is synthesized and glycosylated in the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi. The enzyme is subsequently transported to melanosomes, where it participates in melanogenesis. Previous studies showed that disruption of early ER N-glycan processing by an ${\alpha}$-glucosidase inhibitor suppresses tyrosinase enzymatic activity and melanogenesis. According to the results, most oriental medicinal herbal extracts were stronger than acarbose and N-butyldeoxynojirimycin, known as an ${\alpha}$-glucosidase inhibitor. Interestingly, ethyl acetate layer of enzyme hydrolyzed Cheongsimyeonjaeum had an inhibitory effect on melanin synthesis in B16F1 cells, although it did not inhibit tyrosinase activity directly. Together, ${\alpha}$-glucosidase inhibition activity could be used to evaluate anti-melanogenesis, although cross-checking with melanin inhibitory assay is recommended.
For the purpose of investigating the in vitro antidiabetic activity of a medicinal herb and herb mixture extracts prepared through traditional antidiabetic prescription, this study examined ${\alpha}$-glucosidase inhibitory activity. Tyrosinase, a type I membrane glycoprotein, is synthesized and glycosylated in the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi. The enzyme is subsequently transported to melanosomes, where it participates in melanogenesis. Previous studies showed that disruption of early ER N-glycan processing by an ${\alpha}$-glucosidase inhibitor suppresses tyrosinase enzymatic activity and melanogenesis. According to the results, most oriental medicinal herbal extracts were stronger than acarbose and N-butyldeoxynojirimycin, known as an ${\alpha}$-glucosidase inhibitor. Interestingly, ethyl acetate layer of enzyme hydrolyzed Cheongsimyeonjaeum had an inhibitory effect on melanin synthesis in B16F1 cells, although it did not inhibit tyrosinase activity directly. Together, ${\alpha}$-glucosidase inhibition activity could be used to evaluate anti-melanogenesis, although cross-checking with melanin inhibitory assay is recommended.
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문제 정의
본 연구에서는 특허 및 논문 등을 통하여 당뇨병에 효과가 있는 약재 중 α-glucosidase 저해 활성을 보이는 생약재를 검색하였다. 이 중 미백 관련 특허가 없고 α-glucosidase 저해 활성의 IC50 값이 1 mg/mL 이하이며 쉽게 구할 수 있는 귀전우(Euonymus alatus Siebold)(17), 연자육(Nelumbo nucifera Gaertner)(18), 자화지정(Viola mandshurica W.
본 연구의 생약 추출물들에서 in vitro 미백효능 스크리닝을 위한 평가법으로 널리 이용되는 tyrosinase 활성 저해 및 DOPA 자동산화 억제 효과가 있는지 알아보았다. Tyrosi-nase는 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소이며, DOPA oxidation은 멜라닌 합성과정에서 tyrosine이 DOPA를 거쳐 DOPAquinone으로 전환되고, DOPAquinone으로부터 자동산화 반응과 효소 반응으로 DOPAchrome을 거쳐 멜라닌이 생성되는 데 관여하는 단계이다(28).
또한 오늘날의 당뇨병과 같은 소갈의 원인과 증상, 치료를 다룬 동의보감의 소갈문에 기재된 복합처방단과 단방처방 중 미백과 관련된 생약재를 포함하지 않으며 쉽게 구할 수 있는 마인(Cannabis Semen), 죽력(tabasheer), 맥문동음자(麥門冬飮子), 문동음자(門冬飮子), 청심연자음(淸心蓮子飮), 활혈윤조생진음(活血潤燥生津飮)(21)을 선정하였다. 선정한 생약재 및 복합처방단의 α-glucosidase 저해 활성을 알아보았으며, 이 방법이 미백 소재 스크리닝을 위한 유용한 평가법인지를 알아보았다.
제안 방법
Table 2의 생약 추출물 중 우수한 α-glucosidase 활성 저해 효과가 나타난 생약재 추출물에 함유되어 있는 활성물질 분획물을 얻고자 75% EtOH Ext.를 제조하고 이를 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드로 분획하였다. 그 결과 자화지정은 75% EtOH Ext.
멜라닌 양 측정은 Oka(25)의 방법을 변형하여 사용하였다. B16F1 melanoma cells을 6-well plate에 1×105 cells/well이 되게 준비한 후 24시간 동안 37°C, CO2 항온기에서 배양하였다.
한의학과 민간에서 당뇨의 개선 및 치료 효과가 우수하다고 알려진 복합 처방 및 생약재들을 75% EtOH 수용액으로 추출하고 그 추출물들의 α-glucosidase 저해 활성을 평가하였다. 그 결과 죽력, 귀전우, 적양, 연자육이 100 μg/mL 농도에서 90% 이상으로 뛰어난 활성 저해 효과를 나타내었다.
대상 데이터
이 중 미백 관련 특허가 없고 α-glucosidase 저해 활성의 IC50 값이 1 mg/mL 이하이며 쉽게 구할 수 있는 귀전우(Euonymus alatus Siebold)(17), 연자육(Nelumbo nucifera Gaertner)(18), 자화지정(Viola mandshurica W. Becker)(19), 적양(Alnus japonica Steud)(20)을 선정하였다. 또한 오늘날의 당뇨병과 같은 소갈의 원인과 증상, 치료를 다룬 동의보감의 소갈문에 기재된 복합처방단과 단방처방 중 미백과 관련된 생약재를 포함하지 않으며 쉽게 구할 수 있는 마인(Cannabis Semen), 죽력(tabasheer), 맥문동음자(麥門冬飮子), 문동음자(門冬飮子), 청심연자음(淸心蓮子飮), 활혈윤조생진음(活血潤燥生津飮)(21)을 선정하였다.
Becker)(19), 적양(Alnus japonica Steud)(20)을 선정하였다. 또한 오늘날의 당뇨병과 같은 소갈의 원인과 증상, 치료를 다룬 동의보감의 소갈문에 기재된 복합처방단과 단방처방 중 미백과 관련된 생약재를 포함하지 않으며 쉽게 구할 수 있는 마인(Cannabis Semen), 죽력(tabasheer), 맥문동음자(麥門冬飮子), 문동음자(門冬飮子), 청심연자음(淸心蓮子飮), 활혈윤조생진음(活血潤燥生津飮)(21)을 선정하였다. 선정한 생약재 및 복합처방단의 α-glucosidase 저해 활성을 알아보았으며, 이 방법이 미백 소재 스크리닝을 위한 유용한 평가법인지를 알아보았다.
본 실험에 사용한 생약재 및 복합처방단의 약재들은 (주)지유본초(Chuncheon, Korea)로부터 구입하여 사용하였으며, 죽력은 죽림식품(Damyang, Korea)에서 구입하였다. 복합처방단은 동의보감을 참고하였으며, 맥문동(Liriope pla-typhylla), 지모(Anemarrhena asphodeloides Bunge), 천화분(Trichosanthes kirilowii), 인삼(Panax ginseng), 오미자(Schizandrachinensis Baill.
세포주는 마우스 흑색종 세포주인 B16F1 melanoma cell을 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 분양 받아 사용하였으며, 세포 배양에 사용된 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)는 10% fetal bovine serum(HyClone Lab., Logan, UT, USA), 1% antibiotic antimycotic(100 U/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 혼합한 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양하고 70~80%의 cell culture confluency를 보일 때 실험을 실시하였다.
성능/효과
00 mg/mL로 양호한 저해 효과가 나타났으나 청심연자음 hydrolyzed EtOAc layer에서는 tyrosinase 활성 저해 효과가 나타나지 않았다. DOPA 자동산화 저해 활성 측정 결과 자화지정 추출물에서는 효과가 나타나지 않았으며, 그 외의 추출물군에서는 유사한 저해 효과가 나타났다. 이러한 결과로 볼 때 청심연자음 hydrolyzed EtOAc layer는 tyrosinase 활성 억제제가 아닌 tyrosinase의 glycosylation inhibitor로 작용함으로써 멜라닌 생성 저해 효과를 나타낸 것으로 사료되며, 이러한 작용 기전을 확인하기 위해서는 청심연자음 hydro-lyzed EtOAc layer에서의 tyrosinase N-glycosylation 저해 효과에 대해 알아봐야 할 것이다.
MTT assay를 통하여 청심연자음 hydrolyzed EtOAc layer는 100 μg/mL 농도까지 세포 생존에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다(data 미첨부). Fig.
를 제조하고 이를 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드로 분획하였다. 그 결과 자화지정은 75% EtOH Ext.에 비해 EtOAc layer에서 α-gluco-sidase 활성을 50% 저해하는 농도인 IC50 값이 13.34±2.88 μg/mL로 향상되었으며, 복합처방단인 청심연자음은 EtOAc layer, CH2Cl2 layer, hydrolyzed EtOAc layer에서 IC50 값이 각각 4.46±1.05, 37.24±2.26, 2.04±0.33 μg/mL로 효과가 향상되었다. 귀전우, 적양, 연자육은 EtOAc layer에서 IC50 값이 각각 0.
한의학과 민간에서 당뇨의 개선 및 치료 효과가 우수하다고 알려진 복합 처방 및 생약재들을 75% EtOH 수용액으로 추출하고 그 추출물들의 α-glucosidase 저해 활성을 평가하였다. 그 결과 죽력, 귀전우, 적양, 연자육이 100 μg/mL 농도에서 90% 이상으로 뛰어난 활성 저해 효과를 나타내었다. 이는 α-glucosidase 활성 저해제로 알려져 있는 acar-bose(약 29% 저해)와 N-butyldeoxynojirimycin(약 19% 저해)보다 탁월한 효과를 나타낸 것이다.
이는 α-glucosidase 활성 저해제로 알려져 있는 acar-bose(약 29% 저해)와 N-butyldeoxynojirimycin(약 19% 저해)보다 탁월한 효과를 나타낸 것이다. 다음으로 마인은 57.28±2.15% 저해 효과를 보였으며, α-glucosidase 활성 저해 효과가 알려진 자화지정은 2.71±0.21%로 위의 측정 농도에서는 활성 저해 효과가 거의 나타나지 않았다. 복합처방단인 청심연자음은 37.
21%로 위의 측정 농도에서는 활성 저해 효과가 거의 나타나지 않았다. 복합처방단인 청심연자음은 37.24±2.26%의 저해 효과를 보였으며, 활혈윤조생진음(11.28±7.19% 저해), 맥문동음자(13.23 ±2.62% 저해), 문동음자(7.26±3.77% 저해)의 75% EtOH Ext.에서는 α-glucosidase 활성 저해 효과가 거의 나타나지 않았다(Table 2).
후속연구
DOPA 자동산화 저해 활성 측정 결과 자화지정 추출물에서는 효과가 나타나지 않았으며, 그 외의 추출물군에서는 유사한 저해 효과가 나타났다. 이러한 결과로 볼 때 청심연자음 hydrolyzed EtOAc layer는 tyrosinase 활성 억제제가 아닌 tyrosinase의 glycosylation inhibitor로 작용함으로써 멜라닌 생성 저해 효과를 나타낸 것으로 사료되며, 이러한 작용 기전을 확인하기 위해서는 청심연자음 hydro-lyzed EtOAc layer에서의 tyrosinase N-glycosylation 저해 효과에 대해 알아봐야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
대사증후군 질환 중 하나인 당뇨병의 치료방법에는 무엇이 있는가?
고열량 식사가 늘어나면서 당뇨, 고지혈증 등 대사증후군 질환의 발병률이 증가하고 있으며, 이들 대사증후군을 식품의 섭취를 통하여 개선하고자 하는 노력이 지속적으로 이루어지고 있다. 당뇨병의 치료 방법에는 식이요법, 운동요법과 함께 약물요법이 있으며, 임상에서 사용되고 있는 약물로는 인슐린 제제, sulfonylurea 제제, biguanide 제제, troglitazone 제제 등이 있지만 저혈당, 유산증 등의 치명적 부작용이 보고되고 있다(2). 또 다른 혈당관리 방법은 섭취한 식이 중 탄수화물의 소화와 흡수를 지연시켜 식후 혈당 및 혈중 인슐린의 상승을 저하시킴으로써 당뇨병의 치료 효과를 가져오는 것이 있으며, 이러한 물질로는 식이섬유(3,4)와 장내소화효소인 α-glucosidase에 대한 억제제(5)가 있다.
α-Glucosidases는 어떤 효소인가?
α-Glucosidases는 소장 내에서 탄수화물로부터 α-glu-cose를 방출하는 α-glucosidic bond의 분해를 촉진하여 포도당을 흡수하는 데 관여하는 생체 내 필수 효소이다. 또한 당지질과 당단백질의 합성과 같은 다양한 대사 경로에도 관여하므로 이를 조절함으로써 대사 질환의 치료 가능성을 기대할 수 있다.
tyrosinase는 어떻게 만들어지는가?
멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소인 tyrosinase는 type Ⅰ membrane gly-coprotein으로(7) asparagine의 side chain에 있는 NH2기에 당을 붙이는 N-linked glycosylation 과정과 serine이나 threonine의 side chain에 있는 OH기에 당을 붙이는 O- linked glycosylation 과정(8) 중 N-linked glycosylation 과정에 의해 만들어진다. 단백질의 N-linked glycosylation은 endoplasmic reticulum(ER)에서 단백질 합성 번역과 함께 일어난다(9).
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